m PEG 多肽在体积排阻色谱柱上的检测图谱

重组蛋白表征目录1. 重组蛋白介绍重组蛋白治疗药物的生产 . ........................................................................04 ........................................................................04 从药物发现到药物开发 ............................................................................04 蛋白治疗药物的表征 ................................................................................05 执行关键的QA/QC 程序 . ......................................................................... 05 应对重组蛋白药物表征的挑战 (05)2. 生物过程监控 .........................................................................06 生物过程分析技术总结 ............................................................................08 安捷伦应用文献........................................................................................ 083. 完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析技术汇总 . ................................09 ......................................11 安捷伦应用文献........................................................................................ 124. 糖基化分析糖链分析技术汇总 . .............................................................................13 . ................................................................................... 17 安捷伦应用文献........................................................................................ 185. 肽图分析肽图分析技术汇总 . .................................................................................19 . ................................................................................... 22 安捷伦应用文献........................................................................................ 226. 电荷异构体电荷异构体分析技术汇总 . ............................................................................ 23......................................................................... 25 安捷伦应用文献........................................................................................ 257. 聚集聚集体分析技术汇总 . ........................................................................................26 ................................................................................28 安捷伦应用文献........................................................................................ 288. 氧化氧化分析技术汇总 . .........................................................................................29 ....................................................................................31 安捷伦应用文献........................................................................................ 319. 氨基酸分析氨基酸分析技术汇总 .............................................................................32 . ....................................................... ........................ 34 安捷伦应用文献. (34)3重组蛋白治疗药物的生产从药物发现到药物开发4过去，大多数药物都是化学合成的小分子。

酶法水解燕麦多肽特性的研究张晓斌【摘要】研究蛋白酶水解工艺制备燕麦多肽,对燕麦多肽体积排阻进行高效液相色谱（SE-HPLC）分析,测定燕麦多肽的疏水性和溶解性,研究结果显示碱性蛋白酶对燕麦蛋白有较好的水解作用,当未用风味酶水解时,燕麦多肽的平均疏水性为105.43 kj/mol残基,当DH为16.86%时,溶解度达到了100%,并对燕麦多肽脱苦进行研究,测定燕麦多肽的分子量分布,燕麦多肽的相对分子质量分布范围在142～21281 Da 之间,主要集中在142～1413 Da之间。

%The technique of processing oat polypeptide by protease hydrolysis was studied.The oat polypeptide was analyzed by size exclusion high performance liquid chromatography（SE-HPLC）.The hydrophobic property and solubility of oat polypeptide was determined.The results showed that alkali protease has good hydrolyzation on oat protein.The average hydrophobic property of oat polypeptide was 105.43 kj/mol residues without flavorases.The solubility achieved 100% when 16.86% DH.Debitterizing of oat polypeptide was also studied and its molecular weight distribution was determined.The relative molecular mass distribution was around 142 ～ 21281Da,mainly in 142 ～1413 Da.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2012(020)001【总页数】4页(P16-18,21)【关键词】燕麦;蛋白酶;多肽;水解;疏水性;溶解性【作者】张晓斌【作者单位】国家脂肪酸技术研究推广中心,安徽宿州234023【正文语种】中文【中图分类】TS210.1燕麦具有特殊的营养、保健功能，有较好的开发前景［1］。

为了测定分子量大约为5000kd（即5×10^6 Da）的蛋白质分子的分子量，采用体积排阻色谱法（SEC）是一种常用的方法。

这种方法基于分子流过凝胶孔洞时的排阻作用来分离不同大小的分子。

在体积排阻色谱中，凝胶或聚合物的孔径决定了它们能够分离的最大分子量。

通常，商用SEC柱的孔径范围从几百纳米到几微米不等。

因此，对于5×10^6 Da的蛋白质分子，需要选择孔径足够小的凝胶来确保其完全排阻。

具体的选择取决于所使用的SEC柱的规格和性能。

一般来说，对于这种分子量范围的蛋白质，使用具有较小孔径的SEC柱是一种理想的选择，如使用细粒度的Superdex或Toya Soka GEL。

在实际操作中，使用适当规格的SEC柱并遵循色谱柱的操作指南至关重要。

通过这种方式，可以获得准确且可靠的分子量测定结果。

同时，也可以根据所使用的设备规格和手册，进行具体的色谱柱选择和操作步骤。

药物分析杂志Journal of Pharmaceutical Analysis药物分析杂志　线性关系考察　精密吸取混合对照品储备液、4、6、8、10 mL ，分别置10 mL 量瓶中，用70%甲醇水溶液定容至刻度，即得系列混合对照品溶液。

