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ESBLs与AmpC酶的检测及意义24论着?ChineseJournalofCurrelltPracticalMedicineOctober2008.Vl7.No10ESBLs与AmpC酶的检测及意义张益新【摘要】目的对近年耐三代头孢的阴沟肠杆菌进行p一内酰酶(主要是ESBLs与AmpC酶)监测以进行流行病学调查,同时作相关统计以指导实验室检测及临床用药.方法收集来自各种标本对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌33例,进行表型筛选试验及三维试验双重检测ESBLs与AmpC酶.结果表型筛选试验结果有24株产ESBLs,占72.73%;三维试验结果有32株产ESBLs,占96.97%,两者符合率为71.88%(23/32).表型筛选试验结果产AmpC酶10株,占30.30%;三维试验结果产AmpC酶8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(8/10).其中表型筛选试验结果两种酶均产的有1株,三维试验结果两种酶均产的有8株.结论对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs,体外实验对亚胺培南敏感率为97.66%,对其它抗菌药物敏感性差.【关键词】阴沟肠杆菌超广谱p一内酰酶(ESBLs)AmpC酶表型筛选三维试验Serveillanceonp-laetamaProducedbyEnterobacterCloacae.ZhangYixin.Departmentofh ematological,TheCentralHospitalofYiwu,Zhejiang,322000China.[Abstract]ObjectiveToservei13-lactama(mainlytheextendedspectruml3一lactamaandAmpCenzyme1producedbyenterobactercloacaeresistanttothethirdgenuscephalosporinsinordertoproces sepidemiologiicalinvestigation,andtoprovidelaboratoryandphysicianswiththestatisticalanalysisofantibiot icssusceptibility.MethodsWecollected33strainsofenterobactercloacaeresistanttothethirdgenuscephalosp orinSfromallkindsofspecimens,thendetectESBLsandAmpCenzymewiththephenotypescreeningtestandthr ee-dimensiontest.ResultsAmong33strainsofenterobactercloacae,therewere24strains(72.73%)and32s trains(96.97%) producingESBLsinphenotypescreeningtestandthree—dimensionaltestrespectively,andthecoincidencewas71.88%.Buttherewere10strains(30.30%)and8strains(24.24%)producingtheAmpCenzy meinthetwotestsrespectively,andtherewasacoincidenceof80.00%.Therewere1strainsproducingthetwoty pesofenzymesinphenotypescreeningtest,but8strainsinthelattertest.ConclusionEnterobactercloacaeresist anttothethethirdgenuscephalosporinsproducesESBLsmaily.Thereisasusceptibilityrateof97.66%toimipe nemforitinvitro,butitiSlesssusceptivetootherantibiotics.[Keywords]EnterobactercloacaeExtendedspectrum~-lactamaAmpCenzymePhenotype screeningtestThree.dimensiontest中图分类号:1t.969.3文献标识码:B文章编号:1726.619X(2oo8)10.0024.04随着广谱抗菌药的广泛使用,多重耐药细菌感染日益增多,已成为临床治疗细菌感染的一大难点.自p一内酰胺类抗生素的应用于临床以来,细菌产p.内酰酶种类也越来越多.革兰阴性菌的耐药问题主要是由于产生了ESBLs与AmpC酶,这两种酶于20 世纪80年代相继有报道,随后产酶株的检出越来越【作者单位】:浙江省义乌市中心医院输血科(322000) 【作者简介】:张益新,女,27岁,检验师.