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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较
作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院)
刊名：
中国药师
英文刊名：CHINA PHARMACIST
年，卷(期)：2011,14(3)
参考文献(5条)
1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03)
2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01)
3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04)
4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01)
5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24)
本文读者也读过(1条)
1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4)
本文链接：https://www.doczj.com/doc/5a11631098.html,/Periodical_zgys201103012.aspx
微粒体制备 一、工作原理 微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法. 二、实验准备 以制备肝微粒体为例： 1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。 2、试剂：冰生理盐水 PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。 含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤
肝脏P450还原酶特异性敲除小鼠模型在毒理学中的应用1 Application of Liver-specific Cytochrome P450 Reductase knockout mice in Toxicology 肖瑛，武元峰，薛翔，顾军，任进* Xiao Ying, Wu Yuanfeng, Xue Xiang, Gu Jun, Ren Jin 中国科学院上海药物研究所，新药研究国家重点实验室,上海201203 State Key Laboratory for New Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 201203 关键词: NADPH-细胞色素P450酶还原酶，基因敲除，器官毒性 Key Word: NADPH-P450 Cytochrome Reductase, Knockout, Organ Toxicity 1.引言 微粒体细胞色素P450单加氧酶（P450，CYP）在内源与外源性化合物的生物转化中起着重要的作用。P450酶蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢。P450酶的功能与生物学作用的重要性，使其研究具有广阔的应用前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内外源性化合物尤其是药物的代谢，对于药物的研究和开发也有重要的意义。由于P450酶系的生物学重要性，自其发现以来，该酶系的研究一直是药理学和毒理学中一个十分引人注目的领域。 P450酶基因的多态性使其有多种亚型且多具有类似的功能和相似的组织分布特征，使在一个特异组织中很难去区别单个P450酶亚型的功能。目前已有多个P450酶亚型敲除（knockout，KO）小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用[[1]]。然而这些KO模 1基金项目：国家重点基础研究发展计划973项目（编号：2006CB504700） 作者简介：肖瑛（1981-），女，博士研究生，研究方向为药物毒理学。 *通讯作者：任进，Email: CDSER_SIMM@mail. https://www.doczj.com/doc/5a11631098.html, Tel & Fax：（021）50806600-2207
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备 大鼠肝微粒体制备全过程： 1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：0055706 2．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg2kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并 固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土 黄色。 3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。 4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。 5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。 6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。 7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。 8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应 后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同 样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓 度。 9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3?0.5 mg/mL，取两份肝微 粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加 入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。 CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1) 其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。 实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定 一、目的要求
牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响 目的观察牛磺酸對四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响，探讨其作用机制。方法采用四氯化碳复合法制备肝硬化门静脉高压大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和牛磺酸低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物灌胃。治疗4周后，生化分析仪测定大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）含量；ELISA测定大鼠血清肝纤4项[Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）]含量以及肝组织羟脯氨酸（HYP）水平；血流动力学法测定大鼠门静脉压（PVP）、门静脉血流量（PVF）、平均动脉压（MAP）并测定心率（HR）；硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量，化学比色法测定内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，放射免疫法测定环鸟苷酸（cGMP），紫外-可见分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；HE染色观察大鼠肝组织病理形态。结果与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠血清ALT、AST和TBIL含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），CⅣ、PC Ⅲ、HA及HYP含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高剂量组LN含量显著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠PVP、PVF显著降低（P＜0.05），牛磺酸高剂量组MAP显著升高且HR显著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织NO含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高剂量组eNOS活性、cGMP含量显著升高（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性显著升高且MDA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；牛磺酸各剂量组大鼠肝组织病变明显改善，其中牛磺酸高剂量组效果最为显著。结论牛磺酸对肝硬化门静脉高压大鼠具有抑制作用，其机制可能与牛磺酸保肝降酶，抑制氧化应激损伤，上调eNOS表达、提高NO含量，改善肝功能有关。 Abstract：Objective To investigate the effects of taurine on rats with CCl4-induced portal hypertension；To discuss its mechanism of action. Methods CCl4 compound method was used to prepare portal hypertension rat models. Experimental rats were randomly divided into normal group，model group，positive medicine group and low-，medium- and high-dose taurine groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. After four-week treatment，biochemical analyzer was used to detect the contents of ALT，AST and TBIL；ELISA was used to detect the contents of CⅣ，PCⅢ，LN，HA and the level of HYP in serum；hemodynamic method was used to detect PVP，PVF，MAP and HR；nitrate reduction method was used to detect the contents of NO，chemical colorimetry was used to detect the activity of eNOS，hepatic tissue；the activity of SOD，GSH-Px and the content of MDA in hepatic tissue；HE staining was used to observe the histopathological changes of the hepatic tissue. Results Compared with the model group，the contents of ALT，AST and TBIL in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly （P＜0.05，P＜0.01）；the contents of CⅣ，PCⅢ，HA and HYP in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly，and LN in high-dose taurine group decreased significantly （P＜0.05，P＜0.01）；the PVP，PVF in medium- and high-dose taurine groups
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定 1 实验目的 本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。 2 实验原理 研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。 细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。 3 实验材料 3.1实验动物 大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h） 3.2实验器材与试剂 器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等 试剂：1.17% KCl 溶液 Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g； 水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml 4.实验方法 4.1动物处理与匀浆制备 断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆
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3种方法测定大鼠肝微粒体蛋白含量的比较 作者：简暾昱， 徐帆， 廖春龙， 徐贵丽， Jian Tunyu， Xu Fan， Liao Chunlong， Xu Guili 作者单位：简暾昱,Jian Tunyu(昆明医学院成都军区昆明总医院第一临床学院,昆明,650032)， 徐帆,徐贵丽,Xu Fan,Xu Guili(成都军区昆明总医院)， 廖春龙,Liao Chunlong(大理学院) 刊名： 中国药师 英文刊名：CHINA PHARMACIST 年，卷(期)：2011,14(3) 参考文献(5条) 1.金科涛;王宇光;徐彭HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[期刊论文]-药物分析杂志 2006(03) 2.孙忠实;朱珠药物代谢性相互作用研究进展 2000(01) 3.李海玲;彭书明;李凛4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志 2008(04) 4.许家喜蛋白质的检测方法与乳制晶中蛋白含量测定[期刊论文]-大学化学 2009(01) 5.Cinti DL;Moldeua P;Schenkman JB Kinetic parametera of drug-metabolizing enzymes in Ca2+-sedimented microsomea from rat liver[外文期刊] 1972(24) 本文读者也读过(1条) 1.LI Hai-ling.彭书明.LI Lin.张雪梅.LI Hai-ling.PENG Shu-ming.LI Lin.ZHANG Xue-mei4种常用蛋白浓度测定方法的比较[期刊论文]-中国生化药物杂志2008,29(4) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/5a11631098.html,/Periodical_zgys201103012.aspx
代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。由此，代谢稳定性研究常作为早 期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。目前常用 于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针 对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是 什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数 据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下 文将带着这些疑问进行阐述。 1 肝微粒体与肝细胞的差别 要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、
OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。 (摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies in Drug Design and Development》一书)
实验五大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定 姓名：任妮 2011302110100 摘要：目的：研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法，掌握用考马斯亮蓝的方法测定蛋白质的含量。方法：通过使用80mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行诱导（连续3～5d），停止给药后24h采样（无菌取出肝脏），制备肝匀浆，9000g速度0～4℃低温环境下离心，取出上清液（S9组分），最后加入考马斯亮蓝染色液，测定OD595nm值。通过不同浓度的标准蛋白溶液来建立标准蛋白的标准曲线，根据肝S9组分的OD595nm值计算出样品中蛋白质浓度。结果：本实验建立的标准曲线方程为y=0.0062x-0.045，相关系数为0.9887,相关性较好。测得肝S9组分样品蛋白的浓度为25.04mg/ml。结论：苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9. 关键词：肝S9；蛋白质含量；考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 前言：许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9是许多体外实验常用的体外活化系统,其主要有效成分为混合功能氧化酶( MPO)系统,其中许多酶共同组成电子传递体系,其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用,具有活化氧分子和与底物结合的双重功能。CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用,苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂,能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素。因此,本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂,制备S9,并采用考马斯亮蓝法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法。 蛋白质浓度的测定有许多方法，本次试验采用的是考马斯亮蓝染色法（Bradford法），该方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝染色法原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。 1 实验材料 1.1实验动物
