微载体培养技术

1 Biologics 生物制品：一般指的是用微生物（包括细菌，噬菌体，立克次体病毒等）为生物代谢产物，动物毒素，人或动物的血液或组织等加工而制成的预防，治疗和诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂，主要指菌苗，疫苗，毒素，应变原与血液制品等。

2 Electroporation 电穿孔：是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，外界环境中的DNA穿孔而入，进入细胞，最终进入细胞核内部得的方法。

该方法既适合于贴壁生长的细胞，也适合用于悬浮生长的细胞，既可用于瞬时表达也可用于稳定转染。

3 Microcarrier culture 微载体培养：微载体培养是使细胞贴附在微小颗粒载体上，它创造了相当大的贴附面积，供细胞贴附生长、增殖。

载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使细胞自由悬浮于培养基内，充分发挥悬浮培养的优点。

4 Conventional filtration 常规过滤：是指料液流动方向和过滤介质垂直的过滤方式。

常规过滤时，固体颗粒易被填塞在过滤介质上，形成滤饼。

料液必须穿过滤饼和过滤介质的微孔。

恒压下，随着滤饼厚度的增加，滤液不断减慢。

5 SCF 超临界流体：是指处于超临界温度（TC）和超临界压力（PC）以上的特殊流体。

当气体物质处于其临界温度和临界压力以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，因此，超临界流体相既不同于一般的液相，也有别于一般的气相，具有许多特殊的物理化学性质。

6 Adsorption method 吸附法：指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其他物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。

7 Compound affinity 复合亲和力：即吸附剂的亲和结合过程，既涉及离子效应的应用，又有疏水作用，且这两种弱的作用还彼此增强，其结果使亲和力大大增强。

8 Thymus hormones 胸腺激素：胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面的影响。

muralcells培养方法（最新版3篇）目录（篇1）1.引言2.muralcells 的定义和重要性3.muralcells 的培养方法3.1 传统培养方法3.2 改进的培养方法4.培养方法的选择5.结论正文（篇1）muralcells，又称壁细胞，是一种具有重要生物学功能的细胞类型。

在生物学研究和应用中，如何有效地培养 muralcells 成为了研究者们关注的焦点。

本文将介绍 muralcells 的培养方法。

首先，我们来了解一下 muralcells 的定义和重要性。

muralcells 是一种特殊的细胞类型，主要存在于许多生物体的壁组织中，如植物、真菌和动物。

它们在生物体的生长、发育、防御等方面发挥着重要作用。

因此，研究 muralcells 的培养对于理解其生物学功能及应用具有重要意义。

接下来，我们将介绍 muralcells 的培养方法。

传统的培养方法主要包括以下几种：3.1 传统培养方法（1）组织培养：从生物体中取出壁组织，进行切碎、酶解等处理，然后接种在含有适当生长因子和营养物质的培养基中，进行体外培养。

（2）细胞悬浮培养：将壁组织细胞分离出来，接种在含有适当生长因子和营养物质的悬浮培养液中，进行体外培养。

然而，传统的培养方法存在一些局限性，如培养条件难以控制、细胞状态不稳定等。

为了克服这些问题，研究者们开发了一些改进的培养方法：3.2 改进的培养方法（1）微载体培养：利用微载体固定细胞，提供更好的生长环境，使细胞状态更稳定。

（2）生物反应器培养：利用生物反应器进行大规模培养，可以更好地控制培养条件，提高细胞产量。

在选择培养方法时，研究者需要根据实验目的和条件来选择合适的方法。

例如，如果需要进行大规模培养，可以选择生物反应器培养；如果需要保持细胞状态稳定，可以选择微载体培养等。

总之，muralcells 的培养方法有多种，研究者需要根据实验目的和条件来选择合适的方法。

目录（篇2）1.引言2.muralcells 的定义和特点3.muralcells 的培养方法a.培养基的选择b.培养条件c.培养步骤4.muralcells 培养的注意事项5.结论正文（篇2）【引言】muralcells 是一种具有高度分化潜能的细胞，广泛应用于生物医学研究。

《生物工程进展》1998,V o l.18,N o.2动物细胞高密度培养用多孔微球王佃亮　肖成祖(中国人民解放军航空医学研究所　100036) 多孔微球(po rou s m icro sp heres)又称多孔微载体(po rou s m icrocarriers)或大孔微载体(m acropo rou s m icrocarriers),是近几年在国外发展起来的一项新的动物细胞高密度培养生物技术。

它克服了固体微载体(so lid m icrocarr2 iers)培养时细胞仅在表面生长、微囊(m icro2 cap su les)培养时细胞仅在内部生长的缺陷,培养细胞可在载体的内外表面生长,因而可达到很高的密度(杂交瘤细胞密度可达5×107cells m l培基,贴壁依赖性细胞密度可达122×108cells m l微球)[1]。

