喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定
刘兆颖，陈冬梅，袁宗辉
华中农业大学国家兽药残留基准实验室
喹乙醇（olaquindox），又名倍育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，能促进动物生长，提高饲料转化率，具有广谱抗菌作用，可以预防猪的大肠杆菌和痢疾。
但由喹乙醇具有生殖毒性、致突变性和光毒性，因被禁止或限制使用。
目前国内外对喹乙醇的代谢研究很少，Spierenbur等（1988）用HPLC检出了猪胃肠道中喹乙醇的三种还原代谢物，即N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇。
JECFA报道猪口服喹乙醇(2mg/kg b.w)后，24h内就消除了药量的90%，其中70%是以原形从尿液中排出，血浆最大浓度出现时间是1-2h，表明喹乙醇吸收快，消除也快。
给药2天后，检测组织中的放射性，发现肝脏和肾脏分别残留52和110μg/kg，肌肉为9μg/kg，。
尿液中存在N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇和三种羧酸衍生物，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）在体内消除缓慢，因而被规定为肝肾组织的残留标识物。
因此为了更好地了解喹乙醇的代谢特征，本文先用体外代谢方法对其代谢进行研究。
肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。
制备肝微粒体一般用差速离心法。
肝微粒体体外温孵法与其他的体外肝代谢方法相比，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。
本文就用大鼠肝微粒体来研究喹乙醇的体外代谢，对其代谢产物的鉴定就用高灵敏度、高质量精度和多级质谱的LCMS-IT-TOF联用技术，首次发现了一些没报道的新代谢产物，完善了喹乙醇的代谢途径，为喹乙醇的毒性研究和残留监控提供了重要的指导意义；同时，为喹噁啉类其它药物的代谢研究提供了重要的参考价值。
1. 实验材料
1.1标准品及标准溶液配制
喹乙醇，含量99.8%，中国兽医药品检查所，批号H050204；
喹乙醇储备液：准确称取26.3mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用少量超纯水溶解，再用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存；
脱二氧喹乙醇，含量98%以上，华中农业大学兽药研究所合成，批号20050831；
脱二氧喹乙醇标准储备液：准确称取23.2mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存。
1.2试验动物
7周龄Whister雄性大鼠，体重167g-185g，购自湖北疾病预防控制中心实验动物房。
实验前禁食12h，期间自由饮水。
1.3试验仪器和设备
电子天平，感量0.000001g，日本SHIMADZU公司；
隔水式电热恒温培养箱，303AS-3型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；
日立CS120GLS超速冷冻离心机；
HITACHI H IMAC CR21G高速冷冻离心机；
Agilent 8453E 紫外可见光谱仪；
意大利Angelantoxi Polar 530超低温冰箱；
美国Millipore-Q超纯水仪；
日本LCMS-IT-TOF，配SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器和CTO-20AC柱温箱，LCMS solution Chemstation 工作站。
1.4试剂及溶液配制
乙腈，色谱纯，Fisher，批号 064510；
甲酸，分析纯，上海试剂一厂，批号20060403；
氯化镁，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20060714；
蔗糖，Amresco，批号，3073B95；
低亚硫酸钠，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号F20060815；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠（NADP+）Roche，批号2006828；
6-磷酸葡萄糖（glucose 6-phosphate G-6-P），含量98-100%，批号G7250；