摘要：本文采用石蜡永久制片和光学显微摄像的方法对经过环磷酰胺处理过的小鼠肝脏的显微结构进行了研究，分析环磷酰胺对小鼠肝脏的显微结构产生的影响。结果表明，一定剂量的环磷酰胺对肝脏具有损伤作用。 关键词：小鼠肝脏石蜡切片 环磷酰胺( Cyclophosphamide, Cp) 是人工合成的氮芥类烷化剂。可以抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞，可以作为细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，被广泛用于治疗急慢性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等；但同时可以引起剂量依赖性肝损伤的副作用——原因可能是环磷酰胺主要代谢物丙烯对肝脏有毒副作用，能引起肝细胞坏死，肝小叶中心充血，同时伴有氨基转移酶含量升高的现象。 1 材料与仪器 1.1 实验材料 小白鼠 1.2 实验仪器： 镊子、毛笔、蜡杯、溶蜡箱、酒精灯、切片机、载玻片、盖玻片、染色缸、光学显微镜。1.3 试剂： 中性福尔马林固定液、各浓度酒精、二甲苯、石蜡、伊红染液、苏木精染液、加拿大树胶 2 实验方法 2.1 取材 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，小白鼠瞬间死亡。取肝组织。 2.2 固定 将小鼠肝脏块投入中性福尔马林固定液中固定。 2.3 脱水 将组织经各浓度酒精各1 h，95%、100% 的酒精各两次，每次30 min。 2.4 透明 将组织块置于酒精二甲苯混合液中15 min，再将组织块置于二甲苯中透明两次，每次10 min。最后将组织块置于二甲苯石蜡混合液中20 min。
2.5 透蜡 将组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，共三次，前两次45 min，第三次 30 min。 2.6 包埋 向纸盒中倒入少许石蜡，将组织块用镊子夹取到纸盒中，放入盛有冷水的盆中使其凝固。2.7 切片 右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，当切成的蜡带到一定长度时，将蜡带放在纸上。 2.8 贴片、展片 选取蜡带放置在载玻片上。将载玻片放置在机器上进行展片，待蜡带完全展开时将载玻片拿下，放入盒内。 2.9 脱蜡复水 将石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡 20 min，二甲苯Ⅱ脱蜡 10 min，然后放入各级酒精溶液中各2 min，蒸馏水中2 min。 2.10染色 将石蜡切片在苏木精染液中浸40min，然后蒸馏水涮洗几次至发蓝（约2min），镜检。 2.11 脱水Ⅰ、复染、脱水Ⅱ 将镜检合格的石蜡切片依次在各级酒精中浸2min，再在伊红水溶液浸二十至三十秒，再依次在95%、纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ中各浸 3 min。 2.12 透明 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3 min。 2.13封藏：中性树胶封存 将载玻片取出，在切片中央滴一滴树胶，用镊子盖上盖玻片。 3 小鼠肝脏石蜡切片观察 见下图：
喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定 刘兆颖，陈冬梅，袁宗辉 华中农业大学国家兽药残留基准实验室 喹乙醇（olaquindox），又名倍育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，能促进动物生长，提高饲料转化率，具有广谱抗菌作用，可以预防猪的大肠杆菌和痢疾。但由喹乙醇具有生殖毒性、致突变性和光毒性，因被禁止或限制使用。 目前国内外对喹乙醇的代谢研究很少，Spierenbur等（1988）用HPLC检出了猪胃肠道中喹乙醇的三种还原代谢物，即N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇。JECFA报道猪口服喹乙醇(2mg/kg b.w)后，24h内就消除了药量的90%，其中70%是以原形从尿液中排出，血浆最大浓度出现时间是1-2h，表明喹乙醇吸收快，消除也快。给药2天后，检测组织中的放射性，发现肝脏和肾脏分别残留52和110μg/kg，肌肉为9μg/kg，。尿液中存在N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇和三种羧酸衍生物，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）在体内消除缓慢，因而被规定为肝肾组织的残留标识物。因此为了更好地了解喹乙醇的代谢特征，本文先用体外代谢方法对其代谢进行研究。 肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。肝微粒体体外温孵法与其他的体外肝代谢方法相比，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。本文就用大鼠肝微粒体来研究喹乙醇的体外代谢，对其代谢产物的鉴定就用高灵敏度、高质量精度和多级质谱的LCMS-IT-TOF联用技术，首次发现了一些没报道的新代谢产物，完善了喹乙醇的代谢途径，为喹乙醇的毒性研究和残留监控提供了重要的指导意义；同时，为喹噁啉类其它药物的代谢研究提供了重要的参考价值。 1. 实验材料 1.1标准品及标准溶液配制 喹乙醇，含量99.8%，中国兽医药品检查所，批号H050204； 喹乙醇储备液：准确称取26.3mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用少量超纯水溶解，再用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存； 脱二氧喹乙醇，含量98%以上，华中农业大学兽药研究所合成，批号20050831； 脱二氧喹乙醇标准储备液：准确称取23.2mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存。 1.2试验动物 7周龄Whister雄性大鼠，体重167g-185g，购自湖北疾病预防控制中心实验动物房。实验前禁食12h，期间自由饮水。 1.3试验仪器和设备 电子天平，感量0.000001g，日本SHIMADZU公司； 隔水式电热恒温培养箱，303AS-3型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；
CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型 肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积，不是一个独立的疾病，是许多慢性肝病共同的病理过程，几乎各种慢性肝病（化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性，以及胆汁淤积性）都可以导致肝纤维化。 CCl4是诱导实验动物产生肝纤维化和肝硬化最广泛使用的化学性肝毒物。在肝细胞内质网中，经肝微粒体内依赖于细胞色素P450 的具有混合功能的氧化酶激活后，CCl4产生了自由CCl3·及Cl，它们与肝细胞内大分子发生共价结合，可攻击膜不饱和脂质，引发活性氧自由基的产生和脂质过氧化，损伤肝细胞，从而导致狄氏间隙内原本静止的贮脂细胞活化，释放出Ⅳ型胶原酶，降解Ⅳ型胶原。同时该细胞由合成分泌Ⅲ型胶原改为合成分泌I 型胶原，取代了Ⅳ型胶原，促使肝脏纤维化 1.实验动物 SPF级BablC小鼠，健康，雄性，体重为18g-20g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 6W 4.主要试剂 CCl4（上海国药集团） 5.建模方法 按5ml/kg 体重皮下注射体积分数为20% CCl4的油剂溶液（CCl4：橄榄油=1:4）, 每3天1次，连续6W。对照组动物皮下注射等量等次的橄榄油溶剂。正常饮食饲养，观察动物活动、精神状况和饮食量,实验前后称量小鼠体重。 完成持续给药6W后，称体重，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80℃冰箱冻存。同时取肝左叶组织1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋；其余肝组织液氮冷冻-80℃保存。 6.模型评价