多,主要导致了耐药菌的交叉感染,成为严重的耐药问题.阴沟肠杆菌作为一种两类酶均能产生的细菌,已倍受重视.阴沟肠杆菌是人体的条件致病菌,主要存在于呼吸道与消化道,随着院内广谱抗菌药的广泛应用及患者基础疾病的存在,免疫抑制剂,激素类药物的使用导致患者免疫力低下而出现阴沟肠杆菌的异位定植或引起茵群失调,出现的感染以长期,反复,多部位,多重耐药为特征且不易治愈,中国现代实用医学杂志,2008年10月,第7卷,第10期这无疑升高了院内感染率.现国内外对阴沟肠杆菌的研究甚多,从耐药性分析,检测方法及其比较,到临床应用及对策都有报道.现ESBLs与AmpC酶的检测方法已基本成熟,本研究通过对阴沟肠杆菌产B-内酰胺酶(主要是ESBLs与AmpC酶)的监测,了解临床上耐三代头孢的阴沟肠杆菌耐药的主要原因及ESBLs与AmpC酶于此类耐药中出现频率,即其流行情况,并同时统计这些耐药菌对其它抗生素的耐药情况,现报道如下.1材料1.1菌株收集2006年1月~2007年2月我院来自各种标本对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌33例.大肠埃希菌标准菌株ATCC25922一株.质控株为经VITEK确认产ESBLs的肺炎克雷伯菌一株.1.2药敏纸片头孢他啶(CZA),头孢噻肟(CTX),亚胺培南(IPM),氨苄青霉素/舒巴坦(AMS),头孢西丁(FOX),头孢ⅡfB肟(FEP).1.3其它生理盐水,克拉维酸粉剂,氯唑西林粉剂,血平板,MH平板等.2方法本实验先采用纸片扩散法进行初筛,后用改良的三维试验进一步确认,具体方法如下.2.1表型筛选试验¨2.1.1实验方法按照K-B法的要求,新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于MH琼脂平板(~=90mm) 上,两对角分别贴上CZA,CTX和IPM,AMS.CZA,CTX与IPM间距25mm为佳,而与AMS间距20mm为佳,35~C培养24h后,判断结果.2.1.2结果判断(1)ESBLs阳性:CZA,CTX与AMS之间协同受AMS影响侧抑菌环直径一不受AMS影响侧2>5ram;(2)AmpC酶阳性:CZA,CTX与IPM之间拮抗&受IPM影响侧抑菌环直径一不受影响侧>5ram;(3)ESBLs阳性+AmpC酶阳性(1)+(2);(4)突变高产AmpC酶:三代头孢无抑菌圈而对IPM敏感.2.2改良三维实验2.2.1粗提酶(冻融裂解法)新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于1/4MH琼脂平板(cl~=90mm)上, 35~C培养24h后用无菌棉签取下全部菌苔于1ml灭菌生理盐水中(用】.5ml离心管),一80℃冻融数次,培养无菌生长后4℃1O000r/min离心20min,取上清液头孢硝噻吩纸片确定p一内酰胺酶存在后一20℃保存待用.2.2.2改良三维实验【J将大肠埃希菌标准株ATCC25922配成0.5McFarland密涂于两块MH琼脂(qb=90mm)1Omin后于平板中央分别贴1片30ggFOX 纸片和一片30ggFEP纸片,距纸片5mm处纸片两边分别垂直打两个lmm宽10mm长的槽,FOX纸片平板的两槽内分别加酶粗提液+1Op.g/ml氯唑西林(9:1)25~40gl和酶粗提液25~40pl而FEP纸片平板上的两槽内分别加酶粗提液25~40pl和酶粗提液+l0~tg/ml克拉维酸(9:1)25~401.tl,35~C培养24h后判断结果.2.2.3结果判断(1)抑菌圈均完整光滑表示为阴性结果,即两种酶均不产(如图1);(2)ESBLs阳性:加酶粗提液的槽与FEP纸片交界处出现扩大生长而其它处抑菌圈完整光滑(如图2);(3)AmpC酶阳性:加酶粗提液的槽与FOX纸片交界处出现扩大生长区而其它处抑菌圈完整光滑(如图2);(4)ESBLs+AmpC酶:加酶粗提液的槽与FEP纸片和FOX纸片交界处均有扩大生长区而其它处抑菌圈光滑完整(两个平板均如图2所示);(5)纸片与两槽交界处均出现扩大生长区表示抑制酶的抗生素量不足或产ESBLs与AmpC酶之外的酶(如图3).3结果3.1表型筛选试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为单产ESBLs的有23株,占69.70%;表现为单产AmpC 酶的有1株,占3.03%;同时产两种酶的有l株,占3.03%;而表现突变高产AmpC酶的有8株,占24.24%.3.2三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为单产ESBLs的有24株,占72.73%;没有单产AmpC酶;表现为同时产两种酶的有8株,占24.24%;结果阴性即不产这两种酶的有1株(头孢硝噻吩纸片确定13-内酰胺酶试验阳性),占3.03%.3.3两种方法结果比较33株阴沟肠杆菌表型筛选试验结果ESBLs阳性共有24株,占72.73%;三维试验结果ESBLs阳性的共有32株,占96.97%,两者符合率为71.88.00%(23/32),其中一株表型筛选试验结果产ESBLs而三维试验结果表现阴性即两类酶均不产.