6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase G-6-PD），Sigma，含量2000国际单位（U），批号，G8404；
三羟甲基氨基甲烷（Tris Base），Amresco，批号2005616；
乙二胺四乙酸（EDTA），分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号W20051216；
氯化钾，中国医药集团上海化学试剂公司，批号，F041015；
三氯乙酸，含量99%，上海宏瑞化工有限公司，批号20061102；
BCA蛋白测定试剂盒，美国Pierce公司，货号，23225；
Tris-HCl溶液：准确称取30.285mg Tris于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl缓冲液；
Tris-HCl匀浆缓冲溶液：准确称取30.285mg Tris、146.125mg EDTA和42.75mg蔗糖，于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至500mL，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl（含1mmol/L EDTA、0.25mmol/L蔗糖）匀浆缓冲液，置于4℃保存。
注：以上溶液试验时均在有效期内
2. 实验方法
2.1肝微粒体的制备
用差速离心法制备大鼠肝微粒体。
大鼠（n＝3）禁食过夜，脱臼处死后迅速剖开其胸腔和腹腔，取出肝，用Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）反复冲洗除掉组织中的血液成份，称重，按1:4（W/V）加入0.05mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液（含0.15mol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.25mol/L蔗糖），用玻璃匀浆器制成肝匀浆。
将制备好的肝匀浆在Hitachi micro 120GX超速冷冻离心机上10000g离心20min。
取上清液100000g离心60min，上清液即为胞液，淡红色沉淀即肝微粒体。
取部分微粒体蛋白以pH7.4 0.1mol/L Tris-HCl稀释，用于测定蛋白含量，其余用Tris-HCl缓冲溶液分装，放入-80℃冰箱中储存备用。
以上所有操作均在冰浴中进行。
2.1.1微粒体蛋白浓度测定
用BCA 法（Smith et al, 1985）测定蛋白浓度，具体操作如下：1）标准曲线绘制：按表1配成不同浓度的牛血清蛋白（BSA ）溶液。
取9只干净的试管，以英文字母A-I 编号，分别在每管里加2mLBCA 工作液，分别加入不同浓度的BSA 溶液0.1mL 混匀，放到37℃水浴锅里反应30min ，冷却到室温，用Agilent 8453紫外分光光度计在562nm 处进行比色测定光密度值（OD ），以I 号为空白，所有样品在10min 内测完，每一样品重复一次，取平均值。
以减去空白的OD 值为纵坐标（y ），BSA 浓度为横坐标（x ）绘标准曲线图。
算出回归方程和相关系数。
2）肝微粒体蛋白含量的测定：取2支试管，各加入微粒体悬液0.1mL ，再加BCA 工作液2mL ，以后操作同上。
将微粒体悬液样品的OD 值减出空白管I 的OD 值，代入回归方程，求出相应蛋白溶液的浓度。
表1 BSA 的标准溶液
Table1 Standard solution of BSA
编号
稀释液的体积a （μL ） 2mg/mL 的BSA 体积（μL ）
最终的BSA 浓度（μg/mL ）
A 0 取标准蛋白300 2000
B 125 取标准蛋白375 1500
C 325 取标准蛋白325 1000
D 175 从B 号中取175 750
E 325 从C 号中取325 500
F 325 从E 号中取325 250
G 325 从F 号中取325 125
H 400 从G 号中取100 25
I 400
0＝空白
a ） 稀释液与样品的稀释液相同，都为0.05mol/L Tris-HCl （pH7.4）缓冲液（含0.001mol/L EDTA ）
2.1.2细胞色素P450差示光谱及含量测定
取10mg/mL 的肝微粒体悬液0.3mL ，加0.10mol/L pH7.4的PBS 5.7mL 混合，取3mL 装于比色杯内，向比色杯内加4~5mg 连二亚硫酸钠，用小玻棒小心混匀，待稳定后，置于Agilent8453紫外分光光度计，扫描400~500nm 间的基线。
然后向样品杯中轻轻充入CO ，约60秒后再扫描400~500nm 的差示光谱，根据450nm 和490nm 处吸光度OD 值，计算细胞色素P450含量。
计算公式如下：
