鸡胚细胞的微载体培养

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。

（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。

（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。

DMSO一定要配成10%。

鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。

开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。

用碘酒、酒精消毒蛋壳。

用镊子打开气室。

4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。

5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。

6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。

7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。

8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。

消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

消化10－15分钟。

一般约12分钟。

视鸡胚日龄大小而定。

越小消化时间越短。

见组织松软即可。

一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。

9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。

（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。

使细胞分散，脱落。

然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。

低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。

10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。

对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。

在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。

要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。

组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。

组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。

很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。

细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。

组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。

原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。

本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。

（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。

2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。

3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。

（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。

以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。

2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。

微载体培养技术（microcarrier culture technique）一、微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养。

经过三十余年的发展，该技术目前已渐日趋完善和成熟，并广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。

目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、V ero细胞、CHO细胞。

使用较多的反应器有两种：德国贝朗生物反应器BIOSTA T Bplus ，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；美国NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift 双筛网搅拌系统。

两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。

二、微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。

一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。

自V an Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一种微载体问世以来，国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。

常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

●微载体的大小：增大单位体积内表面积（S/F）对细胞的生长非常有利。

使微载体直径尽可能小，最好控制在100-200μm之间。

●微载体的密度：一般为1.03-1.05g/cm2，随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。

●微载体的表面电荷：据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。

若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。

三、微载体培养原理与操作1.原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。

20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。

近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。

随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。

所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。

目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。

第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。

随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。

承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。

因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。

自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。

一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。

二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。

通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。

三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。

四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。

2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。

3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。

4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。

5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。

6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。

五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。

2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。

3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。

4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。

六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。

2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。

3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。

MDCK细胞及其微载体培养技术研究进展摘要：疫苗是预防和控制禽流感的重要手段。

传统禽流感疫苗采用鸡胚制备，此方法受很多因素的限制。

传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。

MDCK细胞以其优越的性能成为流感疫苗生产的理想细胞系。

本文将就MDCK细胞培养及其微载体培养技术研究进展进行了概述。

关键字：MDCK细胞；微载体培养禽流感是人类至今不能有效控制的传染病之一，一直是威胁禽类安全的首要疾病。

目前最主要也是最有效的控制方法就是疫苗接种。

禽流感疫苗传统生产使用鸡胚，而且是疫苗生产中的一种主要方法，但此种方法在疫病大规模爆发的情况下，很容易受限于可靠的鸡胚的来源、较长的培养周期、繁琐的操作步骤以及很容易受污染等因素。

除了传统的鸡胚制备流感疫苗，细胞培养流感病毒的技术相对鸡胚培养流感病毒来进行疫苗生产有明显优势，如生产周期较短，封闭的生物反应器更利于生产控制，更容易扩大生产规模，无过敏源和不存在鸡胚内源性病毒污染等。

传代细胞系如MDCK细胞、Vero细胞、RER.C6细胞等也被用作制备流感疫苗。

MDCK细胞具有易培养、对多种不同亚型的流感病毒株敏感、病毒用MDCK细胞培养的产量高等特点，是作为流感疫苗生产的理想细胞系。

为了适应扩大化的工业生产的需要，细胞微载体培养技术已经在工业生产上日益成熟，本文就此项技术进行了概述，并对此技术在疫苗生产中的应用作了展望。

一、MDCK细胞1958年，Madin和Darby在健康的雄性可卡猎犬的肾脏中分离了上皮样细胞并建立了Madin-Darby canine kidney（MDCK）细胞系[41]。

通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞。

目前，MDCK细胞系广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒(Reovius)、腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、猫粒细胞缺乏症病毒(Feline panleukopenia virus，FPLV) 及禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 等[2-5]。