分别精密吸取上述系列混合对照品溶液10 μL ，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。

以峰面积（Y ）葛根素（puerarin ）　2. 连翘酯苷A （forsythiaside A ）　3. 黄芩苷（baicalin 牛蒡苷（arctiin ）混合对照品（mixed reference substances ）　B. 样品（sample ）　C. 缺葛根阴性样品（negative sample of Puerariae Lobatae Radix ）　D. 缺连翘阴性样negative sample of Forsythiae Fructus ）　E. 缺黄芩阴性样品（negative sample of Scutellariae Radix ）　F. 缺炒牛蒡子阴性样品（negative sample ofArctii Fructus ）　小儿解表颗粒HPLC 色谱图　HPLC chromatograms of Xiao ’er Jiebiao granules表2　4个成分的线性回归方程、相关系数（r ）及线性范围Tab. 2　The regression equation ，correlation coefficients and linear ranges of 4 components成分（component ）回归方程（regression equation ）r线性范围（linear range ）/（μg ·mL -1）葛根素（puerarin ）Y =45.19X +7.5460.999 9 4.799~47.99连翘酯苷A forsythiaside A ）Y =16.61X +1.3590.999 93.968~39.68黄芩苷（baicalin ）Y =32.55X +13.430.999 916.76~167.6牛蒡苷（arctiin ）Y =5.843X +0.992 80.999 97.082~70.82药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志。

体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种常用的色谱技术，也称为凝胶过滤色谱，它基于分子在流体中的尺寸和形状的差异，从而实现对分子的分离和分析。

而在SEC技术中，柱是至关重要的部分，体积排阻色谱柱是SEC技术中使用的一种特殊类型的柱，下面将详细介绍体积排阻色谱柱用的仪器。

1. 体积排阻色谱柱的特点体积排阻色谱柱是一种工程化的柱，与常规液相色谱柱有所不同。

它具有以下特点：（1）外围设计：体积排阻色谱柱通常采用不锈钢或者玻璃材质制成，外围设计均匀、结构合理，能够有效支持柱内填料，确保填料不会受到外力破坏。

（2）填料选择：体积排阻色谱柱的填料通常是粒径均匀的多孔球形颗粒，具有一定的孔径范围，能够较好地分离分子。

（3）稳定性：体积排阻色谱柱能够在一定的操作条件下保持较好的稳定性，不易受到外界影响而发生变形或损坏。

（4）易于连接：体积排阻色谱柱通常设计成易于连接的结构，可以与其他色谱设备灵活组装，便于操作和维护。

在体积排阻色谱实验中，除了色谱柱外，还需要配备一系列的仪器，以确保实验顺利进行。

主要的仪器包括：（1）色谱系统：用于将样品注入到色谱柱中，并控制流速、温度等操作参数。

色谱系统通常包括进样器、泵、检测器等部件。

（2）检测器：用于监测样品在色谱柱中的运动轨迹并进行信号采集和处理。

常见的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等。

（3）设备连接：用于连接色谱柱和其他仪器，包括管道、接头、密封件等。

这些连接件需要具有良好的密封性能，以避免样品泄漏。

（4）温控设备：用于控制色谱柱和样品的温度，以确保实验在恒定的温度条件下进行。

在选择和使用体积排阻色谱柱时，需要注意以下几点：（1）填料选择：根据待分离的目标分子的分子量范围，选择合适的填料颗粒大小和孔径范围。

（2）流速控制：流速对于色谱分离效果至关重要，需要根据实验要求合理设置流速。

体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱—水溶性体积排阻色谱柱水溶性体积排阻色谱柱概述SRT 、Zenix 、SRT-C 和Zenix-C 系列体积排阻色谱柱均采用经特殊表面修饰的高纯硅胶作为填料，其修饰方式为在硅胶表面化学键合一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。

