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分子克隆工具酶及其应PPT课件

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第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)

第二章 分子克隆工具酶(共73张PPT)

噬菌体T4DNA连接酶
噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为 60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性 末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌 DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶那么无 效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶 都不能催化两条游离的DNA链相连接。
2) 反响系统因素
缓冲液〔无菌、无污染〕 buffer 〔pH=8.0〕 ：
50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2
1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml
〔DDT：二硫苏糖醇 BSA： 牛血清蛋白)
NaCL〔0, 500, 1000mM〕
金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，假设以Mn2+代 替Mg2+〔如HindⅢ，ECORI〕那么特异性改
④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质 粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点〔识别切割位点为 G↓TCGAC〕，该位点也可被 AccⅠ〔识别切割位点为 GT↓MKAC〕和 HincⅡ〔识别切割位点为 GTY↓RAC〕切割。
(3) 同尾酶
有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些 酶称为同尾酶〔isocaudamer)
2.2 种类及作用机理
T4 DNA连接酶(ATP提供能量〕和大肠 杆菌DNA连接酶〔NAD+提供能量〕两 种。
大肠杆菌的DNA连接酶
大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。 对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍 具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反响形 成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促 进磷酸二酯键的形成。

《分子克隆中所用酶》PPT课件

《分子克隆中所用酶》PPT课件

识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
精品医学
2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
精品医学
3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
精品医学
15
E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
精品医学
16
recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end

分子克隆ppt课件

分子克隆ppt课件

精选ppt课件
22
重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
精选ppt课件
23
• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
精选ppt课件
8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
精选ppt课件
9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
精选ppt课件
27
精选ppt课件
28
LOGO
精选ppt课件
29
3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
精选ppt课件
5

分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件

分子克隆用酶基因与蛋白质工程课件
提取(尽可能大)
用限制性内切酶酶切DNA
凝胶电泳分开DNA片段
把DNA片段转移到滤膜上
利用标记的探针检测特定的DNA片段 （Southern 杂交）
结果分析。
图右表示了植物A叶绿体基因 组小部分DNA的限制图以及植 物 A 和 另 外 2 个 材 料 (B 和 C). 的RFlP形式．如果植物A与祖 先种相比变化很小，那么假 定它发生了2个突变．突变1， 在 13Kb 片 段 上 出 现 一 新 的 限 制 性 位 点 ， 产 生 9Kb 和 4Kb 的 片段．突变2，在形成植物C 的过程中，一个限制性位点 消失，产生11Kb片段，6Kb和 5Kb的消失．基于这一系列变 化，就可列出系统发育图(图 左).
II类限制性内切酶的切割 位点在识别序列中，有的在 对称轴处切割，产生平末端 DNA片段
有的切割位点在对称轴一侧， 产生带有单链突出末端的 DNA片段，称为粘性末端.
3、甲基化酶（Methylase） 与识别位点
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护 宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
2. 37℃水浴保温2-3小时，使酶切完全。 3. 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀以
停止反应，置于冰箱保存备用。 4. 取5-10l酶切液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
DNA片段和质粒载体的连接 及用酶
二、T4-DNA连接酶
带有非互补突出端的片段的连接
载体与DNA片段分别 用两种不同的限制性内 切酶进行消化可产生带 有非互补的粘性末端， 这也是最容易可克隆的 DNA片段。该种粘性末端 的连接载体DNA和外源 DNA的分子数比（浓度比 ）通常为为1:1。
6、限制性内切酶酶切实验步骤

分子克隆常用工具酶ppt课件

分子克隆常用工具酶ppt课件

;.
49
RNA聚合酶
催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶
;.
50
反转录酶(reverse transcriptase)
反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。
DNA末端转移酶 DNA terminal transferase
降解酶 S1 nuclease S1
主要功能 在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割
将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成 一个整体 通过向 3‘ 端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂 口，即5’→3‘ DNA 聚合酶活性与 3'→5'及5'→3'-外切酶活性 催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5'-OH末端上
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
;.
6
核酸水解酶类
核酸内切酶核酸 外切酶
核酸合成酶类
DNA聚合酶RNA聚合 酶DNA连接酶
核酸修饰酶类
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
;.
7
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
;.
24
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
;.
25
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端ppH值等，会使一些 核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*：AATT ；EcoRⅠ：GAATTC 必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条件。

第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件

第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件
5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’ ↑TATT
• I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子
5’- CTCTCTTAA↓GGTAGC -3’ ↑AATT
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
二、限制性内切酶的分类
• I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识 别位点至少1000 bp处随机切割 EcoB：TGA(N)8TGCT, EcoK: AAC(N)6GTGC
• II 型：识别特定序列并在识别位点处或 附近切割
• III 型：识别特定序列，切割位点在距识 别位点3’端25~27bp处随机切割 EcoP1：AGACC EcoP15：CAGCAG
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRN的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限
制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可
不同。
如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同
HpaI H
pa
/I
Haemophilus. Parainfluenzae

分子克隆工具酶_图文(精)

第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。

60年代末，70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等，才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作，故称这些酶为工具酶。

