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大鼠正常肝脏和癌前病变肝脏微粒体谷胱甘肽 S-转移酶的纯化及其鉴定金宗铉;尹宗柱;林敬务;崔桂花【期刊名称】《延边大学医学学报》【年(卷),期】1990()1【摘要】本文通过 DE_(52)-纤维素和羟基磷灰石柱层析及 GSH-Sepharose-4B 亲和层析法,分离纯化了正常大鼠肝脏和癌前病变肝脏微粒体 GST,得到了三个微粒体 GST 同工酶组分,分别命名为A_1,A_2,A_3.用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得其亚基分子量分别为25000D,26000D,43000D.以 CDNB 为底物按 Habig 方法测定 GST 活性,发现大鼠肝脏癌前病变微粒体同工酶 A_1和 A_2的活性显著增高,而同工酶 A_3在正常和癌前病变大鼠之间无显著差异.本实验结果表明,大鼠肝脏癌前病变组织的微粒体 GST 同工酶组分中 A_1和 A_2显著增高,可作为肝脏癌前病变的酶学指标.【总页数】5页(P5-9)【关键词】谷胱甘肽转移酶;肝脏癌前病变;肝微粒体【作者】金宗铉;尹宗柱;林敬务;崔桂花【作者单位】延边医学院生物化学教研室;延边医学院八五级药学系【正文语种】中文【中图分类】R【相关文献】1.珍珠梅提取物在大鼠肝脏化学致癌初期对谷胱甘肽S-转移酶的影响 [J], 张学武;朴龙;张良和2.大鼠微粒体谷胱甘肽S-转移酶1对苯丁酸氮芥体外致肿瘤细胞毒性的影响 [J], 陈哲;叶子奇;史强;朱丹雁;楼宜嘉3.大鼠正常肝,肝癌前病变组织谷胱甘肽S—转移酶的纯化及部... [J], 诸亚君;李春海4.大鼠肝脏癌前病变组织线粒体谷胱甘肽S—转移酶的... [J], 徐明旭;尹宗柱5.小鼠肝脏微粒体谷胱甘肽-S-转移酶对乙酰氨基酚肝脏损伤模型中的修饰激活机制 [J], 史强;楼宜嘉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中文摘要目的本文通过对SD大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。
方法取15只SD大鼠，180—220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：40%CCL4橄榄油混合液按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周。
B组为对照组：纯橄榄油按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。
病理学检测：HE染色，MASSON染色,PAS染色。
基因学检测：1.3.4型胶原蛋白结果八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性；结论该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。
关键词肝纤维化，四氯化碳，动物模型AbstractObjective: Established animal model of hepatic fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride.Methods: Take 15 SD rats,180-220g, divided into 10 group A, group B 5 只, A group of model group: 40% CCL4 0.12ml/100g by abdominal injection of a mixture of olive oil, twice a week, a total of eight weeks. Group B was the control group: pure olive oil press 0.12ml/100g abdominal injection twice a week, a total of eight weeks, eight weeks later, all rats were fasted for 12 hours were sacrificed, dissected liver tissue. Pathology: HE staining, MASSON staining, PAS staining. Genetics testing: 1.3.4 collagenResults: During the eight-week test group B rats survived, liver tissue specimens clear structure, no exceptions; significant morbidity A rat liver tissue fibrosis S3 have reached above, the majority of samples are split fiber structure visible lobular surrounded pseudo lobule formation, stem cell degeneration visible fat.Conclusion: This method obviously liver injury mortality, the period is short, to be successful as chronic liver damage, liver fibrosis model.Key words: Fibrosis, carbon tetrachloride, animal model前言肝病包括1.慢性病毒性肝炎2.药物性肝炎 3.中毒性肝炎 4.脂肪肝 5.酒精肝 6.肝硬化 7.肝肿瘤 8.肝胆结石 9.肝囊肿大多数肝病伴随着肝纤维化，肝纤维化是威胁人类健康的常见疾病，是各种慢性肝病最重要的病理特征，是发生肝硬化的病理基础，也是原发性肝癌发病的危险因素之一。
大鼠肝星状细胞原代培养实验具体步骤及方法将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
步骤一、实验材料准备1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
肝微粒体代谢肝微粒体代谢是指在肝细胞内的微粒体内进行的代谢活动。
微粒体是一种细胞内的膜包被结构，是肝细胞中重要的代谢活动场所，具有氧化、解毒、合成、分解等多种代谢酶。
本文将从微粒体的结构与功能，细胞色素P450系统、柠檬酸循环等方面对肝微粒体的代谢进行详细介绍。
一、微粒体的结构与功能微粒体是一个直径约0.2~1μm的球形膜包被，由内部核心区域和外部透明区域两部分组成。
