原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位与功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不与哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株与与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性与构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。

（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

原核表达和真核表达原核表达的步骤和主要试剂1、获得目的基因；2、构建重组表达载体；3、获得含重组表达质粒的表达菌种；4、诱导表达；5、包涵体的分离。

获得目的基因 PCR法钓基因引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)RT-PCR法获取基因Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）真核表达蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。

真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。

各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。

原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。

本文将详细介绍原核表达的步骤。

1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。

RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。

在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。

2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。

这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。

在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。

这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。

3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。

翻译是在核糖体中完成的。

核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。

核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。

起始密码子是AUG。

核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。

终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。

翻译完成后，成品蛋白被释放出来。

4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。

这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。

这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。

5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。

这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。

分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。

蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。

6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。

这个过程由信号肽和其他分子机器完成。

信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。

原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。

这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。

理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。

本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。

1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。

2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。

(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。

以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。

4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。

5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。

6. 重复步骤5。

将离⼼管中的⽔倒⼲净。

（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。

⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。

2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。

样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。

原核表达步骤一、转录（Transcription）转录是指DNA转录为RNA的过程，即DNA的信息通过RNA的合成而表达出来。

转录是生物体中基因表达的第一步，也是生物体合成蛋白质的关键步骤之一。

在原核生物中，转录过程分为三个阶段：启动、延伸和终止。

启动阶段是指RNA聚合酶（RNA polymerase）与DNA的结合，并在DNA上找到起始转录位点。

延伸阶段是指RNA聚合酶沿DNA模板链向下滑动，并合成RNA链。

终止阶段是指RNA聚合酶在遇到终止信号时停止转录，释放出合成的RNA链。

二、剪接（Splicing）剪接是指在转录过程中，将RNA前体分子中的内含子（intron）剪切除去，将外显子（exon）连接起来的过程。

原核生物中的剪接方式相对简单，通常是直接将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子。

剪接的主要作用是消除内含子的干扰，使RNA分子能够直接参与翻译过程。

通过剪接，原核生物能够快速生成成熟的RNA分子，提高基因表达效率。

三、翻译（Translation）翻译是指将RNA的信息翻译成蛋白质的过程。

在原核生物中，翻译过程发生在核糖体（ribosome）中，涉及到mRNA、tRNA和rRNA等多种分子。

翻译分为三个主要步骤：启动、延伸和终止。

启动阶段是指核糖体与mRNA的结合，并识别起始密码子（AUG）位置。

延伸阶段是指核糖体沿mRNA滑动，将氨基酸依次加入正在合成的多肽链中。

终止阶段是指核糖体在遇到终止密码子（UAA、UAG、UGA）时停止翻译，释放合成的多肽链。

四、调控（Regulation）调控是指控制基因表达水平的过程，包括转录调控和翻译调控两个方面。

原核生物通过调控转录和翻译过程中的各个环节来实现基因表达的精确调控。

转录调控主要通过转录因子（transcription factor）和启动子（promoter）之间的相互作用来实现。

转录因子能够结合到启动子上，促进或抑制RNA聚合酶的结合，从而调控基因的转录水平。

原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

1.引物的设计及合成2.基因的克隆: PCR反应PCR产物的回收和纯化PCR产物的酶切3.质粒pET-32a的扩增、提取及酶切接种含有pET-32a空质粒的DH5α的菌株至LB (含有Amp l00ug/mL)中，37℃培养过夜。

取5mL菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，酶切提取出的质粒，-20℃保存。

4.重组原核表达质粒的构建：4.1重组质粒的连接4.2感受态细胞的制备和转化：参照《分子克隆实验指南》的方法进行BL21感受态细胞的制备[16]。

在平板上挑取新鲜的BL21菌落，接种到5mLLB培养基中，37℃振荡培养2~5h，OD600达到0.35～0.5之间，取l～2mL菌液于无菌离心管中，冰上放置至0℃，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，用200uL CaCl2(0.1M)重悬，冰上放置30min，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，0.1M CaC12100uL重悬，4℃放置备用。

4.3重组质粒转化感受态细胞：将10uL重组原核表达质粒加入到100uL的BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，将离心管放入42℃水浴中热休克90s，立即将离心管冰浴5~10min，每管加入800uL的LB培养基，然后放入37℃摇床中100rpm培养45min，取出离心管5000rpm离心5min，弃去600uL上清，将沉淀的细菌混匀并涂布氨卞抗性的LB平板，涂布后正置30min后倒置于37℃培养箱中，培养12~16h。

4.4 重组质粒的鉴定4.4.1 PCR鉴定：挑取抗性LB平板上长出的BL21重组菌，并接种LB培养基中(含Amp100ug/mL)，37℃、200rpm摇振培养3~5h，PCR鉴定。

4.4.2 酶切鉴定：应用限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，通过双酶切鉴定目的基因有无插入及大小是否正确。

酶切结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。

4.4.3重组质粒基因序列测定：挑选PCR检测条带亮，酶切鉴定正确的菌株测序。

原核表达技术原核表达技术是一种用于在原核生物中实现外源基因表达的技术。

原核生物是一类没有真核生物细胞核的微生物，包括细菌和古菌。

原核表达技术的发展为基因工程和生物技术领域提供了重要的工具和平台。

原核表达技术的基本原理是将目标基因转移到原核生物宿主细胞中，并在宿主细胞内进行转录和翻译，从而实现目标基因的表达。

这一过程通常包括以下几个步骤：选择适当的表达载体、构建重组表达载体、转化宿主细胞、选择阳性克隆并进行表达分析。

在选择适当的表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起点、选择标记和表达调控元件等因素。

常用的表达载体包括质粒和噬菌体。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在宿主细胞中自主复制并表达外源基因。

噬菌体则是一种病毒，可以利用宿主细胞的复制和转录机制来实现基因的表达。

构建重组表达载体是原核表达技术中的关键步骤。

通过酶切和连接技术，将目标基因插入到表达载体中的适当位置，确保基因的正确表达。

此外，还可以利用引物设计和PCR技术来扩增目标基因，以获得足够多的DNA材料。

转化宿主细胞是将重组表达载体导入原核生物宿主细胞的过程。

转化方法主要包括化学转化、电转化和热激转化等。

其中，化学转化是最常用的方法，通过改变细菌细胞壁的通透性，使得DNA能够进入细胞内。

选择阳性克隆并进行表达分析是对转化后的细菌进行筛选和鉴定。

常用的筛选方法有抗生素筛选和荧光筛选，通过检测细菌对抗生素的抗性或荧光蛋白的表达情况，可以筛选出带有目标基因的阳性克隆。

表达分析则可以通过蛋白质电泳、酶活性测定和免疫印迹等技术，来验证目标基因的表达水平和功能。

原核表达技术具有许多优点，使其成为研究和应用领域的重要工具。

首先，原核生物的生长速度快，培养成本低，易于大规模生产目标蛋白。

其次，原核表达系统可以实现对目标蛋白的定向表达和高效纯化，为后续的研究和应用提供了便利。

此外，原核表达系统还可以用来研究和揭示蛋白的结构和功能，以及进行药物筛选和疫苗研发等。

原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。

这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。

原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。

（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。

2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。

原核表达实验原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。

实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。

在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。

2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。

常用的有温度诱导和药物诱导。

本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。

不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。

主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

c. 10 mg / mL 溶菌酶。

d. 脱氧胆酸。

e. 1 mg / mL DNase I。

2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。