()()()mL /mg 911000
nm 490nm 450OD mg /nmol 450P 反应体系中的蛋白浓度××−=
2.2 喹乙醇与NADPH 生成系统孵育
微粒体1mg 和NADPH-生成系统（5mM MgCl 2，10mM 6-磷酸葡萄糖，2mM NADP ，2μ/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶）在0.05M Tris-HCl 缓冲液中预反应2min ，加50μM 喹乙醇开始反应120min ，反应总体积0.5mL 。
反应后用100μL 的15% 三氯乙酸（TCA ）终止，12000rpm 离心10min ，取50μL 上清液进样。
为了研究喹乙醇的代谢物是否能进一步代谢成别的化合物，用50μM 脱二氧喹乙醇与微粒体孵育，其孵育条件与喹乙醇一样，终止的处理方法同喹乙醇。
2.3LCMS-IT-TOF条件
仪器用Shimadzu LCMS-IT-TOF，LC包括SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器和CTO-20AC柱温箱。
分析柱为VP-ODS (5μm，150×2.0mm)。
扫描范围200-400nm，柱温40℃，流速为0.2mL/min，流动相A，乙腈：水：甲酸5：95：0.1 (v/v)；流动相B，乙腈：水：甲酸 80：20：0.1 (v/v)：。
采用梯度洗脱：0-5min，2-5%B；5-15min，5-30%B；15-18min，30-100%B；18min-23min，100%B；23.1min，2%；23.1-30min，2%。
质谱条件：离子化用ESI ，正离子模式，扫描范围m/z 50- 500，接口电压4.5KV，检测电压1.6KV，液氮为雾化气，流速1.5L/min，液氮也作为冷却气，压力170KPa，CDL和加热模块的温度都为200℃，高纯Ar作为碰撞气，相对碰撞能量和压力都为50%，离子累积时间为20msec。
仪器控制、数据采集和处理用LCMSsolution3.1软件操作。
所有离子的分子量都采用单同位素荷质比计算，LCMSsolution配有分子预测软件，一个荷质比能计算出很多的分子式，由于时间飞行质谱具有很高的质量精度，因此，在计算可能的分子式时，把质量误差的范围设置在±5mDa以内。
把碎片之间的断裂的值也设置在±5mDa以内，这样就能准确的找到其代谢物和推倒每个化合物的裂解途径。
3. 结果
3.1肝微粒体组成特点
3.1.1肝微粒体的蛋白浓度测定
用BCA法测定蛋白浓度，按表2数据绘制标准曲线。
以蛋白浓度C为横坐标（X），吸光度OD值为纵坐标（Y），所得标准曲线为：Y=0.0011X+0.0646，r=0.9954。
根据上述方程及公式计算出：大鼠肝微粒体的蛋白浓度为24mg/mL。
表2 BCA法测定的标准蛋白浓度的吸光值
Table2 Determination the absorbance of standard protein concentrations by BCA Kit
标准BSA蛋白浓度（μ/mL） 562nm BSA的吸光值（OD）
25 0.02
125 0.18
250 0.37
500 0.65
750 0.99
1000 1.24
1500 1.76
2000 2.14
3.1.2微粒体细胞色素P450酶CO差示光谱
图1为细胞细胞色素P450通入CO后的差示光谱，由图中可以看出大鼠肝微粒体P450经连二亚硫酸钠还原与CO结合后在450nm处有最大吸收，并且420nm处无吸收，说明微粒体P450酶活性很高，没有失活，可以用于代谢研究。
5.0
10.0
15.0
20.025.0
0.0
0.51.01.52.0(x1,000,000)
1:264.0979 (1.00)图1 大鼠肝细胞色素P450 CO 差示光谱
Fig1 The carbon monoxide difference spectrum of liver cytochrome P450 of rat
3.2 喹乙醇裂解途径的确定
从总离子流图(TIC)中提取喹乙醇(m/z 264.0979)的质量色谱图(Fig2)，发现其保留时间与LC 的保留时间一致，其MS 2和MS 3见图3。
把各离子的测定值与理论值比较，其质量误差范围在-4.7-0.5mDa (-32.85-3.12ppm) 之间 (Table 3)。
根据各种碎片离子的分子式，推断喹乙醇的裂解途径(Scheme 1)。
在推断各裂解途径时，比较了丢失离子和分子的值与理论值的误差（Table ），结果表明其误差范围在0.07-4.34 mDa ，这能更好的帮助其分析裂解的可能性。
图2 喹乙醇的提取质量色谱图
Fig 2 The extracted mass chromatogram of olaquindox.
