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微粒体制备一、工作原理微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。
它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。
肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。
取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。
因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。
微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。
肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法.二、实验准备以制备肝微粒体为例：1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。
2、试剂：冰生理盐水PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。
肝微粒体的制备肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，其具有多种生物合成和代谢功能。
为了研究肝微粒体的结构和功能，科学家们开展了一系列的制备方法。
肝微粒体的制备方法主要包括离心法、差速离心法和梯度离心法。
离心法是最常用的制备方法之一。
首先需要从动物或人体中提取肝脏组织，然后将组织切碎并加入缓冲液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过不同离心速度和离心时间的调节，可以分离出肝微粒体。
差速离心法是离心法的一种改进方法。
该方法利用不同细胞器的密度差异，通过多次离心来进一步分离纯净的肝微粒体。
首先，将组织切碎并加入缓冲液进行离心，得到一个粗制的肝微粒体上清液。
然后，将上清液进行再离心，获得更纯净的肝微粒体。
通过多次离心，可以得到更高纯度的微粒体。
梯度离心法是一种更为精细的制备方法。
该方法利用不同密度的梯度溶液，通过离心使得细胞器分层。
首先，制备不同浓度的梯度溶液，然后将组织切碎并加入梯度溶液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过调节离心速度和时间，可以分离出纯净的肝微粒体。
肝微粒体的制备方法选择取决于研究的目的和需要。
离心法简单易行，适用于初步的制备。
差速离心法和梯度离心法需要更多的技术和设备支持，但可以得到更高纯度的肝微粒体。
在肝微粒体的制备过程中，需要注意以下几点。
首先，组织的采集和处理需要在低温和无氧条件下进行，以保持微粒体的完整性和活性。
其次，离心速度和时间的选择应根据具体实验要求进行调整，以获得最佳的分离效果。
此外，在制备过程中，需要注意避免污染和交叉感染，以确保实验结果的准确性和可靠性。
肝微粒体的制备是研究肝细胞生物学和代谢过程的重要工具。
离心法、差速离心法和梯度离心法是常用的制备方法，选择适合的方法可以得到纯净的肝微粒体。
在实验过程中，需要注意操作技巧和实验条件的控制，以确保制备的微粒体质量和纯度。
通过这些制备方法，科学家们可以更深入地研究肝微粒体的结构和功能，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定1 实验目的本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。
细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。
根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料3.1实验动物大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）3.2实验器材与试剂器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等试剂：1.17% KCl 溶液Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml4.实验方法4.1动物处理与匀浆制备断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。
肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液即为线粒体后上清液。
大鼠肝微粒体的制备：
大鼠实验前禁食16 h，不禁水。
实验前股静脉放血处死，立即打开腹腔。
取出肝脏用冰冷的0.1 mol/L PBS 溶液（pH 7.4）漂洗后，用滤纸吸干，称大鼠肝脏湿重。
加入0.1 mol/L PBS 溶液（pH 7.4），将肝脏剪碎（1 g 肝用3 mL PBS 溶液），并在冰浴中用玻璃匀浆管匀浆至粉红色糊状。
将肝匀浆液于9,000 g，4℃冷冻高速离心25 min，取上清于105,000 g，4℃冷冻超速离心60 min；沉淀即为大鼠肝微粒体，将沉淀于含20%甘油的0.1 mol/L PBS 溶液（pH 7.4）中悬浮，－80℃冰箱中保存待用。
采用考马斯亮蓝染料结合比色法测定所制备大鼠肝微粒体的蛋白含量。
（试验所用PBS 溶液在使用前均置于冰水浴中预冷。
）。
中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理中国药科大学药物代谢动力学实验考查知识点整理药物代谢动力学实验考查知识点整理第一部分：HPLC使用注意事项1、HPLC组成：泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪2、反相色谱：分离机理：“反相色谱”固定相极性小于流动相极性常用流动相：乙腈、甲醇，水 3、色谱柱的分类：按填料：球形、无定形按含碳量：C18、C8按应用：分析柱、制备柱、预处理柱按粒径：150mm*,5μm等按填料类型：正相柱、反相柱、手性柱 4、键合相色谱柱的优缺点：优点：稳定不易流失；应用广泛，可使用多种溶剂；消除硅羟基的不良影响；缺点：pH得在3~8范围内5、C18柱的活化：90% 10% 90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗30min6、流动相：使用之前需超声脱气目的：色谱泵输液准确提高检测性能保护色谱柱流动相脱气的方法：加热，抽真空，超声，通惰性气体流动相组成：流动相配置：缓冲溶液现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生变化和成分分解，影响色谱分离的效果；有机溶液和缓冲液使用前均需经μm微孔滤膜过滤；流动相使用前脱气。
