微生物蛋白提取和分离纯化

在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。

由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。

因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。

在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。

培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。

有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。

为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。

而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

2、接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。

由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。

微生物的分离纯化实验报告微生物的分离纯化实验报告引言：微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。

它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，对生态系统的平衡和物质循环起着重要作用。

微生物的分离纯化是微生物学研究的基础，通过分离纯化可以获得单一的微生物菌株，为后续的鉴定、培养和利用提供基础数据。

本实验旨在通过分离纯化微生物的方法，获得纯净的微生物菌株。

材料与方法：1. 实验材料：含有微生物的样品（如土壤、水样等）、琼脂平板培养基、无菌培养皿、无菌移液管、无菌匙、无菌培养管等。

2. 实验步骤：a. 取适量样品，加入适量的无菌生理盐水中，充分搅拌均匀。

b. 取一定体积的悬浮液，分别在琼脂平板上均匀涂布，避免重复涂布。

c. 将涂布好的琼脂平板培养基放置于恒温培养箱中，以适当温度孵育。

d. 孵育一段时间后，观察平板上的菌落情况，选择形态独特的单个菌落。

e. 用无菌匙将选中的菌落划取至无菌培养管中，加入适量的无菌生理盐水。

f. 将培养管中的菌液进行摇匀，称取一定体积的菌液，分别在琼脂平板上均匀涂布。

g. 重复以上步骤，直至获得纯净的微生物菌株。

结果与讨论：通过实验，我们成功地从样品中分离纯化了多个微生物菌株。

在观察菌落形态时，我们发现不同微生物菌株的菌落形态各异，有的呈圆形，有的呈不规则形状，有的呈乳白色，有的呈黄色等。

这些观察结果表明不同的微生物菌株具有不同的生长特性和代谢方式。

在分离纯化的过程中，我们注意到有些菌落会在培养基上形成菌落周围的透明区域，这是由于菌落分泌的溶解酶作用于琼脂平板中的胶原蛋白，导致胶原蛋白溶解而形成的。

这种现象被称为溶解圈，是一种常见的微生物特征，有助于鉴定微生物的溶解能力。

在实验过程中，我们还遇到了一些困难和挑战。

首先，样品中可能存在多种微生物，通过分离纯化的过程中需要进行多次的涂布和筛选，才能获得纯净的菌株。

其次，在涂布过程中需要注意避免交叉污染，以免影响结果的准确性。

微生物发酵产物的纯化与提取技术微生物发酵技术在生物医学和制药领域中具有重要地位，可以制备出多种生物活性产物，如抗生素、激素、酶、细胞因子和疫苗等。

这些产物广泛用于医疗、环保、农业和制造业等领域。

其中，微生物发酵产物的纯化和提取技术是制备过程中的重要环节，可以降低产品成本、提高产品质量和效益。

本文将介绍微生物发酵产物的纯化与提取技术及其应用。

一、微生物发酵产物的纯化技术1. 色谱法色谱法是一种基于样品分子在不同介质中的亲和性和相互作用力差异而分离纯化的方法。

包括大小分子筛法、离子交换法、亲和层析法、凝胶过滤法和气相色谱法等。

这些方法常用于制备高纯度、高效率的蛋白质、核酸、多糖和小分子化合物等。

2. 逆流式管柱法逆流式管柱法是一种通过透析膜和离子交换树脂对混合产物进行分离、纯化的方法。

该方法具有操作简单、高效率、高选择性和易于自动化的优点，适用于制备高纯度的生物活性物质。

3. 溶剂萃取法溶剂萃取法是一种基于样品分子在溶剂中的亲和性差异来分离产物的方法。

溶剂萃取法适用于对于可溶性较好、有机相和水相分配系数大的混合产物进行分离、纯化。

常用的溶剂有乙酸乙酯、苯、氯仿和正己醇等。

二、微生物发酵产物的提取技术1. 超声波提取法超声波提取法是一种通过超声波振荡原理来破坏细胞壁，并将目标产物提取至溶液中的方法。

该方法具有操作简单、高效率、无需使用有毒有害溶剂和耗时的传统提取方法的优点，适用于提取蛋白质、酶、多糖、黄酮类和生物碱等。

2. 溶菌酶提取法溶菌酶提取法是一种通过水解细菌细胞壁中的脂多糖骨架，将目标产物溶解出来的方法。

该方法具有选择性好、成本低、规模化生产能力强的优点，适用于提取抗生素、酶和蛋白质等。

3. 水萃取法水萃取法是一种基于植物纤维素和蛋白质等产物在水相中的亲和性和相互作用力差异而进行的提取方法。

水萃取法具有操作简单、效率高、物料成本低廉和对人体无毒无害的特点，适用于提取多糖、酶、黄酮类、生物碱和氨基酸等。

环境中微生物的检测和分离纯化一、实验目的：1.熟悉常用微生物培养基的配制方法。

2.学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。

3.用平板划线法和稀释法分离微生物。

4.认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。

二、实验原理：（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此，土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离和纯化。