表型筛选试验结果33株阴沟巾AmpC酶阳性的共有10株,占30.30%;三维试验结果AmpC酶阳性的共有8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(s/10.图1阴性结果图2阳性结果图3酶抑制物浓度不足或产另类酶,需重测注:图1中上槽和2,3中左槽内加酶粗提液酶抑制剂;图1t}下槽和图2,3巾右槽内加酶粗提液.3.4药敏统计结果统计本院检出阴沟肠杆菌有254株,其中对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌有171株,占67.32%.这171株对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌耐药谱广泛,体外实验对亚胺培南敏感率为97.66%,头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%,其余氨基糖甙类,喹诺酮类等抗生索均高度耐药,而对氨苄西林与头孢唑啉呈全部耐药.而本实验的33株三代头孢耐药的阴沟肠杆菌的药敏情况,基本与总的统计结果符合,这些阴沟肠杆菌体外实验对亚胺培南敏感率为100.00%,而其他均呈现高度耐药甚至全部耐药.4讨论ESBLs是一种丝氨酸蛋白酶,Bush分类属Group2,而Ambler分类属ClassA,主要由质粒介导少数由染色体介导,往往具有多重耐药性,常见于肺克,大肠,阴沟等菌中.能灭活三代头孢菌素等p-内酰类抗生素和氨曲南,不能水解头霉素类,能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但不能被氯唑西林所抑制.VITEK对产ESBLs细菌检出率敏感性为99.5%, 特异性为100%【jJ.本研究表型筛选试验结果33株阴沟中产ESBLs24株,占72.73%;三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产ESBLs32株,占96.97%,两者符合率为71.88%(23/32),其中一株表型筛选试验结果产ESBLs而三维试验结果表现阴性即两类酶均不产.AmpC酶Bush分类属Groupl,而Ambler分类属ClassC,主要由染色体介导少数由质粒介导,常见于阴沟,产气肠杆菌等菌.AmpC酶能被I3一内酰类抗生素诱导,属诱导酶,它不能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但能被氯唑西林所抑制.本研究表型筛选试验结果33株阴沟中产AmpC酶l0株,占30.30%;三维试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产AmpC酶8株,占24.24%,两者符合率为80.00%(8/10) 与文献…89.58%较为相符.本实验利用表型筛选和三维试验相结合,以取长补短.表型筛选检测方便且快速,为NCCLS所推荐,此方法为检测ESBLs的可靠方法,但检测AmpC 酶结果易受多种因素影响,比如细菌本身对亚胺培南的诱导的敏感性(有报道显示29.2%为组成性高产AmpC酶而64.2%为诱导性高产AmpC酶)等使结果不易判读;而三维试验由ThornasonSander创立,为公认的AmpC酶检测方法,虽操作繁琐费时但准确度高,结果清晰易判读,是检测ESBLs和AmpC酶的经典方法.根据实验结果显示我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs,这与文阴沟肠杆菌以产AmpC酶为主不符,可能存在地区差异.我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌占67.32%,较文献阴沟肠杆菌对三代头孢耐药率为40%～60%稍高.本实验对三代头孢耐药菌株进行了常规药敏结果统计示此类菌对亚胺培南敏感率为97.66%,与1994~2001年中国ICUG耐药性监测研究发现对阴沟肠杆菌体外活性最好的是亚胺培南(95%)相符, 中国现代实用医学杂志,2008年10月,第7卷,第10期而头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%, 其余氨基糖甙类,喹诺酮类等抗生素均高度耐药,无临床应用价值.一般三代头孢菌素应用越早,越普遍的地区,细菌产ESBLs比例越高,ESBLs主要由质粒介导,很容易在细菌间传递扩散,导致对抗生素耐药细菌的广泛传播,及治疗选药的困难,多资料显示治疗产两种p一内酰酶的细菌所引起的感染,应首选碳青霉烯类抗生素l,而产某一种的可考虑应用复合制剂或联合用药等.实验室可注意分离菌株的耐药情况对两种酶进行测定,同时对临床加以指导从而避免滥用抗生素而出现高耐药的诱导产酶菌对临床治疗带来困难,通过合理用药而达到疗效同时延缓昂贵广谱抗生素的应用,减轻患者经济负担等,做到最大限度的节省人力,物力而达到最有效的治疗,尽量避免多重耐药的发生.【参考文献】[1]周志慧,李兰娟,俞云松,裘云庆,马亦林.