7、常用定量方法：外标法内标法内标物的要求：化学结构与待测品相似；样品中不存在；不与样品组分发生化学反应；保留值与待测值接近；浓度相当；与其他色谱峰分离好8、样品的预处理：目的：除杂质；浓缩微量成分；改善分离；保护色谱柱；提高检测灵敏度方法：高速离心，过滤，选择性沉淀，衍生反应；液固萃取、液液萃取沉淀蛋白的溶剂：有机溶剂：乙腈、甲醇强酸：三氯乙酸、过氯酸盐：50%硫酸铵、10%TCA 分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水第二部分：实验设计1、考虑问题：动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度大概范围2、分析方法建立：色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方法、风量下限与标曲范围第三部分：实验相关条件与数据处理实验一：1、采血点设计一般原则为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相和消除相。
肝微粒体制备1. 简介肝微粒体（mitochondria）是细胞中的一种细胞器，主要负责细胞内能量的产生和调节。
肝微粒体制备是一种常用的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
本文将介绍肝微粒体制备的步骤和相关实验方法。
2. 肝微粒体制备步骤2.1 器材准备•洗涤缓冲液：含有0.25 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA 和0.1% BSA的缓冲液。
•离心管：用于离心过程。
•显微镜滑片：用于观察制备得到的肝微粒体。
2.2 肝脏取材•将新鲜动物（如小鼠）的肝脏取出，并放入冰冻盒中保持低温。
•快速切碎肝脏组织，以避免氧化酶的活性降低。
2.3 组织匀浆•将切碎后的肝脏组织加入洗涤缓冲液中。
•使用均质机将组织匀浆，以破碎细胞膜和释放肝微粒体。
2.4 离心分离•将匀浆后的混合液离心10分钟，以去除未破碎的细胞碎片和细胞核。
•将上清液转移到新的离心管中，并进行第二次离心，以沉淀肝微粒体。
2.5 肝微粒体收集•将离心得到的沉淀用洗涤缓冲液悬浮。
•用洗涤缓冲液洗涤肝微粒体，以去除杂质。
•最后一次离心后，将上清液倒掉，保留沉淀中的肝微粒体。
3. 肝微粒体制备相关实验方法3.1 蛋白含量测定•使用Bradford方法或BCA方法测定制备得到的肝微粒体中蛋白质的含量。
•根据实验需要调整蛋白质的浓度。
3.2 肝微粒体功能检测•使用荧光探针（如JC-1）检测肝微粒体的膜电位。
•使用呼吸链底物（如琥珀酸、NADH）测定肝微粒体的呼吸功能。
3.3 肝微粒体结构观察•使用透射电子显微镜观察制备得到的肝微粒体的形态和结构。
•准备样品时要注意避免溶剂残留和样品的干燥。
4. 结论肝微粒体制备是一种重要的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
通过合理的步骤和实验方法，可以成功制备得到高质量的肝微粒体，并进一步开展相关实验研究。
了解肝微粒体的制备过程对于深入理解细胞内能量代谢和调节机制具有重要意义。
肝微粒体的制备2篇肝微粒体的制备（一）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）是存在于肝细胞内的细胞器，其主要功能是参与能量代谢和细胞呼吸。
肝微粒体的制备主要通过离心分离的方法实现。
首先，需要准备一定数量的新鲜肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏应在动物安乐死后立即取出，并放入生理盐水中进行冲洗，以去除任何附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并用冰冷的缓冲液洗涤，以进一步清除血液。
接下来，使用钝性杆或刀片将肝组织切成更小的块。
这样做的目的是增加细胞器的表面积，以便更好地制备微粒体。
然后，将这些组织块置于含有细胞质破碎缓冲液（常用的缓冲液为MES缓冲液）的离心管中，经过适当的研磨和振荡，使细胞质破碎，释放出细胞器。
接下来，将细胞质悬液用离心机进行离心分离。
首先进行低速离心，以去除细胞核和细胞碎片，得到一个大部分富含肝微粒体的上清液。
然后，将上清液继续进行高速离心，将肝微粒体沉淀。
离心结束后，将上清液倒掉，得到肝微粒体的沉淀。
最后，可以用适当的缓冲液洗涤肝微粒体沉淀，以去除杂质。
洗涤后，将肝微粒体沉淀进行储存或进一步使用。
制备好的肝微粒体可以用于细胞呼吸和能量代谢的研究。
肝微粒体的制备（二）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）的制备是一项重要的技术，常用于研究肝细胞能量代谢和细胞呼吸等领域。
下面介绍一种常用的肝微粒体制备方法。
首先，准备新鲜的肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏取出后立即放入冰冷的生理盐水中冲洗，以去除附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并加入冰冷的细胞质破碎缓冲液（如MES 缓冲液）中。
接下来，使用均质器或超声处理器对肝组织进行细胞质破碎。
通过适当的处理时间和功率，使细胞质完全破碎释放出肝微粒体。
破碎后的细胞质悬液可以通过低速离心去除细胞核和细胞碎片。
然后，将去除细胞核和细胞碎片的细胞质上清液继续进行高速离心，以沉淀肝微粒体。
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
