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使用微载体在生物反响器中制备Vero 细胞狂犬病疫苗的试验一、资料1、微载体GE 企业 Cytodex 1 ，25g2、生物反响器上海日泰企业 Cellipower 5L，工作体积 3.5L加微载体 25g（约 7g/L ）3、细胞、毒种、培育液二、操作过程1、微载体办理、反响罐准备取微载体 25g 用 PBS溶液清洗几次后室温下浸泡膨胀留宿。
弃去上清液，将载体转移到 2L 瓶内加入 PBS约 1L，灭菌后备用。
将微载体装到生物反响罐内，换上新的PBS溶液4L，安装好生物反响罐灭菌（126℃*80min ）。
2、生物反响器校订、调试反响罐灭菌前调试生物反响器，保证能正常运转，各参数正常。
用 pH 为 7.0/10.0的标准缓冲液校订 pH电极 2 次。
灭菌后，温度 37℃校订 DO电极。
3、预培育DO 电极校订完后，封闭进气，停止搅拌，过15 分钟待载体沉降后排空上清液，加入 199 培育液 3 L 浸泡办理载体，浸泡 3 小时后相同封闭进气停止搅拌 15 分钟后排空上清液，加入 7.5%重生牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO 50、搅拌转速 60RPM，预培育留宿，留神反响器运转能否正常，各参数能否稳固能调控。
4、接种细胞接种细胞当日先排空反响罐内预培育的 7.5%重生牛血清培育液，从头加入 7.5% 重生牛血清培育液 3L ，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 60RPM。
待温度稳固在 37℃后取样校订 pH 值，而后准备接种细胞。
封闭温度、 pH、DO 控制，封闭进气，搅拌转速设为 30RPM，将适当细胞悬液慢慢加入反响罐内，接种细胞总数为 1.8*10 9个（密度约 5*105个/ml ），温度慢慢调回 37℃，接种细胞后 2 小时开始进气，开启 pH、DO 控制，设置温度 37℃、 pH7.2、DO50、搅拌转速 30RPM。
搅拌转速在接种细胞 4 小时后设为 40RPM、5 小时后设为 50RPM、6 小时后设为 60RPM，开始进入细胞培育阶段。
Vero细胞在微载体上生长的形态变化的电镜观察邵曼君，姜蕾(中国科学院化工冶金研究所，多相反应开放实验室，北京100080) 高洪亮、丛威(中国科学院化工冶金研究所，生化工程国家重点实验室，北京100／)80)摘要使用环境扫描电镜(ESEM)．现察了Vcro细^邑在C：mxlex-3微栽体表面上贴卅铺展过程厦增殖生长过程中的形态变化，显示了细胞在微巍体上的贴附与蝻展的过程和行为，发现了细目雌微栽体上的增殖生长以细胞群落延伸扩展的形式进行；通过对细胞同步化前后细胞形态的对比，发现在同步化后太多数处于分裂期时的细胞体积大于同步化前正常培养的细胞(大多数处于生长前期)体积．考察了外i臣的屡街粘连蛋白对妇幢铺曩彤托的影响．关犍词Vcro细胞生长细胞形态变化环境扫描电镜1引言细胞行为和细胞的生理状态密切相关，观察细胞生长过程中的细胞形态及其变化．可以分析细胞行为，得到状态的信息，是细胞培养研究中的主要环节之一。
特别是在贴壁依赖性动物细胞(Veto细胞．一非洲绿猴肾细胞)的微载体培养系统中，细胞在微载体上的贴附及铺展，与细胞的分裂及生长有关；细胞在微载体上的贴附概率及贴附位置对细胞的生长有影响，这些问韪吸引着众多科学家们进行着有关的研究【I。
l。
光学显微镜是观察细胞形态最常用的仪器，但光学显微镜因其放大倍数的局限性t很难观察到细胞的细节。
随着科学仪器的发展，常规的扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)已被用于观察细胞的形态和内部的细微结构。
这两种电镜虽然有放大倍数高，SEM还有景深大的优点．得到的高倍图象十分清晰、信息量很大，但是生物样品的制备过程十分复杂，使其应用受到了限制。
90年代开发的环境扫描电子显微镜(ESEM)是一种新型的扫描电子显微镜，特别适用于生物样品(含水样品)的观察。
它的主要优点是非导体样品可咀不经过表面金属化而直接观察【3J．这就使生物样品的制备十分简单。
在国外，ESEM已被广泛地应用于生命科学研究中。
课程名称：动物微生物学（B）考试时间：2012年7 月18 日学生所在学院：动科专业：动医班级：5108-1、2、3、4 教师所在学院：动科学院教师姓名：胡桂学一、解释概念（共20题，每题1分，计20分）1．菌苔：菌落连成片形成的结构，称为菌苔。
2．细菌素：某些菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质，其作用范围狭窄，仅对与产生菌有亲缘关系的细菌有杀伤作用。
3．细菌的条件致死突变株：在某种条件下，某菌株经基因突变后可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。
4．过路菌：有的微生物是从动物所接触的自然环境或食物中污染的，称为过路菌。
5．细菌的株：又称品系，是指同种细菌中不同来源的纯培养物。
6．条件性病原微生物：有些病原微生物长期生活在动物体内，只在一定条件下才表现除致病作用，这类微生物称为条件性病原微生物，如肠道内的大肠杆菌、禽巴氏杆菌和人肺炎双球菌。
7．防腐：应用各种化学药品防止和抑制微生物生长繁殖的方法叫防腐，也称抑菌。
8．病毒粒子：也叫毒粒（Virion），是专指结构上和功能上完整的成熟的病毒颗粒，有固定的形态和大小，而且一般都有侵染性。
9．细胞的微载体培养：通过搅拌作用，使微载体处于悬浮状态，但以微载体为支架，细胞贴壁于微载体的表面。
10．病毒吸附蛋白（Virus attachment Protein，VAP）：是指存在于病毒表面，能够被受体蛋白识别的病毒结构。
如衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起。
其与病毒的宿主范围、组织嗜性及致病性有关。
11．病毒的感染复数（multiplicity of infection，m.o.i）：是指用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目，单位（PFU/cell）。