表3 各离子之间的丢失离子或分子，观测值和理论值及其误差
Table3 Loss ion or molecular, observed mass and predicated mass and mass error between ions. m/z-m/z Loss ion or molecular Observed Mass(Da) Predicated Mass(Da) Error(mDa)
264-246 H 2O 18.0118 18.0106 1.2
264-221 264-177 246-229 229-212 221-160 221-177 212-143 160-131 177-160
C 2H 5N
C 3H 5NO 2
OH
OH
CHO 3
CO 2
C 3H 3NO
CHO
OH
43.0430 87.0321 17.0018 17.0027 60.9916 43.9891 69.0258 29.0036 17.0021 43.0422 87.0320 17.0027 17.0027 60.9926 43.9898 69.0215 29.0027 17.0027 0.8 0.07 0.94 0.04 0.97 0.73 4.34 0.86 0.64
m/z
0.01.0
2.0
Inten.(x1,000,000)
264.0978286.0800
m/z
0.01.0
2.0
3.04.0Inten.(x100,000)246.0860229.0842160.0636
m/z
0.0
0.51.01.52.0Inten.(x10,000)
212.0825229.0775
100
200
300
m/z
0.01.02.03.0Inten.(x10,000)212.0804
143.0671
100
200300m/z
0.02.55.0
7.5Inten.(x1,000)
160.0632
131.0596
100
200300m/z
0.01.0
2.0
3.0
Inten.(x1,000)
143.0557
图3 喹乙醇的MS, MS 2 and MS 3图。
Fig 3 MS, MS 2 and MS 3 of olaquindox. (A): MS; (B): MS/MS (Precurson ion 264.0979); (C): MS/MS/MS (Precurson ion 246.0873); (D): MS/MS/MS (Precurson ion 229.0846); (E): MS/MS/MS
(Precurson ion 221.0557); (F): MS/MS/MS (Precurson ion 212.0818).
Table 4 Formula, observed mass and predicated mass, double bond equivalents (DBE), and mass error
of the fragment ions of protonated olaquindox. Predicated formula
Observed mass(Da)
Predicated Mass(Da)
DBE Error(mDa) Error(ppm) C 12H 14N 3O 4+ 264.0978 264.0979 8.0 -0.1 -0.38 C 12H 12N 3O 3+ C 12H 11N 3O 2+ C 10H 9N 2O 4+ C 12H 10N 3O + C 9H 9N 2O 2+ C 9H 8N 2O + C 9H 7N 2+ C 8H 7N 2+ 246.0860 229.0842 221.0548 212.0815 177.0657 160.0636 143.0557 131.0596
246.0873 229.0846 221.0557 212.0818 177.0659 160.0631 143.0604 131.0604
9.0 9.0 8.0 10.0 7.0 7.0 8.0 7.0
-1.3 -0.4 -0.9 -0.3 -0.2 0.5 -4.7 -0.8
-5.28 -1.75 -4.07 -1.41 -1.13 3.12 -32.85 -6.10
(A) (B) (F)
(E)
(D)
(C)
H
3
3
m/z 177.0659
m/z 131.0604
m/z 143.0604
示意图1 喹乙醇可能的裂解途径
Scheme1 Proposed fragmentation pathways of olaquindox.
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
min
0.0
0.51.01.52.0mAU(x10)
PDA Ch1 (326nm) x 1.00
(A)
Fig 4 Representative HPLC chromatogram of metabolites of olaquindox formed.
A, A control mixture of rat liver microsome was mixed with NADPH-regenerating system without olaquindox. B, A mixture of rat liver microsome was incubated with olaquindox without NADPH-regenerating system. C, A mixture of rat liver microsome was incubated with olaquindox with NADPH-regenerating system.