O-去甲基文拉法辛对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性的影响刘明远杨光远杨艳1孙严彤1赵锦程朱秋双张明远白雪杨玉张波（佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）〔摘要〕目的研究O-去甲基文拉法辛（ODV ）对大鼠肝微粒体内细胞色素P450酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性的影响。
方法以生理盐水为对照，大鼠每日灌胃给予22.90mg /kg 的O-去甲基文拉法辛琥珀酸盐水合物，连续7d ，然后测定其肝微体CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19的活性。
结果与生理盐水对照组比较，ODV 组CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性无变化（P ＞0.05）。
结论ODV 对大鼠CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性无影响。
〔关键词〕O-去甲基文拉法辛；CYP450；CYP1A2；CYP2C9；CYP2C19〔中图分类号〕R34〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）12-2547-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.047基金项目：黑龙江省自然科学基金资助项目（D200873）；黑龙江省科技攻关项目（GC09C317）；佳木斯大学新世纪创新基金项目（CX2009-027）；佳木斯大学重点项目（Szj2008-015）1吉林大学药物代谢研究中心通讯作者：杨光远（1975-），男，副教授，硕士生导师，主要从事心血管药理及药物相互作用研究。
第一作者：刘明远（1973-），女，副教授，博士，主要从事药物分析及药物代谢研究。
O-去甲基文拉法辛（ODV ），化学名称为1-〔2-（二甲基氨基）-1-（4-苯酚）乙基〕环己醇，是抗抑郁药文拉法辛的活性代谢物。
与文拉法辛相同，ODV 通过抑制5-羟色胺以及去甲肾上腺素的再摄取来治疗抑郁症、强迫症以及焦虑症，但副作用小，比其更安全〔1，2〕。
大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。
打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。
剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。
（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。
（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。
用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。
（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。
（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。
后续隔天换液培养。
探针药物法评价苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用郑造乾;骆瑾瑜;陈燕华;王小军【摘要】Objective To investigate the in vitro inhibition of kudiezi injection (KDZi) on liver microsomal CYP3A4 in rats and the potential herb-drug interaction with drugs metabolized by CYP3A4 enzyme in clinical ap-plication. Methods The test groups included a negative control group, an inhibitor positive control group and a KDZi group. After incubating the rat liver microsomes with testosterone, a probe substrate, the reduction of testos-terone were quantitated with HPLC, and IC50 values were calculated to assess the inhibitory effect of KDZi on rat CYP3A4 enzyme. Ketoconazole was used as a positive control. Results In mixture metabolic system of liver mi-crosome enzymes, the most suitable incubationconc entration of testosterone was 100μmol/L, incubation time was 40 min and concentration of microsome protein was 0.5mg/mL, when the concentration of Tris-HCl buffer was 0.1mol/L (pH7.4) at 37℃. The results showed that the IC50 value of positive inhibitors of CYP3A4 was0.0707μmol/L, which indicated that the incubation system satisfied the demands of CYP3A4 enzyme inhibition activity evaluation. The relative inhibitory rate of CYP3A4 in 9 serial volume concentration of KDZi (0,0.01%, 0.10%, 0.20%, 0.50%, 1.00%, 2.00%, 5.00%, 10.00%) were 0, 2.94%, 16.44%, 22.70%, 31.44%, 37.47%, 46.37%, 51.74%, and 60.40%, respectively. The IC50 value of KDZi on CYP3A4 inhibition was 3.46%, which wasexceeded their daily-dose concentration. Conclusion In ordinary condition, no significant interaction between KDZi and CYP3A4 is de-tected in vitro, which indicates that KDZi might be used with CYP3A4 enzyme substrates.