小鼠肝细胞原代培养
小鼠肝细胞原代培养 实验目的： 1.了解并掌握原代细胞培养的相关原理 2.了解并掌握小鼠肝细胞原代培养的方法 实验器材： 二氧化碳培养箱、光学显微镜、无菌操作台、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿、烧杯、镊子、酒精棉、离心管、电动移液器、移液管、细胞计数板、幼鼠、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.125％胰蛋白酶（含0.1%胶原酶）、D-Hanks或者PBS等。
原代培养是从供体中取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织或细胞培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的组织或者细胞的生物学特性没有发生很大变化，仍具有二倍体遗传物质，最接近和反映体内生长特性，很适合作药物测试、基因表达测试、细胞分化等实验研究。 原代培养是获取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种成分组成，比较复杂，即使同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。因而原代细胞的部分生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需要对原代培养的细胞进行短期传代后再进行（需要注意的是有些细胞在传代后可能会发生一些生物学特性的变化）。一般采用2-5代的细胞进行实验。当然特殊情况和一些终端分化细胞如神经细胞、巨噬细胞、心肌细胞除外。
原代培养的方法很多，最基本和最常用的为组织块原代培养法和离散细胞原代培养法（消化法）。 组织块原代培养： 组织块原代培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织，组织块原代培养法操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。 组织块培养的程序一般为： 1.组织块修整：将组织块用平衡缓冲液反复冲洗，然后在灭菌的培养 皿中剪碎至碎块的直径小于1mm3。 2.贴壁：将组织块间隔（小块之间的间隔为1cm）放在培养皿中，培 养基需要浸没组织块底部但不能使组织块浮起。 3.培养：通过生长繁殖，细胞可以从组织块边缘向四周游出，最终生 长繁殖连成片，原组织块可以完全消失。
人肝微粒体的提取及其含量测定 第一部分：人肝微粒体的提取 一、仪器及试剂： 仪器：内切式匀浆机，高速离心机，超速离心机，表面皿数个，冰袋数个，碎冰，装碎冰烧杯，匀浆用玻璃管，不锈钢剪刀 试剂：含0.15M KCl的100mM磷酸钾缓冲液（PH＝7.4）,100mM磷酸钾缓冲液 材料：8号人肝（称取重量29.95g） 二、实验流程： 组织（记录死亡时间、储运条件） 37度水浴解冻 含0.15 M KCl 的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）漂洗，除去表面血迹及组织液（缓冲液事先已置于冰箱中冷藏） 将组织置于下垫冰块的表面皿中，用剪刀手动剪碎 内切式均浆机匀浆（过程中注意将组织置于冰块包围住，保持低温环境） 9000 ×g离心20 min，取上清，即得S9 超速离心机105,000 ×g 超速离心60 min 取沉淀（过程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，应用吸管将油膜慢慢吸出，而不能倾倒） 重悬于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中（重悬过程中应注意不要产生气泡） 105,000 ×g 超速离心60 min 取沉淀，用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）重悬得微粒体（此次重悬时应使用尽量少的缓冲盐体积，以防止微粒体浓度被过于稀释，重悬过程同样注意油膜与气泡） 磷酸盐缓冲液中，分装塑料小管中，-80°C贮存
三、实验结果： 一共称取8号人肝组织29.95g，提取出肝微粒体23mL，经蛋白含量测定，微粒体二次重悬液蛋白含量以牛血清白蛋白计为37.4mg/mL，加入100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释至86mL，得10mg/mL的微粒体储备液，分装保存于-80度待用。 第二部分微粒体中蛋白含量测定 一、仪器和材料： 0.1 N NaOH(2g NaOH溶于500mL水), 1%酒石酸钾（1.342g四水合酒石酸钾溶于100mL 水），2 %无水碳酸钠（溶剂为0.1 N NaOH），0.5 %硫酸酮（溶剂为1%酒石酸钾），甲液（2 %无水碳酸钠50 ml，加0.5 %硫酸酮1 ml，混匀，临用时现配），牛血清蛋白标准液500 μg / ml(溶剂为0.1 N NaOH) Folin酚(福林试剂)试剂：1份Folin酚原液用蒸馏水稀释3倍得工作液，Folin酚试剂原液配制方法如下： 1000mL磨口回流装置内,加入 钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 50 g 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 12.5 g 蒸馏水350 mL 85%磷酸25 mL 浓盐酸50 mL 文火回流10h。取去冷凝器,加入 硫酸锂(Li2SO4) 25 g 蒸馏水50 mL 混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿 色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。 冷却后,定容至500mL, 混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。 二、实验方法： 1、测定原理： 利用Folin酚试剂与蛋白质的酪氨酸与色氨酸残基反应在680nm处产生吸收 2、实验过程： 1）样品测定：