3.3 喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的确证
3.3.1 喹乙醇代谢产物的分离
喹乙醇在大鼠微粒体中能广泛代谢，与对照组相比，喹乙醇在NADPH-生成系统中减少了75%，从图4可以看出，大鼠微粒体能代谢成13种代谢物，暂把其命名为M1-M13，其中M1，M2和M9为主要的代谢物，其它为少量的代谢物。
从二极管阵列检测器上提取了原形药及其代谢物的紫外光谱图，M4、M6、M11、M12和M13由于浓度低或没分开，其紫外光谱没提取出来。
nm
050100
150200250300mAU
260
238
374
357
200
250
300
350nm 02550
75
100125
150
mAU
244
329346
289
nm
250
500
750
mAU
244
326
Olaquindox M1 M2 M3 M5 M7
nm 025
50
75100125mAU 259
366
200300nm
02550
75
mAU
261
341
369
nm
25
50
75
mAU
268
370
200
300
nm
01020
304050607080mAU
325
200300nm 0255075
100125
mAU 239
322
200300nm
50100
150200250300mAU
240
321
图5 原形药和代谢物的二极管阵列紫外光谱图
3.3.2 喹乙醇代谢产物的鉴定
从喹乙醇可能的代谢方式出发，提取了可能代谢物的离子色谱图见图6。
在一级质谱中找到其母离子，并把其测定值与理论值的误差范围控制在±5mDa 以内，再把那离子作为前体离子，做其MS 2，把碎片离子与原形药的碎片离子比较，找到其规律，再结合其精确的质量数和分子式预测软件，推断代谢物的裂解途径，由于代谢物是在原形药的基础上加或脱得一个基团，因而其裂解规律与喹乙醇有相似性，由于碰撞能量一样，其喹噁啉母环的结构应不变，并不易碎裂，根据这些信息，喹乙醇的代谢物基本上能确证。
M1
M2
(A)
10
20
0.00
0.250.500.751.001.25(x10,000,000)
1:248.1030 (1.00)
M3
M4 M5 (B)
10
20
0.0
0.51.0
1.5
2.0(x1,000,000)
1:264.0979 (1.00)
Fig 6 The extracted mass chromatogram (EIC) of olaquindox metabolites in rat liver microsomes. (A):
M1 and M2; (B): M3, M4 and M5; (C): M6 and M7; (D): M8; (E): M9 ; (F): M10;
根据代谢假设，提取了可能代谢物的提取色谱图，其保留时间与液相分离的时间一致。
为了进一步证明是否为何种代谢物，就选提取的离子作为碰撞离子，比较其碎片离子与喹乙醇的规律。
M1和M2：代谢产物M1和M2的保留时间分别为13.9和16.2min ，两者的分子离子峰都为248，比原形药喹乙醇少16Da ，这表明M1和M2为N →O 还原的代谢产物，两者的不同就在于还原位置的不同。
从质谱强度和液相的吸光值来看，M2的生成量明显高于M1，这主要由于侧链上的甲基对邻近4位上的N →O 基团有阻碍作用，使N4上的氧不容易脱得，而1位上的N →O 基团受邻近酰胺吸电子的影响，使N1上的易脱掉，因此，M1和M2分别暂定为N4－还原喹乙醇和N1－还原喹乙醇。
M1的碎片离子m/z 230，205和161比喹乙醇的246，221和177少16Da ，m/z 143与喹乙醇一样的碎片，表明喹噁啉环没改变，N →O 基团保持完整，其侧链易完全脱得，这进一步证明氧的位置应在N1位，因此，M1应为N4－还原喹乙醇。
其裂解途径见图。
M10
(F) 10200.00.51.0
1.5
2.02.5(x100,000)1:246.0873 (1.00)M6
M7
(C)
0.00.51.0
1.5
2.0(x100,000)1:280.0928 (1.00)
M9
(E)0.0
2.5
5.0(x1,000,000)
1:232.1081 (1.00)
M8
(D)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.05.0(x100,000)
1:262.0822 (1.00)MS/M1
m /z
0.01.02.03.04.0Inten.(x1,000,000)248.1036
230.0942
MSMS/M1
m /z
0.00
0.250.500.751.00Inten.(x1,000,000)230.0913
161.0721143.0613205.0633
m/z 161.0709
m/z 205.0608
3
m/z 143.0604
图7 M1的MS and MS 2 图和裂解途径示意图（A ）
Fig 7 MS 、MS 2 spectra of M1 and (A) proposed fragmentation pathways of N4-reduced olaquindox (M1).