%目的：观察苦碟子注射液对大鼠肝微粒体CYP3A4的体外抑制作用与CYP3A4酶底物合用药时可能产生的相互作用。
大鼠原代肝细胞培养方法的建立摘要体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多，但均存在一些缺陷。
对胶原酶灌流法进行改良，采用细胞密度为6×105个/ml，细胞生长状态好，既能保证细胞活率，又能满足下一步试验要求。
用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注，胰酶最适浓度为0.18%，且灌流时维持最适温度37 ℃，分离得到的肝细胞存活率大于90%，且纯度很高，是一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。
关键词细胞培养；原代；大鼠中图分类号q813.1+1文献标识码a文章编号 1007-5739（2013）12-0226-02体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多[1-4]，常用的有直接剪切法[5]、组织块消化法[6]和两步胶原酶灌流法[7-8]等。
由于肝细胞体外培养增殖能力差，原代培养的细胞存活率不高，故在一定程度上阻碍了肝细胞体外模型的广泛应用[9]。
直接剪切法和组织块消化法所分离肝细胞杂质较多，细胞纯度不高，酶消化反应不易控制，且过多的结缔组织直接影响细胞的正常生长等，不利于细胞生物学和分子生物学的进一步研究。
胶原酶灌流法分离的肝细胞数量多且活力好，是分离大鼠原代肝细胞的经典方法[3]，但由于操作方法较为复杂，限制了该方法的广泛应用。
该试验对胶原酶灌流法进行了改良，试图建立一种操作简便、细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法。
1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物。
健康雄性sd大鼠，体重180～220 g，由江苏大学实验动物中心提供。
1.1.2试剂及仪器。
williams’medium e（wme），胰岛素，青链霉素（penicillin/streptomycin）：sigma-aldrich，usa；l-谷氨酰胺（l-glutamine），胰蛋白酶（trypsin），噻唑兰（mtt），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，bsa）：amresco，usa；胎牛血清（fetal bovine serum，fbs）：gibco，usa；其他相关试剂均为国产分析纯。
半夏泻心汤及不同配伍组对大鼠肝脏CYP450酶活性的影响［摘要］目的：研究半夏泻心汤及不同配伍组对大鼠肝微粒体CYP450亚型酶的影响，从肝脏代谢角度评价半夏泻心汤组方的合理性。
方法：将大鼠随机分为全方组、辛开组、苦降组、甘补组及空白对照组，分别灌胃水煎液，运用肝微粒体体外温孵法，对探针底物进行孵育，并结合超高效液相检测方法，测定各探针底物代谢产物的含量，计算代谢速率，以反映各给药组的肝微粒体CYP2C6，CYP2E1，CYP3A1/2亚型酶活性。
结果：与空白组相比，全方组，苦降组对各亚型酶均起抑制作用（P＜0.01）；辛开组对CYP2C6有抑制作用（P＜0.01），而对CYP2E1和CYP3A1/2无显著抑制作用；甘补组对CYP2C6和CYP2E1亚型起抑制作用（P＜0.01），而对CYP3A1/2无抑制作用。
结论：全方对大鼠肝微粒体CYP450酶起抑制作用，比较各配伍组间差异，苦降组抑制作用较其他配伍组显著。
［关键词］半夏泻心汤；配伍；CYP450酶；肝代谢；温孵细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）属血红蛋白类酶，又称肝药酶或单加氧酶[1]，是人体内最重要的药物代谢酶。
其中CYP2C9在人肝微粒体中含量较丰富，代谢的药物相当广泛，约占临床常用药物的10%～12%[2]。
CYP2E1主要参与许多小分子毒性物质和前致癌物质转化为致癌物，对有害物质在体内的积蓄造成机体危害[3]。
CYP3A4是肝脏中CYP450酶含量最丰富的亚型酶，在多种外源性物质和药物的代谢中起到至关重要的作用，是最重要的P450酶[4]。
大鼠肝脏CYP450酶中没有CYP2C9和CYP3A4亚型，与之功能相对应的是CYP2C6和CYP3A1/3A2。
半夏泻心汤由半夏、干姜、黄连、黄芩、人参、炙甘草、大枣7味中药组成，半夏、干姜辛开而温为辛开组，以散脾气之寒；黄芩、黄连苦泻而寒为苦降组，以降胃气之热；人参、甘草、大枣甘温调补为甘补组，和脾胃、补中气，以复中焦升降功能，此即辛开苦降甘调之法。
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定1 实验目的学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。
2 实验材料与方法2.1实验动物大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周龄，150g左右2.2试剂1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml2.3器材低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等2.4 实验操作2.4.1试剂的配制（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
