sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

ＤＯＣ－1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化目的：克隆DOC一1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。

方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录－聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增DOC －1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E.coliBL21，用IPTG诱导表达，OlutathioneSepharose 4B 柱亲和层析纯化重组蛋白。

结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC－1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC－1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS—PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。

结论：成功构建了pGEX-4T-1－DOC－1原核表达载体，表达并纯化出GST－p12重纽蛋白，为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。

标签：p12DOC-1；蛋白；口腔癌缺失；基因克隆；基因表达癌症作为一类严重威胁人类生命的疾病，已成为医学研究关注的重要课题。

口腔癌和身体其他部位癌一样，其发生、发展亦涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。

DOC－1基因是Todd等(1995)利用叙利亚仓鼠口腔颊癌模型分离的正常和恶性角化细胞进行细胞杂交实验分离和证实的一个候选抑癌基因，作为一个候选抑癌基因它具有以下几个特点：恶性角化细胞杂合性缺失；与正常上皮相比恶性上皮中DOC－1表达降低；DOC－1的转入抑制肿瘤细胞的生长；经转染DOC －1 cDNA的恶性角化细胞在动物模型中逆转了恶性表型。

p12蛋白作为其编码的蛋白因子，具有抑制DNA复制，从而抑制恶性角化细胞的生长，使其表型改变的功能，近来已逐渐成为研究的热点。

为了开展对DOC－1的研究，进一步了解其功能及其在口腔鳞状细胞癌中表达缺失机制中的作用，本实验通过RT—PCR获得DOC－1的eDNA编码区序列，并且构建了其克隆表达载体，在大肠杆菌中实现了p12DOC－1重组蛋白的高表达，为以后的工作打下了实验基础。

专利名称：一种结核杆菌重组蛋白及其表达纯化方法和应用专利类型：发明专利
发明人：王洪海,郄亚卿,祝秉东,王九玲,徐颖,王庆忠
申请号：CN200510030776.9
申请日：20051027
公开号：CN1793367A
公开日：
20060628
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属基因重组技术领域，具体为一种抗结核杆菌的重组蛋白，它由抗原Ag85B－Mpt64第190－198位多肽和Mtb8.4基因连在一起，克隆进大肠杆菌载体进行表达，然后进一步纯化获得。

记为Ag85B－Mpt64－Mtb8.4(SEQ.ID.NO.1)。

该蛋白可以用作抗结核杆菌亚单位疫苗。

申请人：复旦大学
地址：200433 上海市邯郸路220号
国籍：CN
代理机构：上海正旦专利代理有限公司
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HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定邱会平;程晓东;卢春【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)004【摘要】目的:在大肠埃希菌中表达人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活蛋白(trans activative transcription protein,Tat),为进一步研究可溶性Tat在艾滋病相关卡波氏肉瘤(AIDS-KS)致病过程中的作用提供材料.方法:以本实验室保存的重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat101为模板,PCR扩增目的基因Tat.将PCR产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-Tat.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定后,通过镍亲和层析柱纯化.纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证.结果:限制性内切酶酶切和基因测序证实,成功构建了含有Tat基因的重组原核表达质粒.蛋白质印迹结果显示,His融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达,纯化后获得了相对分子质量为18×103的融合蛋白.虫荧光素酶报告实验证实,Tat与HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)具有结合能力.结论:重组质粒pET-28a(+)-Tat能在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定表达Tat蛋白,镍亲和层析柱纯化的His-Tat融合蛋白具有生物学功能.%To construct the prokaryotic expression vector carrying HIV-1 Tat gene and to purify the fusion protein in E.coli.Methods:The DNA fragment of the Tat gene from pcDNA3.1(+)/Tat101 was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+),named pET-28a(+)-Tat.Then the recombinant vector was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expression of the histidine-tagged (His-Tag)fusion protein was induced with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG).The fusion protein was detected and purified by Western blot and immobilized Ni2+ absorption chromatographic column,respectively.Results:The prokaryotic expression vector carrying Tat gene was successfully constructed.The expression of the His-Tag fusion protein in E.coli BL21 (DE3) was detectable.Finally,the fusion protein with the relative molecular weight of 18 × 103 was gained after purified using the affinity chromatographic column.Conclusion:Recombinant Tat gene can be expressed in E.coli BL21 (DE3) and the fusion protein obtained can be functionally active.【总页数】5页(P308-312)【作者】邱会平;程晓东;卢春【作者单位】南京医科大学基础医学实验教学中心,江苏南京210029;南京医科大学微生物学与免疫学系,江苏南京210029;南京医科大学微生物学与免疫学系,江苏南京210029【正文语种】中文【中图分类】R34;Q78【相关文献】1.抗凋亡融合蛋白 PTD－Bcl－xL 原核表达载体的构建及表达纯化 [J], 王晓晔;石博妹;王英群;李珣;刘徳玉;李铭;李芳芳;胡传活2.β分泌酶原核表达载体的构建、表达及融合蛋白纯化 [J], 朱爱华;李敬;陆军;钱进;郑元林3.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春4.含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测 [J], 卢春;钱超;唐桂霞;黄丽;曾怡5.融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化 [J], 戚华兵;汪仕良;王凤君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人β肌动蛋白基因原核表达载体的构建及其表达和纯化宋烨琼;郭靖;徐小洁;李玲;梁迎春;洪甜;纪贝贝;叶棋浓;吕朝晖【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2015(026)006【摘要】目的:构建带GST标签的人β肌动蛋白(β-actin)基因的原核表达产物,纯化出GST-β-actin融合蛋白,为探究β-actin的各项生理功能做准备.方法:以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增β-actin基因,将其连接到带有GST标签的载体上,经鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate感受态细胞,小量诱导表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-β-actin融合蛋白,经SDS-PAGE和Western印迹检测.结果:目的基因经PCR技术得以扩增,将其与带GST标签的载体连接后再经双酶切鉴定及测序后确认构建成功;转化大肠杆菌Rossate感受态后获得小量诱导表达,纯化出GST-β-actin融合蛋白,并证实其有生物活性.结论:构建了人β-actin的原核表达载体,并获得了GST-β-actin融合蛋白.【总页数】3页(P783-785)【作者】宋烨琼;郭靖;徐小洁;李玲;梁迎春;洪甜;纪贝贝;叶棋浓;吕朝晖【作者单位】解放军总医院内分泌科,北京100853;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;军事医学科学院生物工程研究所,北京100850;解放军总医院内分泌科,北京100853【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.人NDRG2两亚型基因原核表达载体的构建及表达与纯化 [J], 牛锋;邓艳春;秦娜;刘新平2.人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化 [J], 张玲;高军;李兆申;杜奕奇;龚燕芳;黄文;金晶;吴洪玉;满晓华3.人IL-24基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化 [J], 喻放;杨忠华;范汉东;左振宇4.人源DCF1基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化 [J], 王倩;杨眉;冯瑞丽;王娇;文铁桥5.APEC毒力基因ygeG的原核表达载体构建、表达纯化及鉴定 [J], 姜楠;郑倩倩;李倩文;涂健;宋祥军;邵颖;刘红梅;祁克宗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组蛋白的表达与纯化技术研究随着基因工程和生物技术的发展，重组蛋白的表达及纯化技术在生物医药领域得到了广泛应用。

