喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定

喹乙醇在大鼠肝微粒体中代谢产物的分离和鉴定

刘兆颖，陈冬梅，袁宗辉

华中农业大学国家兽药残留基准实验室

喹乙醇（olaquindox），又名倍育诺、喹酰胺醇，属于喹噁啉类药物，能促进动物生长，提高饲料转化率，具有广谱抗菌作用，可以预防猪的大肠杆菌和痢疾。但由喹乙醇具有生殖毒性、致突变性和光毒性，因被禁止或限制使用。

目前国内外对喹乙醇的代谢研究很少，Spierenbur等（1988）用HPLC检出了猪胃肠道中喹乙醇的三种还原代谢物，即N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇。JECFA报道猪口服喹乙醇(2mg/kg b.w)后，24h内就消除了药量的90%，其中70%是以原形从尿液中排出，血浆最大浓度出现时间是1-2h，表明喹乙醇吸收快，消除也快。给药2天后，检测组织中的放射性，发现肝脏和肾脏分别残留52和110μg/kg，肌肉为9μg/kg，。尿液中存在N1-还原喹乙醇、N4-还原喹乙醇、脱二氧喹乙醇和三种羧酸衍生物，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）在体内消除缓慢，因而被规定为肝肾组织的残留标识物。因此为了更好地了解喹乙醇的代谢特征，本文先用体外代谢方法对其代谢进行研究。

肝微粒体法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。制备肝微粒体一般用差速离心法。肝微粒体体外温孵法与其他的体外肝代谢方法相比，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普及。本文就用大鼠肝微粒体来研究喹乙醇的体外代谢，对其代谢产物的鉴定就用高灵敏度、高质量精度和多级质谱的LCMS-IT-TOF联用技术，首次发现了一些没报道的新代谢产物，完善了喹乙醇的代谢途径，为喹乙醇的毒性研究和残留监控提供了重要的指导意义；同时，为喹噁啉类其它药物的代谢研究提供了重要的参考价值。

1. 实验材料

1.1标准品及标准溶液配制

喹乙醇，含量99.8%，中国兽医药品检查所，批号H050204；

喹乙醇储备液：准确称取26.3mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用少量超纯水溶解，再用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存；

脱二氧喹乙醇，含量98%以上，华中农业大学兽药研究所合成，批号20050831；

脱二氧喹乙醇标准储备液：准确称取23.2mg喹乙醇于10mL容量瓶中，用甲醇定容使之成为10mmol/L的储备液，4℃冰箱避光保存。

1.2试验动物

7周龄Whister雄性大鼠，体重167g-185g，购自湖北疾病预防控制中心实验动物房。实验前禁食12h，期间自由饮水。

1.3试验仪器和设备

电子天平，感量0.000001g，日本SHIMADZU公司；

隔水式电热恒温培养箱，303AS-3型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；

日立CS120GLS超速冷冻离心机；

HITACHI H IMAC CR21G高速冷冻离心机；

Agilent 8453E 紫外可见光谱仪；

意大利Angelantoxi Polar 530超低温冰箱；

美国Millipore-Q超纯水仪；

日本LCMS-IT-TOF，配SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AD 泵、DGU-20A3自动脱气装置、SIL-20AC自动进样器和CTO-20AC柱温箱，LCMS solution Chemstation 工作站。1.4试剂及溶液配制

乙腈，色谱纯，Fisher，批号 064510；

甲酸，分析纯，上海试剂一厂，批号20060403；

氯化镁，分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20060714；

蔗糖，Amresco，批号，3073B95；

低亚硫酸钠，化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号F20060815；

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠（NADP+）Roche，批号2006828；

6-磷酸葡萄糖（glucose 6-phosphate G-6-P），含量98-100%，批号G7250；

6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase G-6-PD），Sigma，含量2000国际单位（U），批号，G8404；

三羟甲基氨基甲烷（Tris Base），Amresco，批号2005616；

乙二胺四乙酸（EDTA），分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司，批号W20051216；

氯化钾，中国医药集团上海化学试剂公司，批号，F041015；

三氯乙酸，含量99%，上海宏瑞化工有限公司，批号20061102；

BCA蛋白测定试剂盒，美国Pierce公司，货号，23225；

Tris-HCl溶液：准确称取30.285mg Tris于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl缓冲液；

Tris-HCl匀浆缓冲溶液：准确称取30.285mg Tris、146.125mg EDTA和42.75mg蔗糖，于500mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至500mL，盐酸调pH值，使成为0.5mmol/L的pH7.4 Tris-HCl（含1mmol/L EDTA、0.25mmol/L蔗糖）匀浆缓冲液，置于4℃保存。

注：以上溶液试验时均在有效期内

2. 实验方法

2.1肝微粒体的制备

用差速离心法制备大鼠肝微粒体。大鼠（n＝3）禁食过夜，脱臼处死后迅速剖开其胸腔和腹腔，取出肝，用Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）反复冲洗除掉组织中的血液成份，称重，按1:4（W/V）加入0.05mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液（含0.15mol/L KCl、1mmol/L EDTA、0.25mol/L蔗糖），用玻璃匀浆器制成肝匀浆。将制备好的肝匀浆在Hitachi micro 120GX超速冷冻离心机上10000g离心20min。取上清液100000g离心60min，上清液即为胞液，淡红色沉淀即肝微粒体。取部分微粒体蛋白以pH7.4 0.1mol/L Tris-HCl稀释，用于测定蛋白含量，其余用Tris-HCl缓冲溶液分装，放入-80℃冰箱中储存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。