第二章：分子克隆的工具酶.

第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。

第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。

核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。

限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。

1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。

保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。

限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。

由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。

2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。

2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。

o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。

o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。

这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。

o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。

常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。

表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。

第二章分子克隆工具酶一、选择题1.有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。

调整这些酶切位点的数量，主要通过（）。

A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切二、填空题1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端，则可以用__________进行3‟末端标记。

如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3‟末端标记。

2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。

三、判断题1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。

pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。

同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（）四、名词解释1. DNA聚合酶2. 限制性内切酶3. 甲基化酶4. T4-DNA连接酶5. 核酸酶6. Klenow酶7. T4 DNA聚合酶8. Taq DNA聚合酶9. 逆转录酶10. 同裂酶11. 核酶五、简答题1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？3.简述Klenow聚合酶的用途。

4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。

5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓，限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。

在质粒上有酶I 的1个切点，在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。

用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。

第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。

基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。

基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。

第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。

从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。

基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。

基因工程的理论基础：⑴. 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。

⑵. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。

⑶. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。

(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。

自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：⑴. DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的开始）。

⑵. 克隆载体的发展与应用。

⑶. 大肠杆菌转化体系的建立。

⑷. 琼脂糖电泳技术的应用。

⑸. DNA测序技术的应用。

⑹. 核酸杂交技术的应用。

第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。

双链结构的核酸内切酶。

到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。

种以上不同的核酸内切限制酶。

核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。

型限制酶。

2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

表示分离到的第三个限制酶。

Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。

基因工程原理作业及答案第一章绪论1、请谈谈它的基本步骤？①源DNA 片段与载体连接论和技术两个方面谈谈础？稳定地繁殖。

理论基础：①在40因的分子载体是DNA 传的物质基础问题；②在50递的问题；③在50技术基础：①60年代-70接酶解决了对DNA ④60移杂交技术对DNA 3、基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概念及其相互联系。

基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。

基因工程：是通过基因操作，将目的基因或DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因重组：不同来源DNA 分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA 分子的过程。

2、哪些酶可用于DNA 片段的末端标记？Klenow DNA 聚合酶和T4或T7DNA 聚合酶在对DNA 片段进行末端补平反应或末端的置换反应时可引入标记的核苷酸。

3、DNA 聚合酶有哪些类型，各有什么活性？① E.coliDNApolI：5’-3’DNA 聚合酶活性；5’-3’DNA 外切酶活性；3’-5’DNA 外切酶活性。

心相印图文工作室整理luqiu910② E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：5′→3′DNA聚合酶活性；3′→5′DNA外切酶活性；5’-3’DNA外切酶活性。

③T4噬菌体DNApol：5′→3′DNA聚合酶活性（与Ｋlenow酶相似）；3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×200）：在无dNTP时只有该活性。

（常用于填平dsDNA的3′缩进末端及水解dsDNA的3′突出末端。

）④T7噬菌体DNApol酶活性;1000）。