核心区域内含有许多含有酶活性的颗粒，称为微半滤泡，是微粒体的重要机能部位。
微半滤泡内含有氧化酶、脱氢酶、羧化酶等多种代谢酶，可以进行多种代谢反应，使微粒体成为肝细胞中重要的代谢活动场所。
透明区域内除了蛋白质外，还含有磷脂、胆固醇和三酰甘油等物质。
微粒体主要有以下3个功能：1. 氧化功能：微粒体内含有多种氧化酶和其他辅助酶，可以将一些有机物质氧化为产生能量或生成活性物质，如柠檬酸循环中的α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸酸激酶、甘油酸磷酸酰转移酶等。
2. 解毒功能：微粒体内含有许多解毒酶，如γ-谷氨酰转移酶、酰转移酶、羟醛脱氢酶、过氧化氢酶和催化酶等，可以将入侵机体的毒素和代谢产物脱除或转化成水溶性物质，有利于排泄出体外。
3. 合成与分解功能：微粒体内含有许多酶，可以合成各种胆固醇、激素、脂肪酸等物质，并降解体内各种废弃物质，如脂肪酸代谢产物、血红蛋白等。
二、细胞色素P450系统细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）是微粒体内最重要的催化酶之一，是许多生物合成和降解反应的关键酶系统。
细胞色素P450酶目前已发现有很多种，分布于不同的组织和细胞。
其中的一部分是肝细胞内的酶，被称为肝微粒体细胞色素P450酶系统。
该系统被认为是微粒体最重要的代谢系统之一，参与了人体内许多生物活性物质的合成和代谢。
1. CYP酶的特点CYP酶是一类蛋白质催化酶，分子量约50 kDa，含有一个有着630~700 nm吸收峰的铁血红素分子，这就是著名的色素P450。
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色步骤如下：（一）固定与修块取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。
6小时左右后用双面刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。
（二）脱水与透明1．75%乙醇50分钟2．85%乙醇50分钟3．95%乙醇（I）30分钟4．95%乙醇（II）30分钟5．100%乙醇（I）30分钟6．100%乙醇（II）30分钟7 1/2二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟8．二甲苯（I）20分钟9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定）若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。
在每一步骤之后，要充分滤干组织块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。
全过程约需要5h。
（三）浸蜡、包埋与修蜡块1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。
2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好，使切面朝下。
不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。
为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。
3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。
（四）切片在载玻片上擦少量甘油蛋白。
可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹匀，呈半干状为佳。
切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。
用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。
每个组织块捞片2张。
过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。
（五）脱蜡、染色与脱水倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓度的影响。
大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响吴双;李登科;李凯明;周明;孙震晓【摘要】目的:研究大鼠肝微粒体代谢对何首乌水提物肝细胞毒性的影响.方法:利用大鼠肝微粒体对何首乌水提物进行体外代谢;将经代谢前后的何首乌水提物溶液冷冻干燥,以不同浓度(相当于生药1.5、3、6、12 mg/mL)分别作用肝L02及HepG2细胞24h及48 h,MTT法检测其对两种细胞活力的影响;HPLC测定何首乌水提物溶液中3种主要成分(二苯乙烯苷、大黄素-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黄素)的含量变化.结果:何首乌水提物代谢后,随着其剂量的增加,对细胞活力的抑制作用逐渐增强,与何首乌水提物未代谢组相比,浓度为12 mg/mL的何首乌水提物代谢组毒性明显降低(P＜0.01).HPLC测定结果显示,何首乌水提物代谢组上述3种主要成分含量均有所降低.结论:何首乌水提物经大鼠肝微粒体代谢后对肝细胞毒性降低,与其主要成分含量降低之间的关系需要进一步研究.%OBJECTIVE:To study the hepatotoxicity of aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix with or without incubation with the rat liver microsome.METHODS:Aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix was incubated with or without rat liver microsome in vitro and then dried by freeze drying.Liver L02 and HepG2 cells were incubated with different concentrations of the freeze-dried extract (1.5,3,6,12 mg/mL) for 24 h,48 h.Cell vitability was assayed by MTT method.In addition,contents of three main components (trans-2,3,5,4'-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucopyranoside,emodin-8-O-β-glucopy-ranoside,emodin) from aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix after incubation were quantitated by HPLC analysis.RESULTS:The aqueous extract without incubation with rat liver microsome showed more toxicityat the concentration of 12 mg/mL than that with incubation (P＜0.01).Contents of the three main components of aqueous extract incubated with rat liver microsome were lower than those without rat liver microsome.CONCLUSION:Hepatotoxicity of aqueous extract of Polygoni Multiflori Radix was decreased after their metabolism by rat liver microsome.The relationship between reduced contents of the main components of the aqueous extract and the reduction of hepatotoxicity need further study for clarification.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2017(029)006【总页数】4页(P450-453)【关键词】何首乌;水提物;肝微粒体;肝细胞毒性;代谢【作者】吴双;李登科;李凯明;周明;孙震晓【作者单位】北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102;北京中医药大学,北京100102【正文语种】中文【中图分类】R285.5中药何首乌(P olygoniMultifloriRadix)是蓼科植物何首乌(P olygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，入药始载于“日华子本草”，有解毒、消痈、截疟、润肠通便之功效 [1]。
大鼠肝细胞原代分离培养方法
（1）麻醉及灌流：将大鼠以7%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉，75%乙醇消毒后移至工作台，0.45mm头皮针连接蠕动泵，打开蠕动泵，调整蠕动泵灌流速度为7ml/min，抽取37℃预热的灌流液I并排空装置内的空气。
打开腹腔，将胃肠结构推向左腹上侧，分离出下腔静脉（肾上段）、肝门静脉，剪开隔膜，动脉夹夹闭下腔静脉肝上段，将头皮针插入下腔静脉（肾上段），动脉夹夹闭固定，打开蠕动泵，灌注37℃预热的灌流液I，确定肝脏均匀膨胀后剪开肝门静脉，继续灌流至肝脏变成土黄色且肝门静脉剪断处流出无色灌流液为止，更换预先预热的37℃灌流液II，直至肝脏表面出现白色裂纹时停止灌流。
剪下肝脏，置于无菌D-Hanks溶液中。
（2）肝细胞的收集：将肝脏在PBS溶液中洗2次，然后放入高糖DMEM培养基中，眼科镊撕开肝包膜，此时肝细胞会分散在培养基中，然后用200目不锈钢细胞筛过滤，将滤液转移至15ml无菌离心管。
（3）肝细胞纯化：将收集的滤液以800rpm离心5min，弃去上清，用高糖DMEM完全培养基重悬细胞，用200目不锈钢细胞筛再次过滤，离心收集细胞沉淀。
用高糖DMEM肝细胞生长培养液重悬细胞。
（4）肝细胞计数及活力检测：取0.1ml肝细胞悬液与0.1ml PBS、0.1 ml40g/l的台盼蓝储备液混合后，用血细胞计数板计数收获的肝细胞总量及存活率。
（5）将肝细胞悬液调整细胞5x105/ml接种于铺有鼠尾胶原的培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
24h后换液，用高糖DMEM肝细胞生长培养液继续培养。
后续隔天换液培养。
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
CYP450 (nmol/mg protein) = (A(450－490) ×1000)/(91 ×C) (2.1)其中，A(450－490)为450 nm 和490 nm 处的吸光度之差，91 为CYP450-CO 结合物的摩尔消光系数，C 为肝微粒体样品的蛋白浓度（mg/mL。
实验五肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定一、目的要求1. 掌握肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450 氧化酶活性测定方法。
二、实验原理外来化学物质在体内的生物转化主要靠肝细胞内滑面内质网上细胞色素P450 酶（CYP450）系进行氧化、还原、水解等代谢。
许多药物对细胞色素P450 酶系活性有抑制或诱导作用，当与其他需经CYP450 代谢的药物联合应用时，会影响这类药物的代谢，从而产生药物相互作用。
制备肝细胞微粒体，并测定其内细胞色素P450 酶系的含量与活性，可为进一步研究外来化学物质物对肝微粒体细胞色素P450 酶系的影响提供依据。
肝微粒体细胞色素P450 酶系活性测定中，本实验首先应用Lowery 法测定肝微粒体蛋白浓度，其显色原理为Flion酚试剂与蛋白质的酪氨酸和色氨酸残基反应所致。
细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法，还原型细胞色素P450 可与一氧化碳结合，在波长450 nm 处出现最大吸收峰，因此可应用紫外分光光度计于波长450 nm 处进行测定，而氧化型细胞色素b5 经还原剂作用后转变成还原型细胞色素b5，在波长423 nm 处呈最大吸收，因此可通过测定还原型与氧化型细胞色素b5 的差示光谱来进行。
三、仪器与试剂实验动物：Wistar 大鼠，雄性，体重212±13 g。
主要试剂：羧甲基纤维素钠，氨基吡啉，红霉素，7-乙氧基香豆素，NADPH，牛血清白蛋白，甲醛。
实验仪器：紫外/可见光分光光度计，荧光分光光度计。
四、实验步骤1. 给药：8 只雄性Wistar 大鼠，给予0.25%羧甲基纤维素钠1 ml，每日灌胃1 次，连续7 d。
d 7，禁食1 夜，次日断头处死。
