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一种新型微载体的制备及其细胞培养发表时间：2018-09-17T16:08:43.697Z 来源：《基层建设》2018年第25期作者：韦楚旭[导读] 摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。
身份证号：44528119871020XXXX 510000摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。
由于精氨酸酸性羧酸酯基团，这个方案为细胞培养提供了与市售Cytodex 1微载体相比具更低的表面pH，理论上表面pH值可以做到7.0左右，其结果是更适宜pH的微载体。
将产物初步用于VERO细胞培养，得到了较好的结果。
细胞在微载体上生长良好，和目前广泛使用的Cytodex 1微载体效果相仿。
关键词：微载体、精氨酸、胍基、动物细胞培养动物细胞培养常常需要贴壁生长，在悬浮状态下细胞生生长缓慢，停止，甚至死亡。
微载体培养细胞原理是将对细胞无害的颗粒—微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，而同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。
精氨酸（以下简称Arg）可以算为一种双性氨基酸，因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。
这个胍基能形成多重的氢键。
使其在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电。
葡聚糖凝胶含有大量的羟基，且此羟基可被氧化成醛或酮或羧酸，适合作为微载体基体，利用这个性质，将精氨酸偶联在葡聚糖羟基上。
1、微载体制备1.1微载体基体制备1.1.1试剂规格：①葡聚糖（分子量为10000，分析纯）；②环氧氯丙烷（分析纯）；③Span80（分析纯）；④液体石蜡（分析纯）；⑤95%酒精（医用级）；⑥氢氧化钠（分析纯）1.1.2制备方法：取50mL石蜡油加入100mL的烧杯中，然后放入水浴槽中，温度加热至50℃，开启搅拌，加入1mL span80，搅拌10min 后，等烧杯内温度达到50℃，加入10mL葡聚糖溶液（浓度为20%，10%氢氧化钠），继续搅拌20min，让葡聚糖溶液在石蜡油里面形成一个油包水体系，葡聚糖以小液球形式悬浮在石蜡油中，待乳化稳定后，加入3mL 环氧氯丙烷交联固化，反应20min，然后将反应温度升至75℃，继续反应40min。
Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒张永欣;刘馨;张光明;徐婧雯;李国良;李桂兰;孙明波;衡燮;姬光;孙茂盛【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2008(21)4【摘要】目的利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒。
方法利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度。
结果在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到最高。
在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml。
结论Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度。
【总页数】3页(P336-337)【关键词】轮状病毒;Vero细胞;微载体;滴度【作者】张永欣;刘馨;张光明;徐婧雯;李国良;李桂兰;孙明波;衡燮;姬光;孙茂盛【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所【正文语种】中文【中图分类】R373.2【相关文献】1.Vero细胞在不同微载体固定化培养中的生长和代谢 [J], 刘红;叶玲玲;李世崇;王启伟;刘兴茂;陈昭烈2.微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗 [J], 乐威;叶林柏;张捷;刘静3.Vero细胞微载体放大培养技术研究 [J], 毕军;王强;孙文4.Vero细胞微载体悬浮培养生产工艺研究 [J], 王景庆;游松;张微5.用微载体系统培养Vero细胞生产高滴度狂犬病毒液 [J], 王树君;代长海;张莹;王进;李宇辉;胡晓明;李光谱;于洪涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成大生物狂犬病疫苗一）技术来源1984 年11 月，世界卫生组织（WHO ）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以Vero 细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15 年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999 年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
（二）主要技术1、高密度微载体技术1）微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达? 的微载体技术指标：1 个微载体= 180 μm1 克微载体（干重）= 4,400cm 2500 克微载体= 1,000 转瓶（3 升转瓶）7.5 升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30 升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml 。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061 狂犬病固定毒毒株是WHO 公认的免疫原性高的Vero 细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达?0.5ml 的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2）生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3）比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L ，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml ，远超过其他工艺(转瓶、细胞工厂、其他类型反应器) 。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和Vero 细胞DNA ，保证了成大速达?具有卓越的安全性。