M2的碎片离子230，213和205都比喹乙醇的碎片离子246，229和221少16Da （图7），这表明N →O 基团保持完整，其侧链没脱得，M2的碎片离子213，比喹乙醇的212多一个氢原子，这进一步证实了N 上的氧是以OH ˙基消除，侧链完全脱得后，生成与喹乙醇一样的碎片m/z 143。
m/z 205中性丢失H 2O 生成m/z 187，再进一步丢失CO 生成m/z 159，这说明氧的位置应在N4位，侧链才会一步一步的裂解， 其裂解途径见图。
m/z 205.0608
m/z 187.0502
m/z 159.0553
3
Fig8 MS and MS 2 spectra of M2 and proposed fragmentation pathways of N1-reduced olaquindox (M2).
MS/M2
100
200
300
m/z
0.00.51.0
1.5
Inten.(x10,000,000)248.1036
230.0900205.0586
MSMS/M2
m /z
0.02.5
5.0
Inten.(x1,000,000)230.0897
205.0585187.0486
M3，M4和M5：M3、M4和M5有不同的保留时间，但都有相同的分子离子峰264，这表明这些可能为脱一氧后的羟化代谢物，为证明是那个脱氧的代谢物和羟化的位置，做了其二级质谱。
M3的碎片离子246，221，177 (图8) 比N4－还原喹乙醇的碎片离子230，205，161多16Da ，碎片离子m/z 175是m/z 246失去C 3H 5NO (测定值 71.0352Da, 理论值71.0371Da)，碎片离子m/z 203是m/z 246失去C 2H 3O (测定值 43.0191Da, 理论值43.0184Da)，由于其裂解的规律与M1基本一样，因此，M3是N4－还原喹乙醇在苯环上的羟化代谢物，但具体的位置不能确定。
其裂解途径如图
100
200
300
m /z
0.0
1.02.03.04.05.0Inten.(x10,000)
264.0969
212.1104
306.2469343.2758
m /z
0.02.5
5.0Inten.(x1,000)
175.0464
221.0596
m/z 177.0659
m/z 221.0557
3
m/z 175.0502
2m/z203.0689
M4失去H 2O 生成 m/z 246，再进一步失去H 2O 生成m/z 228，因此怀疑该代谢物羟化的位置在甲基上，因为羟甲基易受侧链的影响而发生中性丢失，M4的三级质谱中包含与N1－还原喹乙醇相同的碎片离子187，159，143，m/z 143进一步说明羟化的位置不在苯环上，据此推断M4为3-羟甲基-N1-还原喹乙醇。
100
200
300
m/z
0.02.5
5.0
Inten.(x10,000)
246.0869
264.0960
204.0755217.1787145.1252231.1668
100
200
300
m/z
0.00.51.01.5Inten.(x10,000)246.0855228.0763
100
200300m/z
0.02.5
5.0
Inten.(x1,000)
115.0380159.0498
228.0689211.0672
MS/M3 MSMS/M3
(A) (B) (C)
m/z 143.0604
m/z 115.0417
Fig9 MS, MS 2 and MS 3 of M4. (A): MS; (B): MS/MS (Precurson ion 264.0979); (C): MS/MS/MS
(Precurson ion 246.0873);
M5的碎片离子246，229，221，203比N1-还原喹乙醇的碎片离子230，213，205，187多16Da ，碎片离子 m/z 176是 m/z 221失去CHO 2 (测定值 44.9988Da, 理论值44.9977Da)，m/z 176丢失CHO(测定值29.0031Da, 理论值29.0027Da)生成m/z 147，m/z 160是m/z 229失去C 3H 3NO(测定值69.0202Da, 理论值69.0215Da)，碎片离子中没有143或145离子，因此，M5应是N1－还原喹乙醇在苯环上的羟化代谢物，但具体的位置不能确定。
其裂解途径见图
MS/M5
100
200
300m /z
0.02.5
5.0
Inten.(x100,000)
264.1019
