基因克隆原核表达-2002

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外源基因原核系统克隆表达的基本流程

外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。

2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。

3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。

4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。

5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。

6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。

7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。

8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。

9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。

10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。

这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。

人胱抑素C基因的克隆和原核表达

激素的影响［Ｊ］．中国医学创新，２０１２，９（３）：８８－８９．
ＦＳＨ和ＨＣＧ包被ＥＬＩＳＡ板，ｈＴＳＨＭｃＡｂ与它们反应的０Ｄ４５０．，．值为０．０５８６— ０．０６０８，与ＯＶＡ（卵清蛋白）包被空白对照孔值相近，表明无明显的交叉反应。
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｅｐａｒａｉｔｏｎｍｅｈｔｏｄ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，１９８１，２７：
３讨论
自从单克隆抗体问世以来，已在医学和兽医学研究领域中得到了深入发展，并且成效显著，尤其是在疾病的预防、诊断和治疗中更是功勋卓著。相比于多克隆抗体，单克隆抗体
射免疫学杂志，２００５，１８（２）：１４６－１４７．［２］ＤａｙａｎＣＭ．Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｉｔｏｎｏｆｔｈｙｒｏｉｄｆｕｎｃｉｔｏｎｔｅｓｔｓ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，
２５：１４７６－１４７９．
ＴＳＨ结构类似物ＴＳＨＬＨＦＳＨＨＣＧ空白对照（ＯＶＡ）平均吸光值ｘ１．１０８９０．０６０８０．０６３６０．０５８６０．０５４８
．
．
—
—
７６６．． — —
２０１３年第２６卷第６期ＪｏｆＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０１３，２６（６

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜【摘要】[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27%的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2010(047)012【总页数】5页(P2505-2509)【关键词】serC基因;pEC7;基因克隆;原核表达【作者】赵忠润;包慧芳;王宁;周亚飞;杨慧;王炜【作者单位】石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091;新疆农业科学院微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;石河子大学生命科学学院,新疆石河子,832000;新疆农业科微生物应用研究所,乌鲁木齐,830091【正文语种】中文【中图分类】S188+.20 引言【研究意义】L-丝氨酸(L-Serine)化学名为2-氨基-3-羟基丙酸,是一种生糖氨基酸。

人胰岛素样生长因子_1基因的克隆及其表达_吴岚晓

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆及其表达吴岚晓1,李明2,王萍2,陈白虹2(1.第一军医大学珠江医院血液科,广东广州510282;2.第一军医大学热带病研究室,广东广州510515)摘要:目的获得大量高纯度、具有生物学活性的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1),构建hIGF-1原核表达载体,并进行表达与纯化。

方法以pUCIGF质粒为模板,PCR扩增了hIGF-1基因。

经适当酶切后,构建表达载体pRSE T-IGF,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并经阴离子交换色谱、疏水色谱和凝胶过滤纯化。

结果带有重组质粒p RSE T-IGF的大肠杆菌经IPTG诱导后,以可溶性形式表达7.8kD大小的蛋白,其表达量占菌体总蛋白量的10%~20%,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,Western印迹表明重组蛋白具有hIGF-1抗原活性。