制药行业生物制药工艺创新方案第1章引言 (4)1.1 生物制药行业发展概述 (4)1.2 生物制药工艺创新的意义与挑战 (4)第2章生物制药工艺现状及发展趋势 (5)2.1 国内外生物制药工艺发展现状 (5)2.1.1 国内生物制药工艺现状 (5)2.1.2 国外生物制药工艺现状 (6)2.2 生物制药工艺发展趋势 (6)2.2.1 创新药物研发成为主流 (6)2.2.2 生物工艺技术的优化与集成 (6)2.2.3 个性化治疗与精准医疗 (6)2.2.4 跨界融合与创新 (6)2.2.5 绿色、环保工艺的推广与应用 (6)第3章基因工程技术在生物制药中的应用 (7)3.1 基因重组技术 (7)3.1.1 基因重组技术的原理与流程 (7)3.1.2 基因重组技术在生物制药中的应用实例 (7)3.2 基因编辑技术 (7)3.2.1 基因编辑技术的原理与优势 (7)3.2.2 基因编辑技术在生物制药中的应用实例 (7)3.3 基因转移与表达技术 (7)3.3.1 基因转移技术的种类及原理 (7)3.3.2 基因表达技术的优化与调控 (8)3.3.3 基因转移与表达技术在生物制药中的应用实例 (8)第4章细胞培养与生物反应器技术 (8)4.1 微生物细胞培养技术 (8)4.1.1 培养基优化 (8)4.1.2 发酵过程控制 (8)4.1.3 高密度发酵 (8)4.2 动物细胞培养技术 (8)4.2.1 无血清培养基 (9)4.2.2 微载体培养技术 (9)4.2.3 恒温灌注培养 (9)4.3 植物细胞培养技术 (9)4.3.1 植物细胞悬浮培养 (9)4.3.2 固定化植物细胞培养 (9)4.3.3 植物细胞发酵过程优化 (9)4.4 生物反应器设计与优化 (9)4.4.1 生物反应器类型及特点 (9)4.4.2 生物反应器放大工艺 (9)4.4.3 生物反应器控制策略 (10)第5章生物制药下游工艺创新 (10)5.1 蛋白质纯化技术 (10)5.1.1 离子交换层析法 (10)5.1.2 亲和层析法 (10)5.1.3 萃取法 (10)5.2 膜分离技术 (10)5.2.1 超滤技术 (10)5.2.2 微滤技术 (10)5.2.3纳滤技术 (10)5.3 凝胶过滤技术 (11)5.3.1 羟基磷灰石柱层析 (11)5.3.2 凝胶渗透层析 (11)5.4 制剂技术 (11)5.4.1 纳米制剂技术 (11)5.4.2 疫苗制剂技术 (11)5.4.3 注射用制剂技术 (11)第6章生物制药生产过程优化与控制 (11)6.1 生产过程参数监测与优化 (11)6.1.1 参数监测技术 (11)6.1.2 生产过程优化策略 (11)6.1.3 生产过程控制算法 (11)6.2 智能制造与自动化控制 (12)6.2.1 智能制造技术 (12)6.2.2 自动化控制系统 (12)6.2.3 智能优化算法 (12)6.3 过程系统集成与优化 (12)6.3.1 过程系统集成 (12)6.3.2 过程优化方法 (12)6.3.3 生产过程稳定性分析 (12)第7章生物制药质量分析与控制 (12)7.1 生物制药质量标准制定 (12)7.1.1 质量标准制定原则 (12)7.1.2 质量标准制定流程 (13)7.1.3 关键质量指标 (13)7.2 生物分析方法 (13)7.2.1 生物分析方法分类 (13)7.2.2 生物分析方法原理 (13)7.2.3 生物分析方法在生物制药中的应用 (14)7.3 生物制药质量控制策略 (14)7.3.1 质量控制策略制定 (14)7.3.2 质量控制策略实施 (14)第8章生物制药安全性评价与风险管理 (14)8.1 生物制药安全性评价方法 (14)8.1.1 临床前安全性评价 (15)8.1.2 临床安全性评价 (15)8.2 风险评估与管理 (15)8.2.1 风险识别 (15)8.2.2 风险评估 (15)8.2.3 风险控制 (15)8.2.4 风险监测与沟通 (15)8.3 生物制药监管政策与法规 (15)8.3.1 监管政策 (15)8.3.2 法规体系 (16)8.3.3 国际合作与协调 (16)第9章生物制药产业化与商业化 (16)9.1 生物制药产业化策略 (16)9.1.1 生物制药产业化的概念与意义 (16)9.1.2 生物制药产业化关键环节 (16)9.1.3 生物制药产业化策略制定 (16)9.1.4 生物制药产业化过程中的技术与管理创新 (16)9.2 生物制药市场分析 (16)9.2.1 全球生物制药市场概况 (16)9.2.2 我国生物制药市场现状与发展趋势 (16)9.2.3 生物制药市场竞争格局 (16)9.2.4 生物制药市场机遇与挑战 (16)9.3 生物制药商业化模式与案例 (16)9.3.1 生物制药商业化模式概述 (16)9.3.2 生物制药合作研发与产业化 (16)9.3.3 生物制药许可与转让 (16)9.3.4 生物制药企业并购与重组 (16)9.3.5 生物制药产业化与商业化的成功案例 (16)9.1节详细阐述生物制药产业化的概念、意义、关键环节以及产业化策略制定，重点关注技术与管理创新在产业化过程中的应用。
1BIOTECHWORLD 生物技术世界mrc-5细胞是来源于一个27岁的健康妇女(瑞典)的14周男性胚胎,该细胞核型为46XY,衰老期为48群体倍增代。
MRC-5原始种子库为7代细胞,共481支。
2005年该委员会向WHO建议并被批准建立了新的细胞库,细胞代次为12代。
MRC-5细胞株是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的可以用于人用疫苗生产的标准人二倍体细胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,无异种移植致癌性,无外源因子污染,其规模化培养适宜生产多种病毒性疫苗。
到目前为止,mrc-5细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。
1 材料1.1 生物反应器中国广州奇志公司生产的BC-15L(工作体积12L)以及BC-100L型(工作体积80L)微载体培养系统。
1.2 细胞中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞,23代。
1.3 微载体GE公司的cytodex I 型,按照厂家指导进行制备和灭菌处理,使用浓度5g/l-15g/l。
1.4 培养液日本株式会社的MEM培养液,补加10%的小牛血清(山西太原润生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)。
1.5 消化液0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。
1.6 细胞洗涤液pH7.2 0.01mol/l PBS溶液2 方法2.1 mrc-5细胞的准备将MRC-5细胞复苏,并在2000ml K氏瓶中培养扩增,培养条件为pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待细胞长成致密单层后,消化、收集细胞悬液。
2.2 微载体培养mrc-5细胞2.2.1 微载体处理cytodex I型微载体,按照GE公司说明将微载体用pH7.2 0.01mol/LPBS水化膨胀,高压灭菌,用培养液置换1-2次后,浸泡2小时以上,备用。
2.2.2 细胞接种将细胞悬液接种到BC-15L细胞培养罐内,接种密度(1×105个/ml),培养浓度5g/L。
微载体培养技术
(microcarrier culture technique)
一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。
经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。
目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。
两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。
一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。
自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。
常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。
●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。
使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。
●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。