2.4.2肝S9的制备（1）诱导苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。
（2）采样采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
（3）肝匀浆的制备弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。
（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。
（5）分装保存将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。
于液氮速冻后置-80℃低温保存。
深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）2.5.1测定原理考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
UPLC-LTQ-Orbitrap MS法鉴定棉酚在肝微粒体的代谢产物刘良红;关英;周洋;郑斌婕;王李婷;王雨薇;蔡伟;张加余【摘要】本文主要研究棉酚在大鼠肝微粒体中的代谢产物.首先以大鼠肝微粒体温孵棉酚,采集大鼠肝微粒体孵育样品并制备样品,然后采UPLC-LTQ-Orbitrap MS 法对温孵体系中的代谢产物进行分析.结果发现在大鼠肝微粒体温孵体系中共检测除原型在外的2个代谢产物,主要为羟基化的代谢产物.本文通过研究棉酚的代谢转化,发现易于发生代谢的位点和结构特征,为进一步研究棉酚在体内的代谢和代谢酶奠定基础.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2017(045)015【总页数】3页(P125-127)【关键词】棉酚;UPLC-LTQ-OrbitrapMS;肝微粒体;代谢产物【作者】刘良红;关英;周洋;郑斌婕;王李婷;王雨薇;蔡伟;张加余【作者单位】湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;湖南医药学院药学院,湖南怀化 418000;北京中医药大学中医药研究院,北京朝阳 100029【正文语种】中文【中图分类】R917棉酚是从锦葵科植物陆地棉、树棉或草棉成熟种子、根皮以及茎干中提取分离得到的双羟基双萘醌类化合物，是一种黄色的多酚类物质。
棉酚具有显著的抗生育作用，一度成为男性避孕药的研究热点，但由于其具有不可逆的无精症和低血钾症，使得研究陷入低迷[1-4]。
棉酚的研究主要集中在其药效和毒性机制方面[5-9]，其在药物代谢方面研究较少[10-11]，因此本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap MS技术，研究了棉酚在大鼠肝微粒体中的代谢产物，为进一步研究棉酚在体内的代谢和代谢酶奠定基础。
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1)其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。
实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定一、目的要求1. 掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定方法。
二、实验原理外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450 酶（CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。
许多药物对细胞色素P450 酶系活性有抑制或诱导作用，当与其他需经CYP450 代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产生药物相互作用。
制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450 酶系的含量与活性，可为进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450 酶系的影响提供依据。
肝微粒体细胞色素P450 酶系活性测定中，本实验首先应用Lowery 法测定肝微粒体蛋白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。
细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法，还原型细胞色素P450 可与一氧化碳结合，在波长450 nm 处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450 nm 处进行测定，而氧化型细胞色素b5 经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423 nm 处呈最大吸收，因此可通过测定还原型与氧化型细胞色素b5 的差示光谱来进行。
三、仪器与试剂实验动物：Wistar 大鼠，雄性，体重212±13 g。
主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清白蛋白，甲醛。
实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。
四、实验步骤1. 给药：8 只雄性Wistar 大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1 ml，每日灌胃1 次，连续7 d。
d 7，禁食1 夜，次日断头处死。
2. 动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，取出肝脏，用0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖（pH 7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表面血液，称肝重。
将肝脏剪碎，用上述缓冲液洗2 次，充分去除肝脏血液。
按每克肝脏组织加3 ml 缓冲液的比例加入0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆；10 000×g，4℃离心20 min。