结论构建了pRSE T-IGF重组质粒,并成功地在大肠杆菌中获得可溶性表达,为获得大量基因工程产品奠定了基础。

关键词:胰岛素样生长因子-1;基因克隆;原核表达中图分类号:Q78;R977.15文献标识码:A文章编号:1005-1678(2002)01-0001-03C loning and expression of human insulin-like growth factor-1gene in E.coliW U Lan-xiao1,LI Ming2,WANG Ping2,C HE N Ba-i hong2(1.Department o f Hematology,Zhujiang Hos pital,First Military Medical U niversity,Guangzhou510218, China;2.Department o f Tro pical Disease,First Military Medical University,Guangzhou510515,China)Abstract:Purpose The aim is to get sufficient quantity of pure biologically human Insulin-like growth facto-r1(hIGF-1),and hIGF-1e xpression vector was constructed and expressed in E.coli.Methods The hIGF-1DNA fragment was obtained from the pUCIGF plasmid by PCR amplification.After being digested by restriction enzyme,the DNA fragment was cloned into a prokaryotic expression vector pRSE T B and hIGF-1ex-pression vector pRSE T-IGF was constructed.After it was expressed in the host cells E.coli B L21(DE3),the recombinant protein was purified by anion chromatography,hydrophobic chromatography and gel filtration.Re-sults SDS-PAGE analysis suggested the bacteria c ontaining the recombinant plasmid produced a protein of7.8 kD as induced by IPTG.The recombinant hIGF-1was expressed in soluble form,consisting of10%~20%of the total bacterial proteins.After purification,the target protein could be purified up to95%.Western blot indicated that the protein could react with antibodies a gainst hI GF-1.Conclusion The results demonstrate that hIGF-1e xpression vector has been successfully constructed and could be expressed in soluble form in E.coli.Key words:I GF-1;gene cloning;prokaryotic expression胰岛素样生长因子-1(Insulin-like gro wth factor-1, I GF-1)是一种多功能内分泌调控细胞因子,因在结构上与胰岛素原具有高度的同源性而得名。

乐至黑山羊肾溶菌酶基因克隆及原核表达

乐至黑山羊肾溶菌酶基因克隆及原核表达胡宇飞;江明锋;张鹏;罗樊;朱莲莲;王永【摘要】本研究对乐至黑山羊肾溶菌酶(LZLyK)基因进行了克隆、表达,并对其活性进行了测定.采用比较基因组技术,成功克隆了LZLyK基因,其cDNA长444 bp,编码147个氨基酸.同源性分析结果表明,氨基酸同源性与绵羊溶菌酶2(M32498.1)最高,达96.9％.构建原核表达质粒pET-LZLyK,转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达.SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白LZLyK得到正确表达,分子质量约为16、30 ku.采用比浊法测定了LZLyK蛋白的活性,其活性为15 U/mL,表明LZLyK蛋白具有一定抗菌活性.运用实时荧光定量PCR发现在乐至黑山羊肝脏、肾脏、气管和皱胃中均有肾溶菌酶基因的表达,在胃中表达量较高.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)009【总页数】6页(P46-51)【关键词】乐至黑山羊;肾溶菌酶基因;克隆;原核表达【作者】胡宇飞;江明锋;张鹏;罗樊;朱莲莲;王永【作者单位】青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】Q78溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种有效的抗菌蛋白，能切断肽聚糖中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，从而引起细胞裂解(Masschalck等，2003)。

鸭茅斑驳病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

驳病毒的研究报告．本文利用Ｒ－ＣＴＰＲ技术成功
扩增了日本分离株的Ｃ基因，并与已报道的ＰＣＭＶ２个分离株的ＣｆＰ基因序列进行了比较，同时利用原核表达系统将该基因在大肠杆菌中高效
（２０１０８０）助ＫＷ０３０２１２资
＊通讯作者，－ｉｅｙｎ９１６ｃｒ＊Ｅｍａｌｉｕ３＠２．ｏ：／ｎ
维普资讯
ｌ８２
色Ｋｇ４￣ｇ第１卷第１２０生１、ｔ＇ｔ－７期月３７
鸭茅（ｃｙｉｇｏｒｔ）冷季型禾本科ＤａｔｌｌｍｅａａＬ．为ｓ
牧草，在北美已有２０多年的种植历史［，近年０１］
Ｂ２（Ｅ）ＬｓＬ１Ｄ３ｐｙ，克隆载体ｐＵＣ１，Ｔａ９ｑ酶，硝酸纤维素膜，抗ＧＳ单克隆抗体，羊抗鼠ＩＧＴｇ－
分别购自Ｐｏｇｒｍｅａ公司和宝生物（连）程有限大工
公司．
鸭茅斑驳病毒首先由Ｍａｉｅｋｎｎ等［于１９８９５年发现和报道，随后Ｒａｏｙｂｖ等［于１９６９６年再次分离到该病毒，Ｔｏｉａ等［于２０ｒｍａ９ｙ００年也对该病毒作了报道．但到目前为止，我国尚未见过鸭茅斑
表达．
梯度离心纯化病毒．取３Ｌ病毒提取液与等体积０