●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。
若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。
三、微载体培养原理与操作
1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历黏附贴壁、生长和扩展成单层三个阶段。
细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖，故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键。
黏附主要是靠静电引力和范德华力。
细胞能否在微载体表面黏附，主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性。
2. 搅拌转速：由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。
通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。
微载体培养的搅拌非常慢，最大速度75r/min。
3.细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。
一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。
若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。
若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为
媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。
4. 细胞在微载体表面的生长影响细胞在微载体表面生长的因素很多，主要有三个方面。
●在细胞方面，如细胞群体、状态和类型。
●在微载体方面，如微载体表面状态、吸附的大分子和离子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。
●在培养环境中，如培养基组成、温度、pH、DC以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长。
如果所处条件最优，则细胞生长快；反之生长速度慢。
5. 微载体培养操作要点
●培养初期：保证培养基与微球体处于稳定的PH与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积1/3的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。
不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。
常使用2-3g/L的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。
●贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。
●培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。
随意细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。
经过3d左右，培养液开始呈酸性，需换液：停止搅拌，让微珠沉淀5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。
●收获细胞：首先排干培养液，至少用缓冲液漂洗1遍，然后加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min。
然后解离收集细胞及其产品。
●微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。
使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至4000L以上。
四、微载体大规模细胞培养的生物反应器系统此技术大规模培养，细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制，其中主要的限制性因素包括：细胞对剪切力的敏感性、氧的传递以及传代和扩大培养等。
而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素，为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力、高氧传递效率、易于细胞传代等适宜的外部环境。
已较多使用的微载体培养系统生物反应器，可以实行计算机控制操作，培养搅拌速度及悬浮均匀程度、温度变化、PH稳定及溶氧供应（O2、N2、CO2、空气四种纯化气体按比例调节）、罐压、培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制。
因此，应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势，目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统，如搅拌式生物反应器系统、旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等。
1、搅拌式生物反应器系统搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史，但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力，从而限制了其应用范围。
尽管如此，由于该系统具有简单、实用及价格低廉等特点，国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道。
例如，Werner A（2000年）成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究。
2、灌注式生物反应器系统灌流培养是目前研究热点之一。
它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基，使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内
增殖，即省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，且可以提高细胞密度10倍以上。
3、旋转生物反应器近年来，旋转生物反应器系统（RCCS）已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统。
该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器。
RCCS既可以用于微载体大规模细胞培养，又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体。
至今，近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。
五、微载体培养优点
●表面积/体积（S/V）大，因此单位体积培养液的细胞产率高；
●把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；
●可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；
●简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；
●培养基利用率较高；
●放大容易；
●细胞收获过程不复杂；
●劳动强度小；
●培养系统占地面积和空间小。