重组蛋白是通过将目标基因转移到宿主表达系统中，利用宿主细胞表达并合成特定蛋白的技术。

表达后的蛋白需要经过纯化、鉴定和活性分析，以确保获得高纯度和高活性的蛋白。

本文将介绍重组蛋白的表达与纯化技术研究的相关内容。

重组蛋白表达技术是通过将目标基因克隆到表达载体中，然后将表达载体转入宿主细胞中进行表达。

常用的表达系统包括大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。

在选择表达载体时，需要考虑载体的复制数、启动子的强度和宿主细胞的适应性。

而在选择宿主细胞时，需要考虑宿主细胞的生长特性、表达能力以及宿主细胞的酶切位点等因素。

表达载体和宿主细胞的选择将直接影响重组蛋白的表达水平和纯化效果。

在重组蛋白的表达过程中，除了选择适合的表达系统外，还需要优化培养条件和表达工艺。

培养基的组成、培养温度、培养时间、诱导条件等因素都会影响蛋白的表达水平和纯度。

常见的优化方法包括调整培养基的成分、优化培养条件和诱导条件、构建工程菌株以及使用辅助因子等。

通过合理的优化，可以提高蛋白的表达水平和纯度，为后续的纯化工作奠定基础。

重组蛋白的纯化是确保蛋白质高纯度和高活性的关键步骤。

常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流色谱和层流洗脱等技术。

亲和层析是通过目标蛋白与特异性结合剂之间的亲和力选择性地捕获目标蛋白。

离子交换层析是利用蛋白质与带电离子交换剂间的相互作用进行纯化。

凝胶过滤层析则是根据蛋白分子大小进行分离纯化。

逆流色谱和层流洗脱则是利用目标蛋白与静电荷间的相互作用进行分离。

通过合理选择和组合这些方法，可以获得高纯度和高活性的重组蛋白。

在纯化过程中，还需要进行蛋白质的结构鉴定和活性分析。

结构鉴定可以通过质谱分析、核磁共振、X射线晶体学等技术来实现。

活性分析则是通过特定的活性测定方法来验证蛋白的功能和活性。

ＰＡＰ的内化，提高其抗病毒效果。

由于编码ＰＴＤ的１０个氨基酸的核苷酸序列仅为３０ｂｐ，本实验采用在引物中直接引入该编码序列的方法实现ＰＴＤ与ＰＡＰ的基因重组。

同时引入在两个引物（Ｐ１和ＩＣ。

２）中分别构建原核大肠杆菌表达中所需的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ酶切位点。

具体步骤详见图１。

ＰＴＤ－ｐｒｉｍｅ吖ＣＧ曼昼盘里￡９＿岫ＨＤＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＴｅＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧ）ＰＴｎＰＡＰ图１．ＰＴＤ－ＰＡＰ的合成模式图通过ＰＣＲ扩增，用ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加Ａ后电泳得到了约８００ｂｐ的扩增片段。