Griffith s曾高度评价它是微载体发展的第二阶段,是细胞培养技术的一次革命[2]。

一、多孔微球的优越性在利用动物细胞大量培养技术生产生物制品(主要指预防、诊断、治疗三大类试剂)过程中,将动物细胞进行固定既可以增强培养物和产物的稳定性,又可提高单位细胞密度和产量并长期生长。

在现有的固定方法中,固体微载体发展得最早最为成熟;近30年中为生物制品的生产立下了很大功绩。

但随着生物技术的发展,固体微载体所固有的某些缺陷也日益暴露出来,主要有:1、生物量增长少,生产率相对较低(因为表面积 体积比率低);2、不适于悬浮细胞培养和长期操作,尤其是无血清培基;3、培养细胞暴露于剪切应力和气—液界面,易受损伤;4、在灌流培养中细胞易洗脱,成熟细胞有时会从微载体表面解离;5、微载体使用浓度高,接种体积大。

多孔微球是一种具有相互连接的孔结构的小珠,就象细胞外基质(ex tracellu lar m atrix)一样提供了细胞生长的三维骨架,它的主要优点是:1、已商品化;2、可适用于固定床、流化床、气升式和普通搅拌式等多种动物细胞培养系统;3、可在反应器中直接接种;4、为贴壁依赖性细胞的生长提供了大的表面积,细胞可在微球的内外表面生长;5、某些多孔微球还具有包埋悬浮细胞的能力,为其提供剪切保护和阻止在灌流培养中被洗脱,且生产的产品质量较高;6、可支持较固体微载体高的单位微载体床体积细胞密度,可在较高的转速下培养,从而提高KLA(m ass tran sfer coefficien t),使氧的传递更为有效。

一种新型微载体的制备及其细胞培养发表时间：2018-09-17T16:08:43.697Z 来源：《基层建设》2018年第25期作者：韦楚旭[导读] 摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。

身份证号：44528119871020XXXX 510000摘要：一种用于动物细胞培养的新型微载体：利用葡聚糖和环氧氯丙烷进行交联反应，得到葡聚糖凝胶，即微载体，并用精氨酸对微载体进行修饰，使微载体在细胞培养液中表面带上正电荷，进而吸附细胞，使细胞贴附在表面生长。

由于精氨酸酸性羧酸酯基团，这个方案为细胞培养提供了与市售Cytodex 1微载体相比具更低的表面pH，理论上表面pH值可以做到7.0左右，其结果是更适宜pH的微载体。

将产物初步用于VERO细胞培养，得到了较好的结果。

细胞在微载体上生长良好，和目前广泛使用的Cytodex 1微载体效果相仿。

关键词：微载体、精氨酸、胍基、动物细胞培养动物细胞培养常常需要贴壁生长，在悬浮状态下细胞生生长缓慢，停止，甚至死亡。

微载体培养细胞原理是将对细胞无害的颗粒—微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使贴壁细胞在微载体表面附着生长，而同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。

它将细胞的贴壁培养变为悬浮培养，这样可以大大增加细胞生长的表面积以提高细胞的生长密度。

精氨酸（以下简称Arg）可以算为一种双性氨基酸，因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电殛离开原位。

这个胍基能形成多重的氢键。

使其在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电。

葡聚糖凝胶含有大量的羟基，且此羟基可被氧化成醛或酮或羧酸，适合作为微载体基体，利用这个性质，将精氨酸偶联在葡聚糖羟基上。

1、微载体制备1.1微载体基体制备1.1.1试剂规格：①葡聚糖（分子量为10000，分析纯）；②环氧氯丙烷（分析纯）；③Span80（分析纯）；④液体石蜡（分析纯）；⑤95%酒精（医用级）；⑥氢氧化钠（分析纯）1.1.2制备方法：取50mL石蜡油加入100mL的烧杯中，然后放入水浴槽中，温度加热至50℃，开启搅拌，加入1mL span80，搅拌10min 后，等烧杯内温度达到50℃，加入10mL葡聚糖溶液（浓度为20%，10%氢氧化钠），继续搅拌20min，让葡聚糖溶液在石蜡油里面形成一个油包水体系，葡聚糖以小液球形式悬浮在石蜡油中，待乳化稳定后，加入3mL 环氧氯丙烷交联固化，反应20min，然后将反应温度升至75℃，继续反应40min。

1 细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求1.所有与细胞接触的设备、器材和溶液等，都必须保持绝对无菌，避免细胞外微生物的污染。