两种检测AmpC酶方法的比较冲华检验医学杂志,2002,25 (2):88～90[2】陈东科,张志敏,张秀珍.三维法检测13内酰酶的影响因素探讨及方法的改进.中华检验医学杂志,2003,26(10):600～604[3】ChristinC.Sanders,ArthurL.BaJ'ry,JohnA.论着?27Washington,eta1.Detectionofextended—spetrum3-lactamasesproducingmembersofthefamily enterobactmiaceaewiththeVITEKESBLTest.J ChinMicrobiol,1996,34(12):2997～3001[4】余丹阳,刘又宁,崔岩.四月蒿药学资源.药物与临床杂志,2001,l6(6)[5]李艳,王海英,左云,李玉.肠杆菌科细菌产AmpC酶和ESBLs的状况及药敏检测分析.山东医药杂志.2002.42(2):39～41[6】陈民钧,王辉冲国危症监护病房革兰阴性菌耐药性连续7年监测研究_中华医学杂志,2003,83(5):375～38l【7]SaurinaG.QualeJM,ManikalVM,eta1.Antimi—crobialresistanceinenterobacteriaceaeinbrookly,NY:EpidemiologyandrelationtoantibioticusagepatternS.AntimicrobAgentsChemother,2000,45:895[8]肖倩.产ESBLs细菌的研究进展.广西医学杂志, 2002,24(5):673～676【9】余3-&.质粒介导的AmpC酶研究进展冲华检验医学杂志,2003,26(11):706—709[收稿日期2008-08-25]绝经后妇女长期补充雌三醇68例临床观察刘静肖J【摘要】由于人类寿命的延长,妇女在绝经后雌激素缺乏的情况下仍将继续生活20~30年,约占生命过程的l/3,由于雌激素水平的下降,使脂肪,糖,蛋白质,骨代谢紊乱,从而使冠心病,老年性痴呆,骨质疏松性骨折的发病率明显升高.为此,国内外学者广泛应用雌激素替代治疗,以缓解绝经期症状,提高绝经后妇女的生活质量,取得了良好效果.【关键词】绝经后妇女激素替代治疗有效性安全性中图分类号:R711.51文献标识码:B文章编号:本文对绝经后长期单纯补充雌三醇进行临床观【作者单位】:江西省妇幼保健院(江西南昌330006)察,对绝经后单纯补充雌三醇可使其骨代谢紊乩,冠心病,乳腺癌,子宫内膜癌减少40%,本文显示长期单纯性补充雌激素不会引起癌症.。
革兰阴性杆菌产AmpC酶及ESBLs的检测及耐药性为研究ESBLs、产AmpC酶革兰阴性杆菌的耐药状况，我们对158株革兰阴性杆菌进行耐药性分析及产AmpC酶和ESBLs的检测，并将结果报告如下。
一、材料和方法1 材料1.1 菌株来源2008年10月～2009年12月期间从我院临床标本中分离的至少对一种三代头孢菌素类耐药的部分革兰阴性杆菌。
其中包括大肠埃希菌47株，肺炎克雷伯菌38株，鲍曼不动杆菌23株，铜绿假单胞菌15株，阴沟肠杆菌15株，嗜麦芽假单胞菌6株，产气肠杆菌6株、液化沙雷氏菌4株，弗劳第枸橼酸杆菌4株，共158株。
1.2 试剂增菌培养基为M-H肉汤，三维实验培养基为M-H琼脂，头孢西丁(CFX)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶／棒酸(CAZ／CLA)，头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟／棒酸(CTX／CLA)为英国Oxoid公司产品。
GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林／克拉维酸、头孢噻吩、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、萘啶酸、头孢噻肟、亚胺培南13种抗菌药物。
1.3 质控菌株质控菌株E．Coil ATCC25922，K.Pneumoniae ATCC700603，E．Cloacae 029 M。
2 实验方法2.1 菌株鉴定所有菌株都用VITEK-32分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。
2.2 体外药物敏感试验采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株革兰阴性杆菌的MIC值，操作方法按照VITEK-32规定的方法进行。
2.3 产ESBLs菌株检测2.3.1 ESBLs筛选试验方法158株革兰阴性杆菌经VITEK-32检测MIC值，根据仪器专家系统提示，筛选出产ESBLs菌株。
2.3.2 ESBLs确证试验方法采用纸片扩散确证法，按2004年NCCLS推荐的标准纸片扩散确证法测定ESBLs，采用CAZ(30μg)、 CAZ／CLA(30μg/10μg)组合或者CTX(30μg)、CTX／CLA(30μg／10μg)组合，对ESBLs筛选实验阳性菌株进行双纸片协同扩散试验，任一组药物抑菌环的直径差≥5mm时，判定为ESBLs阳性菌株。