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。

以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。

质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。

2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。

这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。

3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。

选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。

4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。

这一步通常涉及DNA 连接酶。

5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。

这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。

质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。

6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。

这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。

7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。

8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。

这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。

9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。

这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。

整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。

这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。

花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定

花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定易海涛;刘志刚;闫浩;刘芳;赵郭存;夏立新【期刊名称】《江西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(034)005【摘要】通过提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h2.02基因,将反转录的基因连入pMD19-T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-32a(+)上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导表达、Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生Ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与GenBank 中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的IgE结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.【总页数】5页(P531-535)【作者】易海涛;刘志刚;闫浩;刘芳;赵郭存;夏立新【作者单位】深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060;深圳大学,医学院,过敏反应与免疫学研究所,广东,深圳,518060【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达 [J], 詹少德;邱昌将;朱盼;吴志华;陈红兵2.花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定 [J], 易海涛;刘志刚;刘芳;闫浩;汤慕瑾;肖小军;夏立新3.花生过敏原Ara h1蛋白的原核表达及致敏性分析 [J], 史云凤;张彤;陈沁4.粉尘螨过敏原Der f 35的克隆表达及免疫学鉴定 [J], 陈扬;陈献雄;欧阳春艳;钟永浩;刘晓宇5.花生主要过敏原Ara h 1线性B细胞表位的预测及鉴定 [J], 王俊娟;李欣芮;陈成;孙善峰;刘桂蓉;车会莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人IL-1Ra基因的克隆及原核表达的研究

通过Ｒ — ＣＴＰＲ从人的胎盘组织中克隆了人，—Ｒ基因，使其在大肠杆茵Ｄ５ｔＬＩａＨｃ中重组表达。结果表明，克隆到了
４０ｂ６ｐ左右的目的基因，并在大肠杆菌中成功表达了１ｕ８ｋ左右的目的蛋白，目的蛋白在大肠杆菌中表达量占总
蛋白２％左右，为Ｉ－Ｒ的进一步研究及应用奠定了基础。０Ｌ１ａ关键词：人Ｉ— Ｒ；基因重组；原核表达Ｌｌａ
中图分类号：Ｑｏ５３
文献标志码：Ａ
文章编号：１０ — ３９２１）３０４ — ５０５９６（０１０ — １００
白的表达情况。阴性对照为在同等条件下３０℃培养的菌体，具体制样过程见１１。．１
。
以上连接体系１６℃反应３ｉ转化０ｍｎ后
（自Ｔａｇｎ购ｉｅ博迈德生物）ｎ；其他试剂均为Ｓｇａｉｍ公
司或国产分析纯生化试剂。
１Ｐ．４ＣＲ引物
Ｘ１Ｂｕ感受态细菌，３Ｌ一ｌｅ７℃培养过夜。
１表达质粒的构建．９
１１重组蛋白诱导表达－Ｏ
根据已报道的人Ｉ～ＲＬ１ａ基因序列ｇ：２７ｉ３５６的
成熟肽设计ＰＲ引物，引物在Ｉ酶切位点，３物中导人Ｐｔ吲ｃ吲ｓＩ酶切位点（划线部分）。
３引物：５ＣＧＡＴＣＣＴＣＴＣＧＡ ’ ’ＴＣＧＣＡＴＧＣＣＴＧ