常用的是平板分离法。

为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物。

再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌种。

（二）平板菌落计数法：平板菌落计数法是将样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。

此法缺陷：操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，测定结果易受多种因素的影响。

此法优点：可以获得活菌的信息，被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测。

三、实验材料和仪器：土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水。

取液器（5000ul、1000ul各一支），培养箱，培养皿（20个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5000ul、1000ul无菌吸头，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。

四、实验步骤：（一）培养基的制备（第二次实验时准备）：肉汤蛋白胨培养基：牛肉膏2g蛋白胨4gNaCl 2g蒸馏水400mL琼脂8g1. 称量：按上述配方称量各类物质。

实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。

本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。

获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。

单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。

实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。

2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。

3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。

4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。

蛋⽩质提取与纯化技术蛋⽩质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。

蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。

⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。

在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。

蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。

微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。

对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。

植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。

对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。

另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。

蛋⽩质的分离纯化⼀，蛋⽩质（包括酶）的提取⼤部分蛋⽩质都可溶于⽔、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋⽩质则溶于⼄醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采⽤不同溶剂提取分离和纯化蛋⽩质及酶。

（⼀）⽔溶液提取法稀盐和缓冲系统的⽔溶液对蛋⽩质稳定性好、溶解度⼤、是提取蛋⽩质最常⽤的溶剂，通常⽤量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋⽩质的溶解。

实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。

2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。

实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。

将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。

可根据R f 作为定性依据。

Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。

仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。

将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。

取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。

3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。

2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。

在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。

生物制药中的分离纯化技术生物制药是一种通过生物学过程生产的药物，利用微生物、植物和动物等生物系统生产出的生物制剂，在临床治疗中具有极高的价值。

但是，由于不同来源的生物制剂中含有大量的复杂成分，如蛋白质、核酸、多糖等，在生产的过程中需要通过分离纯化技术来提取所需的成分，从而达到纯化和提纯的目的。

一、生物制药的分离纯化技术概述生物制药的分离纯化技术是指通过化学、物理等方法对发酵产生的混合物进行处理，将所需的成分分离和纯化。

分离纯化技术主要包括：1. 溶液层析技术溶液层析是一种通过分子结构、大小、电荷等特性，通过静态或动态的方式，利用吸附剂将混合物中的不同化合物分离开的技术。

溶液层析广泛应用于蛋白质、核酸等大分子生物制品的分离和纯化中。

2. 凝胶过滤技术凝胶过滤是一种利用孔径大小分离分子的技术。

通过将混合物在凝胶柱中进行过滤，大分子会被阻挡在凝胶柱表面，而小分子则可以通过凝胶柱被洗脱。

凝胶过滤主要应用于分离纯化大分子的蛋白质、多肽和核酸等。

3. 离子交换层析技术离子交换层析是一种利用有机或无机离子交换体作为固定相，通过可控制的盐度梯度和pH值来分离混合物的不同成分的技术。

离子交换层析广泛应用于蛋白质、核酸等带电性物质的分离和纯化中。

4. 亲合层析技术亲合层析是一种通过将特定物质负载在固定相上，与混合物中的目标分子发生特异性结合，分离纯化目标分子的技术。

亲合层析一般应用于蛋白质、核酸等生物大分子结构的分离和纯化中。

以上四种分离纯化技术，在生物制药的分离纯化过程中经常使用。

不同的技术适用于不同的生物制品，生产过程会考虑到最终产品的纯度、产量以及经济成本等方面。

二、现代生物制药分离纯化技术的进展当前，随着现代生物技术的发展，生物制药的分离纯化技术也得到了不断的进步和完善。

新的技术和方法不断涌现，不仅可以提高生产效率，而且还可以提高产品的纯度和质量，降低产品的成本。

以下是一些新技术的介绍。

1. 前体蛋白纳米管系统前体蛋白纳米管系统是利用基因工程技术，将生物分子直接吸附在纳米管表面，从而实现分离的目的。