12．病毒的缺陷干扰颗粒：缺陷病毒不能复制，能干扰同种成熟病毒体进入细胞，被称为缺陷干扰颗粒（defective interfering particles，DIP）。
13．传代细胞：是指能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞（如HeLa细胞）或二倍体细胞突变（如中国地鼠卵巢细胞系，CHO）而成。
1.产品的意义：目前恶性肿瘤已超过心脑血管类疾病成为首位人类致死性疾病, 采用Vero细胞培养技术生产的重组溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)具有良好的溶源性、靶向性和安全性, 具有重要的应用价值。
国内人类肿瘤疫苗的有关研究处于刚起步状态，面临多重难题，建立高效的肿瘤疫苗生产工艺具有非常重要的社会和经济价值。
经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒作为高效新型病毒疫苗有望用于肿瘤的临床研究。
图1.溶瘤病毒的作用机制2.生产材料：①细胞培养：Vero 细胞②病毒株：重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒HSV—II，中国医学科学院肿瘤研究所提供。
③微载体：Cytodex 1④生物反应器图2.产品外观图3. Cytodex 1微载体图4.Vero细胞图5.生物反应器3.经济效益：经查阅ATCC，Vero细胞为免费（不包邮）；病毒株需向中国医学科学院肿瘤研究所申请提供（几乎免费）；微载体Cytodex 1市价为3元/瓶；生物反应器可租借。
成本保守估计（不算设备使用费）：每支成本约为6元，预售价为98元，除去设备费和人工生产费，约可净得利润30RMB/支（1ml）。
4.生产工艺流程：图6.生产车间流程图在反应罐培养间中进行重组HSV—Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养，步骤如下：①Cytodex 1微载体制备：称取一定量Cytodex l置于二甲基二氯硅烷硅化的转瓶／瓶子内，加入PBS(pH 7．2)水化，比例约为80～150 mL／g Cytodex 1，约3h后将PBS倾去，加入新PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4℃ 冰箱平衡过夜，待用。
PBS继续水化约3 h(可过夜)，倾去并用新的PBS洗涤一次。
高压灭菌121℃ ，30 min，冷却后倾去PBS，用培养基洗涤一次后倾去，重新加入新鲜培养基置4~C冰箱平衡过夜，待用。
细胞培养vero实验报告Vero细胞传代培养实验报告一、实验原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞培增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
二、器材和液体的准备①.细胞培养器材：培养箱、超净工作台、倒置显微镜、25m培养瓶、5ml移液管、1ml枪头；②. 细胞培养溶液：配制好的PBS液、DMEM培养液（10%血清）、胰酶溶液。
（均已过滤灭菌，37℃预热）③．其他器材及灭菌用品：计时器、无菌手套、75%酒精、镊子、棉球、废液缸。
三、实验操作①．将长成单层的Vero细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中吸出瓶内的培养液，加入3~5ml的PBS溶液洗涤一次后吸出，加入1ml胰酶溶液，左右晃动培养瓶使胰酶溶液平铺在细胞表面。
放入37℃，5%二氧化碳培养箱中放置3分钟。
②.在倒置显微镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液吸出，加入2ml新鲜培养液，反复吹打，制成细胞悬液。
③．将细胞悬液吸出1ml废弃后，将培养瓶中培养液添加至5ml 左右，盖好瓶塞，送回37℃，5%二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
④. 记录细胞生长情况。
四、无菌操作的注意事项①．在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。
将要放入超净工作台的器材均需放入前喷洒75%酒精灭菌。
操作前30分钟起动超净台紫外灭菌后打开吹风，酒精棉球擦拭超净工作台面。
成大生物狂犬病疫苗一) 技术来源1984年11月，世界卫生组织（WHO）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以V ero细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
(二) 主要技术1、高密度微载体技术1) 微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达®的微载体技术指标：1个微载体= 180μm1克微载体（干重）= 4,400cm2500克微载体= 1,000转瓶（3升转瓶）7.5升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061狂犬病固定毒毒株是WHO公认的免疫原性高的V ero细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达®0.5ml的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2) 生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3) 比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml，远超过其他工艺（转瓶、细胞工厂、其他类型反应器）。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和V ero 细胞DNA，保证了成大速达®具有卓越的安全性。