2. 动物处理与肝微粒体蛋白的测定大鼠断头处死，尽量放出血液，迅速打开腹腔，取出肝脏，用0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖（pH 7.5）洗净表面血污，用滤纸吸去表面血液，称肝重。
将肝脏剪碎，用上述缓冲液洗2 次，充分去除肝脏血液。
按每克肝脏组织加3 ml 缓冲液的比例加入0.15 mol·L-1 KCL-0.2 mol·L-1 蔗糖，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆；10 000×g，4℃离心20 min。
取上清液转移至超速离心管内，105 000×g，4℃离心60 min。
弃上清，淡红色沉淀物即为肝微粒体。
将肝微粒体沉淀取出后用0.05 mol·L-1 Tris-0.25 mol·L-1 蔗糖（pH 7.5）悬浮，经超声细胞粉碎仪混匀后，分装于冻存管中，干冰速冻后，置-70℃冰箱保存。
大鼠肝微粒体蛋白浓度测定：Lowery 法。
3. 牛血清白蛋白标准曲线制备在试管中分别加入0、25、50、100、150、200、250 mg·L-1 系列浓度的牛血清白蛋白溶液1 ml，然后加入5 ml Flion 酚试剂甲混匀，室温放置10 min 后加入0.5 ml Flion 酚试剂乙（1 mol·L-1），立即混匀，30 min 后，以不含蛋白质的试剂空白对照于紫外分光光度计760 nm 波长处扫描。
以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标，OD 值为纵坐标，进行线性回归，求得牛血清白蛋白线性回归方程。
4. 样本中蛋白浓度测定将待测大鼠肝微粒体样本稀释50 倍，加入稀释后样本1 ml，其余同标准曲线操作步骤。
依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。
5. 细胞色素P450 含量测定采用CO 还原差示光谱法。
吸取0.05 mol·L-1 Tris-0.2517mol·L-1 蔗糖溶液5.5 ml，加入稀释为5 mg·ml-1 的待测微粒体悬液0.5 ml 及10%连二亚硫酸钠0.04 ml，立即混匀。
等量分装到两个比色杯中，分别作为对照和样本，于样本池中比色杯充一氧化碳30 s，紫外分光光度计450 nm 向490 nm 扫描。
计算公式如下：nmol·mg-1 蛋白=ΔOD（450 nm-490 nm）×100091×稀释后蛋白浓度（mg·ml-1）__HLM Preparation.To allow for sufficient microsomes to perform all assays, three livers were prepared for each of the three experiments (the force of the first centrifugation, homogenization buffer, and homogenizing strokes). Approximately 10 g of liver per experimental treatment was allowed to thaw in a room temperature homogenization buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.125 M potassium chloride and 1.0 mM EDTA). After transfer to 25 ml of chilled homogenization buffer (plus or minus 0.25 M sucrose in the buffer experiment), livers were minced thoroughly with scissors and homogenized with 10 strokes (6, 8, or 10 strokes in the strokes experiment) using a Teflon-glass homogenizer (870 rpm). Strokes were even and steady, lasting approximately 15 s for passage, except for the first two strokes where greater pressure and time were spent on material on the bottom of the glass tube. The tube was submersed in a small bucket of ice and water during all homogenization. The homogenate was diluted to 4 volumes of sample weight (approximately 40 ml). The samples then were centrifuged at 12,000g (9,000, 10,500, or 12,000gin the force experiment) in a Sorvall RC-5B with a Sorvall SA-600 rotor for 20 min (Sorvall, Newton, CT). The supernatant from the first centrifugation was removed, the mitochondrial pellet was resuspended in 25 ml, and the centrifugation was repeated. The supernatants were combined and centrifuged at 138,000g in a Sorvall Ultra Pro 80 with a Sorvall T-1270 rotor for 60 min. The upper lipid layer was removed and the cytosolic supernatant collected. The microsomal pellet was resuspended in 0.125 M KCl, 0.1 M Tris (pH 7.4) with three homogenization strokes, and the 138,000gcentrifugation for 60 min was repeated. The microsomal pellet was resuspended in incubation buffer with six strokes and brought to a final volume of 26 ml. Samples were stored at −70°C.。