目前最可靠和最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

如：玻璃制品、布类、金属制品：6.8kg20min。

橡胶制品：3.6～4.5kg10min。

培养用液，如Hanks液，水解乳蛋白：3.6～4.5kg10min。

实验中染菌物品和动物尸体等：6.8 kg20min。

试管、吸管等，则可采用干热灭菌；一切不适于加热灭菌的液体，如人工合成培养液、小牛血清、胰蛋白酶等溶液，可采用过滤法除菌。

细胞培养中常用的消毒剂浓度及其使用场合2.必须有足够的营养供应，而绝对不可有有害的物质，包括极微量的有害离子的掺入，为此必须注意器材的清洗和配液用水的质量。

细胞培养中对水的质量要求很高（见水处理）。

3.保证有适量的氧气供应。

细胞代谢需要有空气，否则细胞死亡。

在用培养瓶进行静止培养，或用转瓶进行旋转培养时，只要培养的液体量不超过总容量的30％，通过与液面的空气交换，可以保证细胞有足够的氧气。

当用罐子深层培养时，则必须通气，一般采用含5％CO2的空气，或根据需要将CO2、N2、O2和空气以不同比例混合，过量氧对细胞的生长也不利。

4.需随时清除细胞代谢中产生的有害产物。

细胞在代谢过程中会产生大量代谢废物，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等，这些产物对细胞的生存有害，必须及时清除。

在小量培养时，当培养基中酚红指示剂显示黄色，表示已有相当量乳酸产生，要及时更换新鲜的培养基。

在大量培养时，则需随时测定葡萄糖和乳酸等含量，并调节灌流速度，使代谢产物保持在无害水平下。

5.有良好的适于其生存的外界环境，包括温度、pH、渗透压和离子浓度等。

不同的细胞对pH的要求不同，一般来说适于细胞生长的pH在6.8～7.4，过高或过低均不利于细胞生长。

如上所述，细胞在代谢过程中会产生大量乳酸，使培养的pH下降。

为了保持培养液的pH，常在培养液内加入各种缓冲系统，如Na2HPO4/Na2HPO4、NaHCO3/H2CO3（CO2）、Tricineglycine，以及加缓冲剂Hepes液（常用浓度为10～50mol/L）.6.及时分种，保持合适的细胞密度（见细胞传代）二、细胞分离1.人白细胞的分离。

一、前言动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。

利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。

动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。

目前，动物细胞有悬浮培养和贴壁培养.技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上。

二、动物细胞的特点及生长特性动物细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：①动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；②倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；③培养过程需氧量少(氧传质系数KLa 大于10 h-1即可满足每毫升107个细胞的生长)；④培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；⑤原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。

三、动物细胞的固定化培养技术1、固定化培养方法在动物细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活细胞培养中，培养细胞的目的不仅仅要求催化活力，更重要的是利用细胞来合成和分泌蛋白，因此如何保持细胞的活性显得尤为重要。

由于动物细胞的极度敏感性，上述这些固定化方法会对动物细胞产生毒性，另外多糖(如卡拉胶等) 由于具有很高的离子强度也会对细胞产生毒害，故在动物细胞培养中要考虑使用较温和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化。

（1）吸附①多孔陶瓷美国某公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统，该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。

反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体，可提供4. 25 m2 的生长表面积，既可用于培养悬浮生长的细胞，又可用于培养贴壁依赖性细胞。

272生物技术世界 BIOTECHWORLD在生物医药领域,许多基因工程药物、疫苗等都离不开最基本的细胞培养技术,人二倍体细胞系的建立使人用疫苗得到了长足的发展。

[1]到目前为止,mrc-5 细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。

HDCV安全性好,具有很好的免疫原性,同其他狂犬病疫苗相比,接种后副作用极少发生,因此被WHO推荐为评价任何一种人用狂犬病疫苗的标准疫苗[2]。

1 材料1.1 细胞:中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞。

1.2 微载体:GE公司的cytodex I型。

1.3 生物反应器:中国广州奇志BC-15L、BC-100L型生物反应器。

1.4 培养液 :日本株式会社日水 MEM 培养液, 10%的小牛血清(山西太原润生) ,0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)1.5 消化液:0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

1.6 缓冲液液:pH7.2 0.01mol/l PBS 溶液。

2 方法2.1 微载体培养 mrc-5 细胞2.1.1 微载体处理按照 GE 公司说明处理微载体,高压灭菌。

2.1.2 细胞接种将细胞悬液以60、80、100、120、150rpm的搅拌转速分别接种到BC-15L 细胞培养罐内,接种密度(2×105个/ml),培养浓度 5g/L,取样观察细胞贴壁状况。

每天更换培养液,每天显微镜下观察细胞生长状况,细胞在微载体上长满单层后可进行扩大培养。

2.1.3 微载体扩大培养种子罐细胞长满后,用PBS洗涤细胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

消化细胞,分别用60、80、100、120、150rpm消化15分钟后取样观察细胞状态并测定细胞活力,细胞从微载体上脱离下来后,将细胞悬液转入到BC-100L细胞培养罐,培养浓度5g/L。

2.1.4 培养参数筛选接种细胞到BC-100L 细胞培养罐后设置相同的细胞接种浓度(2×105cells/ml)、微载体浓度(5g/L)、液体更换程序,所有培养参数中确保唯一参数变化。