人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达

人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达张承武;蔡青松;庄旭;翟朝阳;郑煜【期刊名称】《中华医学遗传学杂志》【年(卷),期】2002(019)006【摘要】目的克隆人脑源性神经营养素-6(neurotrophin-6,NT-6)基因,并观察其在大肠杆菌中的表达情况.方法从流产胎儿大脑皮层提取总RNA,用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT-6基因cDNA片段;经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒,构建NT-6 的表达载体.通过诱导,使NT-6基因在大肠杆菌中表达.结果分离克隆了人脑源性NT-6基因,含该基因的大肠杆菌在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的情况下,表达了特异性的蛋白质.结论人脑源性NT-6基因的克隆表达为进一步研究NT-6的结构、功能及临床应用奠定了基础.【总页数】4页(P475-478)【作者】张承武;蔡青松;庄旭;翟朝阳;郑煜【作者单位】610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室;610041,成都,四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R394【相关文献】1.猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达2.人脑源性神经生长因子基因克隆及其在大肠杆菌中的表达3.生姜蛋白酶基因的克隆及在原核细胞中的表达4.人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测5.人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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（二）体外重组
连接体系的建立：
• 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数 =1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
原位杂交 2、鉴定：• 长度 Nhomakorabea定：酶切、PC、不同组织的cDNA不相同• 基因总量少，易筛选
4、PCR扩增目的基因片段
• 适用于克隆序列清楚的基因
• 以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难 • 多采用以mRNA为模板的RT-PCR法
5、人工合成较短的DNA 6、差异显示法(differential display, DD)—筛选差异表达的基因
位相载体----含有3种读码框的系列载体
3、优点：
• 表达效率高
• 产物稳定
• 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 • 易纯化：利用融合原核多肽的特性
融合型载体----pGEX系列
Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：
pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
二．原核生物基因结构和表达特点
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。
多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA
EcoRI BamHI
----ATG ---- AAC CTG GAA TTC CTA GGT ------TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT
TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
5、原核生物中参与转录的基因结构： • 启动子
•
终止子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T硷基对
• 共有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录
• 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列
终止子（terminator，T）:位于基因3’ 端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
•富含GC的反向重复序列
•富含AT的序列
转录形成发夹式结构
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统
4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位
• 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 • 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 • 包括：调控区(调节基因，启动基因，操作基因)、结构基因：
6、差异显示
1、直接物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组、人工接头连接
人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段
4、T-A克隆
• T-vector两条链的5’端含有一个游离的T • PCR过程中，增加延伸时间，Taq酶可在产物的3’端多加一个A
五、基因克隆的工作流程（一）目的基转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）：
•
• •
AUG上游3-11 bp
长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列
三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：
1.
2. 3. 4.
删除内含子和5’非编码区
外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解
所需元件：
限制性内切酶
连接酶
载体
受体细胞
基因克隆（分子克隆molecullar cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。
基因克隆的核心-----体外重组 (Recombination) : 人工将一段目的 DNA插入一个载体的过程。
pGEX-3T---X因子
位相载体
（二）非融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
非融合型表达载体
非融合基因
主要元件：强启动子
SD：
ATG：第一个密码子
非融合型表达载体----pPL-Lamda
PL启动子---温度诱导
插入位点--HpaI
（三）分泌型表达载体： 1、主要元件：启动子和SD序列
2、基因剂量：
3、核糖体结合位点：
• SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。
•
•
AUG—SD间距离。
AUG后的核苷酸
四．原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。
• 主要元件：强启动子
SD顺序筛选标志
其它调控基因
• 类型：
融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白
信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
分泌型融合表达载体----pEZZ18
五．提高表达水平的手段 1、选择合适载体 • 强启动子----提高转录水平
• 核糖体结合位点（ATG---SD）
• 避免产物降解：分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂
• 方向鉴定：联合酶切
• 测序
原核基因表达系统
一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。
基因的克隆与表达
山东大学医学院免疫学研究所马春红
基因克隆(gene clonging)
基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因克隆
Gene Cloning
概述
克隆载体
受体细胞体外重组的策略
基因克隆工作流程
一、概述
1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌
•构建流程抽提基因组DNA 鸟枪法制备DNA片段 DNA片段与载体重组
转化宿主菌
筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）
• 特点及应用：
包含所有遗传信息
构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）
筛选难度大
用于研究基因plementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这启动子----LacI菌
PL/PR
-------- CI857
溶源菌
3、诱导表达
温度诱导------PL/PR
IPTG的化学诱导----Plac、Ptac
六．表达产物的检测： 1、特异性鉴定： • 荧光抗体法
• 免疫沉淀法
• 免疫印迹法 • ELISA 2、生物学活性鉴定
1、粘末端连接
1）全同源粘末端连接
• 最方便简单
• 高背景-载体自身环化 • 双向插入
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略
• 粘-粘连接：最有效、最快捷
• 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平
2、平末端连接： • 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA • 效率低，酶用量大
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
1、主要元件：强启动子
SD
原核基因3’端
2、技术关键：克隆基因插入原核序列近3’端而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点：
• 加人工合成的DNA接头
• 构建位相载体
载体部分序列
基因克隆的技术路线目的基因载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
二、克隆载体
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
四、体外重组的策略
四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：
1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。
常见原核强启动子：
• Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 • Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。
• Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 • PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。