334.2974
149.0372 MSMS/M5
100
200
300m /z
0.02.5
5.0
Inten.(x10,000)
176.0594
229.0866221.0582203.0467147.0563160.0664
m/z 221.0557
3
m/z 176.0580
3
m/z160.0631
m/z 147.0553
3NO
m/z 203.0451
M6和M7：M6和M7有不同的保留时间，但都有相同的分子离子峰280，这表明这两者为喹乙醇的羟化代谢物，为证明羟化的位置，做了其二级质谱。
M6和M7都有碎片离子262和245，这些比喹乙醇的246和229多16Da 。
M6的碎片离子237比喹乙醇的221多16Da ，因而，推断M6羟化的位置在苯环上，但具体的位置不确定。
M7的碎片离子m/z 219是m/z 262失去C 2H 5N (测定值 43.0385Da, 理论值 43.0422Da)，离子m/z 201是 m/z 245失去C 2H 4O (测定值 44.0258Da, 理论值 44.0262Da) 而不是 C 2H 6N (理论值 44.0500Da)，这提示酰胺的邻近位置存在羟基，因此确定M7为3－羟甲基喹乙醇。
MS/M6
100
200300m/z
0.02.5
5.0
Inten.(x10,000)
246.0868280.0921350.2886217.1829
MSMS/M6 100
200
300
m/z
0.00
0.25
0.500.751.00Inten.(x10,000)
149.0229237.0514245.0763262.0890
H m/z 280.0928
m/z 262.0822
m/z 245.0795
m/z 237.0506
┐H
OH m/z 280.0928
m/z 245.0795
O
2OH
m/z 219.0400
C 2H 5N
C 2H 4O
m/z 201.0533
M8：M8的分子离子峰为262，比脱一氧还原喹乙醇多14Da ，这可能是侧链末端的羟基氧化成羧基生成了羧酸衍生物，M8的碎片离子216是 m/z 262失去HCOOH (测定值 46.0059Da, 理论值46.0055Da)，这表明侧链存在羧基，m/z 216以OH ˙基的形式失去N 上的氧，由图可知，M8的碎片离子205，187，159与M2的一致，因此推断M8为N1－还原喹乙酸。
MS/M7100
200
300
m/z
0.01.02.03.04.0Inten.(x10,000)280.0921
248.1044174.0799
392.1061MSMS/M7 100
200
300
m/z
0.00.51.01.5Inten.(x1,000)245.0762262.0789
219.0404
201.0465
100200
300
m/z
0.00.5
1.01.5
2.02.5Inten.(x100,000)262.0820248.1022
334.2934230.0892
m/z
0.02.5
5.0
7.5
Inten.(x10,000)216.0756199.0719187.0470
m/z 187.0502
3
m/z 159.0553
m/z 205.0608
M9：M9和对照品脱二氧喹乙醇有相同的保留时间和分子量离子峰，其二级质谱的碎片离子也一样，因而确定M9为脱二氧喹乙醇。
M10：M10的分子离子峰为246，比脱二氧还原喹乙醇多14Da ，这可能是侧链末端的羟基氧化成羧基生成了羧酸衍生物，M10的碎片离子171是 m/z 246失去C 2H 5NO 2 (测定值75.0330Da, 理论值75.0320Da)，由图可知，碎片离子145与脱二氧喹乙醇的一致，因此推断M10为脱二氧喹乙酸，即3－甲基喹噁啉2－羧酸与甘氨酸结合物。
100
200
300
m/z
0.01.0
2.0
3.0
Inten.(x100,000)
214.0976 145.0759
169.0756
MSMS/M9 m/z
0.00.51.01.5
2.02.5Inten.(x1,000,000)232.1085
214.0986
MS/M8
MSMS/M8
MS/M9
喹乙醇 7.9 264
246,229,221,212,177,160,143,131, 喹乙醇 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
13.9 16.2 14.8 15.5 17.4 15.4 16.6 17.8 19.1 20.6
