第三章 分子克隆工具酶
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作者:吴乃虎出版社:高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作(gene manipulation):指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中,常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶(Restriction endonuclease)又称限制酶,是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片,而不会破坏DNA的结构。
因此,限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中,限制酶通常用于切割DNA的特定序列,以获得所需的DNA片段。
同时,也可以用于制备载体DNA的端部修饰,方便插入外来DNA片段。
此外,限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶(DNA ligase)是一种催化DNA连结软帽酶,用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中,DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外,为了克隆具有完整DNA序列的目标基因,连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中,通过PCR酶催化下的DNA扩增反应,能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中,PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术,可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位,为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶(T4 DNA ligase)是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中,接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中,外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
第二章分子克隆工具酶DNA 重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。
60年代末,70年代初科学家们陆续发现了DNA 连接酶、T4DNA 连接酶、Ⅱ型限制性核酸内切酶Hin fI 和Eco RI、反转录酶等,才使他们能对DNA 分子进行剪切、连接等基因操作,故称这些酶为工具酶。
到目前为止,世界上发现的工具酶种类和数量繁多,现将重组DNA 分子技术中常的工具酶简介如下。
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)在重组DNA 技术中有重要地位,在此较详细介绍。
第一节限制性核酸内切酶核酸酶可分为两类:核酸外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始,一个接一个把核苷酸水解下来;核酸内切酶(endonuclease则从核酸链中间水解3’,5’磷酸二酯键,将核酸链切断。
很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解,1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。
这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
1.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease1.1.1 限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA 双链结构的核酸水解酶。
它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
到目前为止,已经分离出可识别230种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300种以上。
在限制性核酸内切酶作用下,侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段,而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化,在此修饰酶的保护下,则可免受限制性核酸内切酶的降解。