SRT 、Zenix 和SRT-C 、Zenix-C 键合方式的不同之处在于：前两者固定相表面键合的是一层“站立”着的单分子层，而后两者则是一层“平躺”着的单分子层。

同时Zenix 和Zenix-C 为3 um 粒径，SRT 和SRT-C 为5 um 粒径，这四款体积排阻柱相互配合，可满足客户对分辨率及柱效的不同要求。

赛分科技完整的产品线为生物分子体积排阻分离提供了稳定、重现和最高分辨率的最优选择。

固定相的差异图1. 固定相修饰的差异：SRT 和Zenix 在硅胶表面修饰了一层“站立”着的亲水中性单分子层，SRT-C 和Zenix-C 在硅胶表面修饰了一层“平躺”的亲水中性单分子层。

粒径差异图2. Zenix 和Zenix-C 以3 µm 多孔硅胶为基质； SRT 和 SRT-C 以5 µm多孔硅胶为基质Zenix 和Zenix-C 的独特优点Zenix 和Zenix-C 色谱柱采用3 µm 粒径的填料，为生物分子的分离提供最高的柱效。

表1. Sepax SEC 色谱柱的主要特点SRT体积排阻色谱柱SRT SEC键合固定相采用专利的表面修饰技术，通过在高纯度具有良好机械稳定性的硅胶基质上，键合一层均匀的纳米厚度中性亲水薄膜而制备得到。

工艺采用可控的化学修饰技术，因此能确保柱与柱之间有着可靠的重现性。

SEC填料采用化学键合技术，表面亲水涂层覆盖完全，因此不仅具有优异的稳定性，而且对蛋白等生物样品的非特异性吸附作用也非常小。

精心设计的大孔体积可保证高的分离容量以及优异的分辨率。

广泛应用于生物分子及水溶性聚合物的分离和检测。

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。

生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。

随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。

一些新方法、新思路的应用。

不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。

本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。

1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。

对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。

这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

1.1 高效液相色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC 应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。

因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。

如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。

为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。

体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）是一种分离技术，通过固定在柱内的多孔分子筛来分离溶液中的大分子和小分子。

SEC技术在生物化学、药物研究和生物医学领域中得到广泛应用，因此对SEC柱用的仪器也要求越来越高。

SEC柱用的仪器主要包括色谱柱、色谱柱箱、流动相系统、检测器和数据处理系统等部分。

色谱柱是SEC技术的核心组成部分，它通过分子筛效应来分离目标分子。

色谱柱的选型会直接影响到分离效率和分辨率，因此选择合适的色谱柱对于SEC柱用的仪器至关重要。

常见的色谱柱材质有硅胶、聚碳酸酯、聚乙烯醇等，不同的材质适用于不同的分析范围和分子量范围。

色谱柱箱是SEC柱用的仪器中的另一个重要组成部分，它负责将溶液以流动相的形式送入色谱柱，并确保色谱柱稳定地运行。

色谱柱箱通常需要具备一定的自动化功能，如流速控制、温度控制和压力控制等，以确保分析的精确度和重复性。

一些先进的色谱柱箱还具备多柱并联的功能，可以同时进行多种样品的分析，提高实验效率。

流动相系统是SEC柱用的仪器中的另一个关键部分，它负责将溶液从样品进样口送入色谱柱中，以进行分析。

流动相系统通常需要具备高精度的流速控制功能，以确保色谱柱内的流速稳定，并通过机械泵、梯度泵等方式来实现不同流速的控制。

一些先进的流动相系统还具备多通道进样功能，可以同时进行多个样品的分析，提高实验的效率。

检测器是SEC柱用的仪器中的另一个重要组成部分，它负责检测色谱柱中流出的溶液成分，并将检测到的信号转化为电信号输出。

常见的检测器有紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等，不同的检测器适用于不同的分析目标。

在SEC技术中，光散射检测器特别适用于大分子的分析，因为它可以直接测定分子的分子量分布和聚集度等参数。

数据处理系统是SEC柱用的仪器中的最后一个重要组成部分，它负责对检测器输出的信号进行数据处理和分析，并对结果进行显示和记录。

实验四体积排除色谱（SEC）法测定聚合物的分子量及分子量分布分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。

聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。

体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC）是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。

其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。

采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。

该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。

体积排除色谱在一段时期内常称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）、凝胶色谱。

从分离机理看，使用体积排除色谱较为确切。

一、实验目的：1．了解SEC法测定高聚物分子量及分子量分布的原理；2．掌握Waters—510型仪器的操作技术；3．掌握SEC数据处理方法。

二、基本原理：体积排除色谱（SEC）分离机理认为在多孔载体（其孔径大小有一定的分布，并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球）充填的色谱柱里引入聚合物溶液，用溶剂淋洗，体系是处于扩散平衡的状态。

聚合物分子在柱内流动过程中，不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同，大分子能渗透进去的孔洞数目比小分子少，有些孔洞即使大小分子都能渗透进去，但大分子能渗透的深度浅。

溶质分子的体积越小渗透进去的几率越大，随着溶剂流动，它在柱中保留的时间越长。

如果分子的尺寸超过载体孔的尺寸时，则完全不能渗透进孔里，只能随着溶剂从载体的粒间空隙中流过，最先淋出。

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长，于是整个样品即按分子尺寸由大到小的顺序依次流出。

色谱柱总体积为V t，载体骨架体积为V g，载体中孔洞总体积为V i，载体粒间体积为V0，则V t＝V g＋V0＋V iV0和V i之和构成柱内的空间。

静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs ）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。

光散射也是在荧光检测之外蛋白质多聚体的最敏感检测方法之一。

就其尺寸而言，mAb 多聚体产生散射光时比其吸收214或280 nm 的UV 光时更有效率。

尽管如此，与简单的紫外检测相比，光散射并非一种即插即用的技术。

本文提供了一些有助于提高信噪比和整个系统稳定性的建议。

首先，务必保持整个系统清洁并经常更换洗脱溶液。

当使用不含叠氮化钠的缓冲溶液时，应该要每天更换。

当检测对象为蛋白质时，叠氮化钠不会在散射信号中引起任何问题。

因此建议在含水缓冲溶液中加入0.05 %的叠氮化钠，防止细菌生长。

在使用有机溶剂时，对洗脱溶液进行适当的脱气至关重要。

对任何洗脱溶液，无论是有机溶剂还是水溶液，都需要进行彻底过滤。

因为UV 检测不到的气泡和小颗粒，对光散射信号会产生严重干扰。

建议定期更换在线过滤器，并使用0.1 μm 滤膜过滤缓冲溶液，以避免基线噪音。

由于样品自身杂质污染检测器的情况会经常出现，建议在没有安装色谱柱的系统中使用含1 % SDS 的水冲洗4～5小时，接着用水快速排气，并用20 %乙醇和80 %水的混合溶液过夜冲洗。

对于持续的噪音，可以使用样品降解溶剂冲洗系统。

分析蛋白质样品时，蛋白酶可能会有所帮助。

按照色谱柱操作手册中的清洗方法清洗色谱柱，可以减少HPLC 色谱柱产生的噪音。

色谱柱过载也会导致保留时间之外出现样品分子，导致噪音和漂移基线。

TSKgel SW XL 系列色谱柱可使用0.1 M 甘氨酸/盐酸缓冲溶液（pH 3）过夜冲洗以进行有效清洗。

由于系统流速也会影响噪音级别，只可对流速渐进调整。

用4～5倍柱体积的洗脱溶液在运行流速下平衡色谱柱可稳定基线。

1色谱柱：流速：流动相：进样量：检测：HPLC 系统：MALS 检测器：TSKgel G3000SW XL , 5 µm, 7.8 mm ID x 30 cm L ； 1 mL/min ； PBS ； 20 µl ； 90°LS （红色），RI （灰色）和UV @ 280nm （蓝色）； LC-20A prominence, Shimadzu ；minDAWNTM TREOS, Wyatt Technology Corp.时间分钟0.250.200.150.100.050.00SEC-UV-RI-MALS 法高效分析蛋白质多聚体单克隆抗体的SEC-UV-RI-LS 分析应用笔记分析实际上，静态光散射是一种多检测器测试方法，来自于浓度检测器UV 或RI 的浓度信号对其非常重要。