248 248 264 264 264 280 280 262 232 246
230,205,161,144 230,213,205,187,159 246,221,203,177,175
246,228
246,229,221,203,177
262,245,237 262,245,201 216,199,187,159 214,199,189,145
171,145
N4-还原喹乙醇 N1-还原喹乙醇 羟基-N4-还原喹乙醇 3-羟甲基-N1- 还原喹乙醇 羟基-N1-还原喹乙醇
羟基喹乙醇 3-羟甲基-喹乙醇 N1-还原喹乙酸 脱二氧喹乙醇 脱二氧喹乙酸
表5总结了喹乙醇代谢物的保留时间、分子离子、碎片离子，以及鉴定的代谢物名称。
4.1 喹乙醇代谢物和代谢途径的分析
代谢物的分离和鉴定是非常复杂和耗时的分析过程，随着分析技术的发展，LC-MS 成为分析代谢物强有力的工具，传统的质谱主要是三重四级杆质谱，但这质谱的灵敏度不高，同时分辨率也不高，由于质谱存在很强的基质干扰，因此对于含量低的代谢物还是不能鉴定。
离子阱质谱能提高灵敏度，同时能做多级质谱，因此越来越用与代谢物鉴定。
时间飞行质谱由于有很高的分辨率，对质量数能精确计算，这样更能准确确定代谢物。
把离子阱和时间飞行质谱结合起来，对代谢物的鉴定是非常准确和快速。
喹乙醇报道有三种还原的代谢物，且这是喹乙醇主要的代谢途径，在本实验中也证明了这点。
喹乙醇的三种还原代谢产物在空白微粒体中（无NADPH-生成系统）也少量的生成，这说明喹乙醇N －O 基团的还原可能是不依赖P450的参与，这还原的机制见第四章。
喹乙醇的侧链末端的羟基可以氧化成羧基，在本实验中找到了N1－还原喹乙醇和脱二氧喹乙醇的羧酸衍生物，但报道在猪体内还存在喹乙醇与N4－还原喹乙醇的羧酸衍生物，这说明可能存在种属差异。
在大鼠肝微粒体中，还找到了五种没报道的羟化代谢物，这些代谢物的量都很
MS/M10
100
200
300
m /z
0.01.02.03.04.0Inten.(x100,000)334.2920
246.0852371.2394214.0953
MSMS/M10
100
200
300
m /z
0.00
0.250.50
0.751.001.25Inten.(x10,000)
145.0715115.0367
226.4320
Fig10 MS and MS 2 spectra of metabolites after incubation with rat liver microsomes. Table 5. LCMS-IT-TOF retention time and fragment ions of olaquindox and its metabolites. Metablite Retention time (min)
[M+H] ( m/z)
Major fragment ions
Identification
低，那在体内的量可能更低，加上那时仪器分析方法的灵敏度达不到，因此就没发现那些代谢物。
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
0.0
1.02.03.04.05.06.0(x100,000)
1:232.1081 (1.00)
1:248.1030 (1.00)
Fig11 EIC of 248 and 232 at control microsomes without NADPH-generating system.
喹乙醇或其代谢物侧链末端的羟基在氧化成羧基的过程种，羟基先氧化成醛基生成中间体，而醛能跟蛋白结合，对机体能造成损伤，在大鼠微粒体中有脱二氧喹乙醛的存在，不过少量的醛在体内能迅速氧化成羧酸。
在大鼠肝微粒体中找到了不常见的N －去乙醇基反应，而没发现酰胺水解的代谢物，更没找到喹乙醇的残留表示物：3－甲基喹噁啉－2－羧酸（MQCA ），酰胺的水解在体内比较缓慢，因此在肝微粒体没找到水解的代谢物，这表明水解酰胺的酶不在微粒体中，也有可能这水解是一个复杂的过程，需要多种酶的参与。
综合喹乙醇与在肝微粒体的代谢物,推导了喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢途径 (Scheme 5) 。
Fig12 The proposed metabolic pathways of olaquindox in rat liver microsomes.。