AmpC酶的检测方法及在临床耐药菌检测中的意义抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点，而我国又是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，因此，有必要加强对细菌耐药性的检测、监测，才能及时发现并控制耐药菌的传播。
目前，对于耐药菌产生的重要β-内酰胺酶—超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），大家有比较深入的认识，其检测技术也日趋成熟，但是对于在革兰氏阴性杆菌耐药中扮演着同样重要角色的酶—AmpC酶却了解甚少。
1 什么是AmpC酶AmpC酶属Ambler分类中的C组酶，其基因为ampC而得名。
AmpC酶是由细菌染色体或质粒介导产生的一类β-内酰胺酶，其作用于头孢菌素，且不被克拉维酸所抑制，故AmpC酶又称为头孢菌素酶。
染色体介导的AmpC酶可被β-内酰胺类抗生素诱导，属于诱导酶。
质粒介导的AmpC酶（pAmpC酶）与前者不同，pAmpC酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。
1989年韩国首次报道发现一种质粒介导的AmpC酶（CMY-1），1990年在美国发现另一种pAmpC酶（MIR-1），目前已有20多种pAmpC酶被陆续报道。
根据AmpC酶的遗传学关系，可将pAmpC酶分为5个家族：（1）枸橼酸杆菌起源的LAT族；（2）未知起源的FOX族；（3）阴沟肠杆菌起源的Entb族；（4）摩根摩根菌起源的Morg族；（5）蜂房哈夫尼起源的Haf族 [1]。
根据AmpC酶的产生方式又可将其分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。
（1）诱导高产酶：AmpC酶的合成往往与β-内酰胺类抗生素的存在有关。
大部分肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌在无β-内酰胺类抗生素存在的条件下只产生少量的AmpC酶。
当有诱导作用的β-内酰胺类抗生素存在时，AmpC酶的产量明显增加。
（2）持续高产酶：即产AmpC酶的菌株无论在有无β-内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC酶，其原因为去阻遏突变。
铜绿假单胞菌的耐药性分析471003河南洛阳市中信重型机械公司职工医院检验科摘要目的：了解我院铜绿假单胞菌对常用抗生素的的耐药情况，指导临床合理选用抗生素。
方法：采用常规方法进行培养，然后按标准鉴定程序进行鉴定。
药敏实验：利用纸片扩散法（K-B法）测定了15种抗生素对其的抗菌活性。
结果：铜绿假单胞菌对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星等抗生素的敏感率较高，对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松100%耐药，对其他抗生素出现不同程度耐药。
结论：铜绿假单胞菌耐药性较高，应加强药敏检测，指导临床合理用药。
关键词铜绿假单胞菌药敏抗生素耐药率铜绿假单胞菌是引起临床各种感染和医院内感染的主要致病菌之一，极易产生耐药性，在临床分离的革兰阴性菌中所占比率最大【sup】［1］【/sup】。
因此，加强对铜绿假单胞菌的耐药性检测对控制感染有重要意义。
2008年～2009年分离的92株铜绿假单胞菌的药敏结果进行分析。
资料与方法92株铜绿假单胞菌分离于2008～2009年住院患者送检的痰液、尿液、血液、咽拭子、浆膜腔液、脓性分泌物等标本。
菌种鉴定：标本按常规培养分离，菌种鉴定按《全国临床检验操作规程》进行。
药敏纸片：哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮／舒巴坦、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、氧氟沙星、亚胺培南，由北京天坛药物生物技术开发公司提供。
药敏试验：采用KB（纸片扩散）法。
MH培养基由天和微生物试剂有限公司提供，药敏纸片由天坛生物药物技术开发公司提供。
质控菌株ATCC27853（铜绿假单胞菌）。
结果判定按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准。
数据分析：采用WHONET-5.4药敏数据统计软件。
结果铜绿假单胞菌的检出情况：2008～2009年检出铜绿假单胞菌共92株（临床总分离菌1025株的9.0%）。
铜绿假单胞菌对15种抗生素的耐药率分别为头孢唑啉100%、头孢呋辛100%、头孢噻肟100%、头孢曲松100%，哌拉西林36.2%、头孢他啶29.1%、头孢吡肟27.3%、头孢哌酮45.3%头孢哌酮/舒巴坦32.5%、庆大霉素38.6%、阿米卡星31.3%、环丙沙星56.3%、氧氟沙星59.1%，亚胺培南5.9%、哌拉西林/他唑巴坦4.6%。