回收后的片段与ｐＰＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ连接。

转入大肠杆菌ＤＨ５Ｑ中，经蓝白筛选，选取白色菌落行ＰＣＲ鉴定见可扩增出约８００ｂｐ的片段；提取ＰＣＲ阳性菌株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约８００ｂｐ和３Ｋｂ处两条条带（见图２）。

株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约１Ｋｂ和３Ｋｂ处两条条带（图４）。

图４ｐＰＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ／ＴＡＴ－ＰＡＰ重组体酶切图示：１．分子量标准为ＢＬ２０００：２．酶切片段。

图中可见酶切下略大于１Ｋｂ片段，相当于Ｔａｔ加上ＰＡＰ序列的大小，支持二者重组成功。

将酶切鉴定阳性菌株质粒测序示ｒＩ钒序列和ＰＡＰ序列正确连入ｐＰＧＥＭ．ＴＶｅｃｔｏｒ中。

１．３．２Ｔａｔ与ＰＡＰ的基因重组体中Ｔａｔ显性负突变体的构建前期的工作共获得的ＨＩＶ的Ｔａｔ显性负突变体共六个：ｐＭｌ：Ｃｙｓ２２＋Ｇｌｙ；ｐＭ２：Ｈｉｓ３３／Ｃｙｓ３４一Ａｌａ／Ｓｅｒ；ｐＭ３：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１一Ａｌ矶～ｌａ；ｐＭ４：Ｌｙｓ５０一ＳＴＯＰ；ｐＭ５：Ａｒ９５２一Ｌｅｕ；ｐＭ６：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１／Ｃｙｓ５０一Ａｌａ／Ａｌａ／ＳＴＯＰ。

之后验证了突变Ｔａｔ对ＨＩＶ－１Ｔａｔ活性的影响：结果说明不同Ｔａｔ突变蛋白都对正常Ｔａｔ有一定程度的抑制作用，其中以ｐＭ５最大，达８５％，另外ｐＭ３可达４０％。

基因工程重组蛋白的表达与分离纯化实验目的：1.了解基因工程重组表达载体的构建和筛选方法；2.掌握重组蛋白诱导表达的机理；3.掌握蛋白的分离纯化方法，并学会使用SDS-蛋白质凝胶电泳；实验原理：将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30表达载体中，让其在E.coli中表达。

先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。

然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。

表达蛋白可经SDS-PAGE检测。

实验器材：1.仪器：高速冷冻离心机、恒温培养箱、高压灭菌锅、SDS-凝胶电泳仪、水浴锅、抽滤装置、AKTA液相色谱仪等；2.材料：LB培养基、溶菌酶、缓冲液A和B、氨苄青霉素、IPTG诱导剂、10%SDS等；实验内容：1.灭菌：①配置LB培养基20 ml*2 +100 ml*6(配方：酵母粉 0.5%，NaCl 1%，胰蛋白胨1%)；②黄、蓝枪头各一盒；2.菌体活化及扩培：①每瓶20 ml LB培养基中加入20 ul Amp后，再加入30~40 ul DH5α菌液，置于37℃恒温箱内，培养12~16 h；②活化后，在六瓶100 ml LB培养基中分别加入100 ul Amp后，再从20 ml活化后的菌液中取2 ml，置于37℃恒温箱内扩大培养，至少培养2.5 h以后加入IPTG 200ul，37℃，培养14~16h；3.细胞破碎及蛋白分离：①将菌液用大离心管收集，配平后，4000r/min，离心15 min，收集菌体；②用20 ml BufferA重悬菌体，4000r/min，再离心15 min，收集菌体；③用4 ml BufferA重悬菌体，加入溶菌酶40 ul混匀，静置15min；④再加入4 ml BufferB，混匀，75℃水浴保温1 h；⑤用高速冷冻离心机在4℃的条件下，8000r/min，离心20 min，收集上清液；⑥将上清液分装入几个浓缩管中，4℃，3000r/min浓缩一段时间至终体积为5-10ml，做好标记，备用；⑦实验过程中，配置五种AKTA液相色谱仪所需液体，并抽滤2遍；4.AKTA液相色谱分析及SDS凝胶电泳：①首先学习AKTA仪器的相关使用方法和注意事项，对仪器进行排气，平衡缓冲液冲洗等操作(该部分由老师操作演示)；②取5 ml浓缩后的液体过滤后上样，观察屏幕上紫外吸收曲线的变化，适时用离心管收集每个峰的样品，做好标号，备用。