取上清液转移至超速离心管内，105 000×g，4℃离心60 min。
弃上清，淡红色沉淀物即为肝微粒体。
将肝微粒体沉淀取出后用0.05 mol·L-1 Tris-0.25 mol·L-1 蔗糖（pH 7.5）悬浮，经超声细胞粉碎仪混匀后，分装于冻存管中，干冰速冻后，置-70℃冰箱保存。
大鼠肝微粒体蛋白浓度测定：Lowery 法。
3. 牛血清白蛋白标准曲线制备在试管中分别加入0、25、50、100、150、200、250 mg·L-1 系列浓度的牛血清白蛋白溶液1 ml，然后加入5 ml Flion 酚试剂甲混匀，室温放置10 min 后加入0.5 ml Flion 酚试剂乙（1 mol·L-1），立即混匀，30 min 后，以不含蛋白质的试剂空白对照于紫外分光光度计760 nm 波长处扫描。
以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标，OD 值为纵坐标，进行线性回归，求得牛血清白蛋白线性回归方程。
4. 样本中蛋白浓度测定将待测大鼠肝微粒体样本稀释50 倍，加入稀释后样本1 ml，其余同标准曲线操作步骤。
依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。
5. 细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法。
吸取0.05 mol·L-1 Tris-0.2517mol·L-1 蔗糖溶液5.5 ml，加入稀释为5 mg·ml-1 的待测微粒体悬液0.5 ml 及10%连二亚硫酸钠0.04 ml，立即混匀。
等量分装到两个比色杯中，分别作为对照和样本，于样本池中比色杯充一氧化碳30 s，紫外分光光度计450 nm 向490 nm 扫描。
计算公式如下：nmol·mg-1 蛋白=ΔOD（450 nm-490 nm）×100091×稀释后蛋白浓度（mg·ml-1）__HLM Preparation.To allow for sufficient microsomes to perform all assays, three livers were prepared for each of the three experiments (the force of the first centrifugation, homogenization buffer, and homogenizing strokes). Approximately 10 g of liver per experimental treatment was allowed to thaw in a room temperature homogenization buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.125 M potassium chloride and 1.0 mM EDTA). After transfer to 25 ml of chilled homogenization buffer (plus or minus 0.25 M sucrose in the buffer experiment), livers were minced thoroughly with scissors and homogenized with 10 strokes (6, 8, or 10 strokes in the strokes experiment) using a Teflon-glass homogenizer (870 rpm). Strokes were even and steady, lasting approximately 15 s for passage, except for the first two strokes where greater pressure and time were spent on material on the bottom of the glass tube. The tube was submersed in a small bucket of ice and water during all homogenization. The homogenate was diluted to 4 volumes of sample weight (approximately 40 ml). The samples then were centrifuged at 12,000g (9,000, 10,500, or 12,000gin the force experiment) in a Sorvall RC-5B with a Sorvall SA-600 rotor for 20 min (Sorvall, Newton, CT). The supernatant from the first centrifugation was removed, the mitochondrial pellet was resuspended in 25 ml, and the centrifugation was repeated. The supernatants were combined and centrifuged at 138,000g in a Sorvall Ultra Pro 80 with a Sorvall T-1270 rotor for 60 min. The upper lipid layer was removed and the cytosolic supernatant collected. The microsomal pellet was resuspended in 0.125 M KCl, 0.1 M Tris (pH 7.4) with three homogenization strokes, and the 138,000gcentrifugation for 60 min was repeated. The microsomal pellet was resuspended in incubation buffer with six strokes and brought to a final volume of 26 ml. Samples were stored at −70°C.。