到目前为止，世界上发现的工具酶种类和数量繁多，现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）在重组DNA 技术中有重要地位，在此较详细介绍。

第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。

很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶，能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。

这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。

1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。

它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。

到目前为止，已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。

在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。

分子克隆工具酶-13级幻灯片

Байду номын сангаас
甲基化酶的种类 在E.coli中，大多数都有3个位点特异性的DNA甲基化酶
Dam甲基化酶
可在GATC序列中腺嘌呤N6位置上引入甲基
当需要在敏感位点上完全切割DNA时，可利用damE.coli扩增并提取DNA Dcm甲基化酶
识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C 的C5 位置上引入甲基
EcoKⅠ甲基化酶
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%) 三亚基双功能酶，分子量较大，反响需Mg2+、 ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点 Ⅱ型酶 (占90%以上) 分子量较小，反响只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称构造，切割位点在回文对 称构造上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端 Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%) 二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
同尾酶 可产生一样的黏性突出末端的酶统称为同尾酶。 同尾酶切割DNA得到的产物可进展互补连接。 EcoRⅠ： G↓AATTC Apo I: R↓AATTY Mfe I: C↓AATTC
稀切酶 有较长的识别序列和富含GC或AT的识别序列的限 制酶称为稀切酶。 在基因操作中使用稀切酶可以获得大的片段。
四、线性DNA末端对酶切的影响
DNA末端长度的影响 限制酶切割DNA时，识别序列两端必须有一定数量
的核苷酸，否那么难以发挥切割活性。
一般在识别序列末端有3 ~ 4个碱基对时能满足常
规的酶切需要。
位点偏爱(site preference) 某些限制酶对不同位置的同一识别序列表现出不同 的切割效率，这种现象称作位点偏爱。

第一章 分子克隆工具酶 基因工程 教学课件


CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
RE
CH3
与载体相连
RE 人工 接头
CH3 RE RE
CH3
第三节 DNA连接酶
一、DNA连接酶的特点
• DNA连接酶广泛存在于各种生物体内， 其催化的基本反应是：
3’-将ODHN共A价双结链合上形的成相3邻’-碱5’磷基酸的二5’-酯PO键4和
DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子或 环化单链DNA。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋 DNA骨架上的切口（nick）
• 限制酶反应条件：DNA（DNA的纯度与 甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、NaCl、Mg2+）、反应时间与温 度
• 限制酶星反应: 在变化的条件下，限制酶 识别序列特异性降低 EcoRI: GAATTC EcoRI*: AATT
七、其它特异性的限制酶
• Omega核酸酶（I-SceI） 由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子 编码，用于rRNA的剪切
AhaⅡ, FnuDⅡ, HhaⅠ
M.HpaⅡ
CmCGG
AhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠ
M.HphⅠ
TmCACC
HinfⅠ, HphⅠ, Sau3AⅠ
M.MspⅠ
mCCGG
BamHⅠ, MspⅠ
M.PstⅠ
CTGCmAG
AluⅠ, PstⅠ
M.TaqⅠ
TCGmA
AluI, AvaⅠ, EcoRV, HinCⅡ, HinfⅠ,
3. 甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因时，可先使DNA分子部分甲基化，然
后再用限制酶切

基因工程中工具酶.限制酶的应用ppt课件

1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
徐师大-屈艾老师制作
.
7
l
徐师大-屈艾老师制作
.
8
徐师大-屈艾老师制作
.
9
二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性
I型
（7项）
II型
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
徐师大-屈艾老师制作
.
22
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3’-OH的单链粘性末端
5'-CTGCA G-3,
5’-CTGCA-OH-3’
P-G-3，
3'-G ACGTC-5，
3'-G -P + ‘3- HO-ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端
5'-G |AATTC-3’ 3'-CTTAA| G-5’
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
徐师大-屈艾老师制作
3 种 不 同 的 单链多肽 亚基
.
2种不同的 亚基
10
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少 1000bp 的 地方可能随 机地切割
寄主特异性 的位点
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶 的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。
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５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 2021/3/7 3’-CTTAAG-5’
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制
酶谱。
2021/3/7
4
二 . 限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction
modification and specificity）位于染色体上，三
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分
子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种
末端2可021/以3/7 相互连接。
10
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
七. 1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
2302.1/3星/7 反应的利用和避免
分子克隆工具酶及其应用
2021/3/7
1
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：2M021n/+3+/7代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
11
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5, 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ

2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
5’-GOH 3’-CTTAAP
PAATHTOGC--538’’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制
酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
Hi2n02d1/3Ⅲ/7 —Haemophilus influensae d Ⅲ
6
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组
分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率
只有1/16。
BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不 能为两种酶所识别和酶切。
个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、
SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.
coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基
因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具
化、检测等。
2021/3/7
2
第一节
限制性内切核酸酶
2021/3/7
3
一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I 型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血 杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
CCGGN’N’N’N’N’CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突
起
２2021）/3/7 富含ＧＣ
7
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
2021/3/7
9
５）相容性末端
如：BamHI
G GATCC
BglII
A GATCT
MboI, Sau3AI N GATCN
有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于
基20因21/3/工7 程中。
5
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；
狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、
菌系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种
名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型