当前位置：文档之家 › 单克隆抗体的重链和轻链在体积排阻色谱柱上的检测

单克隆抗体的重链和轻链在体积排阻色谱柱上的检测

  • 格式：pdf
  • 大小：141.63 KB
  • 文档页数：1

下载文档原格式

  / 1

合集下载

糖蛋白药物的多糖结构解析进展

糖蛋白药物的多糖结构解析进展

糖蛋白药物的多糖结构解析进展刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【摘要】细胞表达的治疗性单克隆抗体多数是糖蛋白.附着在蛋白质上的多糖直接影响蛋白质药物的稳定性、生物活性及免疫原性.因此,应对糖蛋白产品上的多糖进行充分分析,以控制产品质量.然而,糖蛋白上多糖的复杂性对检测带了艰巨挑战.介绍了糖蛋白上多糖分析的最新进展,以及利用凝集素芯片技术的高通量多糖分析法,重点介绍了用于检测糖基化位点、糖链结构和含量的测定分析方法,以期为糖蛋白药物的研发提供参考.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2016(006)004【总页数】5页(P244-248)【关键词】治疗性糖蛋白药物;多糖分析;凝集素芯片技术【作者】刘艳玲;刘晓志;赵伟;王志明【作者单位】华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015;华北制药集团新药研究开发有限责任公司,抗体药物研制国家重点实验室,石家庄050015【正文语种】中文细胞表达的生物技术药物多数是糖蛋白，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白、生长因子、细胞因子、酶和激素。

这些药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他危及生命的疾病的治疗。

适度糖基化对药物的溶解性、稳定性、生物活性、安全性、药代动力学和药效动力学等特征具有重要影响。

药物糖基化不但可以增加药物体外稳定性，还可以保护蛋白药物免受体内蛋白酶的降解。

非糖基化促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)较糖基化EPO，更易受到化学物质、pH变化或是加热引起的变性或降解。

蛋白质糖基化可以影响蛋白药物PK/PD特征，研究显示，末端半乳糖部分糖基化蛋白，较末端唾液酸完成糖基化蛋白具有更短的循环寿命。

由于肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体同半乳糖结合，促进了肝脏对部分糖基化蛋白的清除。

单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发-Waters

单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发-Waters

抗体的SEC分析方法开发
5
[ 应用纪要 ]
0.030 0.025 0.020
0.4 mL/min 聚集体 = 3.14% USP分离度 = 2.0
0.015
0.010
0.005
0.000
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 min
0.030 0.025 0.020
为了展示这些影响，我们在4.6 x 150 mm以及4.6 x 300 mm的色谱柱上运行了一组蛋白标准品。 校准曲线的对比结果显示，与150 mm色谱柱相比，300 mm色谱柱的校准曲线斜率更加平缓， 说明增加色谱柱长度可增强其分离能力(图6)。
150 mm
蛋白质
分子量
6.5
300 mm
甲状腺球蛋白 670000
除了蛋白质标准品外，我们还评估了溶于50-250 mM氯化钠中的小鼠单克隆抗体(mAb) 的SEC分离情况(图2)。正如通常会在凝胶过滤填料上观察到的一样2，较大的离子强度 可减少mAb单体的峰拖尾现象并使峰形更窄。当氯化钠浓度从50升至200 mM时，mAb的 峰高从0.189升至0.289。USP拖尾因子也从1.64降至1.22。而当流动相离子强度从200升 至250 mM氯化钠时，上述变化不再明显(USP拖尾因子 = 1.20)。
200 mM 聚集体 = 5.27% USP分离度 = 1.57 USP拖尾因子 = 1.22
0.0
0.3
250 mM
聚集体 = 5.39%
0.2
USP分离度 = 1.58
USP拖尾因子 = 1.20
0.1
0.0
0.5
1.0
1.5

免疫亲和柱净化柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测法测定粮谷中的T-2毒素

免疫亲和柱净化柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测法测定粮谷中的T-2毒素
B7 DE1 ) ，@F G+ ! ，HF7 I". ) ，J,7 K+15 ) ，<L8= HM%E2M+Leabharlann 5 ) ，J8(N GEA.15 )
（ ! $ %&’()&)* +),-. / " +0&, 1)2345,&() ’)6 78’-’),&)4 98-4’8 ，:’;&’) !!#$$! ，<=&)’ ； % $ !=4).’)* >*-&58;,8-4 ?)&@4-2&,. ，!=4).’)* !!$!#! ，<=&)’ ）
! ! 自然界中多种农作物的致病菌可以产 生 #"# 毒 素， 其中大部分来自镰孢菌属， 产毒能力随真菌种类 不同而异， 并受 到 环 境 因 素 的 影 响。 玉 米 和 黑 麦 中 的致病菌产毒能 力 较 强， 其 次 为 大 麦、 大 米 和 小 麦。 #"# 毒素的毒 性 主 要 作 用 于 增 殖 活 跃 的 细 胞， 如骨 髓、 肝、 黏膜上皮和 淋 巴 细 胞 等， 而对淋巴细胞的损 呕 害最为严重。 #"# 毒 素 的 中 毒 症 状 主 要 为 恶 心、 吐、 食欲减退或拒 食、 倦 怠 和 体 重 减 轻 等， 同时还具 有致畸性和弱的致癌性。在动物实验中发 现 #"# 毒 素对动 物 的 小 肠、 脾、 胸 腺、 肠 黏 膜、 淋 巴 器 官、 造血 器官和睾丸都有损 伤， 过量时可导致骨髓和淋巴组 织坏死、 溶解、 外周 血 粒 细 胞 减 少， 淋巴细胞严重缺 乏。同时 #"# 毒素 进 入 机 体 后， 迅速经酯酶代谢成 $#"# 毒素等多 种 代 谢 物［ ( ］。 国 际 上 对 #"# 毒 素 非 常重视， 前苏联已 提 出 国 家 的 食 品 卫 生 限 量 标 准 为 ()) ! % ! &% 。我国小麦 中 #"# 毒 素 的 污 染 率 和 含 量 是比较高的， 据对 "") 份小麦样品的调查结果 表明， 正常小麦中 #"# 毒 素 的 污 染 阳 性 率 为 *) ’ ， 平均含 量为 ’"& " ! % ! &% ， 最高含量可达( (##& ) ! % ! &%［ # ］。 ! ! #"# 毒 素 的 测 定 方 法 主 要 有： 薄层色谱法

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用陈泓序;屈锋【摘要】单克隆抗体药物在生物制药行业占有重要地位,是生物医药领域发展的主要方向.因此,单克隆抗体药物的质量控制已成为全球生物制药企业及法规机构关注的热点,对单克隆抗体药物精确表征的需求日益增加.毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、样品用量少等特点,已成为单克隆抗体药物分析和质量控制的重要手段.该文对毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳等模式在单克隆抗体药物的纯度分析、等电点测定、电荷异质性分析和 N-寡糖分析的应用进行综述,以期为国内单克隆抗体研究开发和生产的企事业单位提供技术参考.%Therapeutic monoclonal antibodies play an important role in biopharmaceuticals, and gradually become one of the main directions of the development of biological medicine. The quality control of monoclonal antibodies has also become the focus of global biopharma compa-nies and regulatory agencies. Capillary electrophoresis has become an important tool in the analysis of monoclonal antibodies with multi-modes and high resolution. In this paper,we reviewed the application of capillary gel electrophoresis,capillary isoelectric focusing and capil-lary zone electrophoresis on the analysis of purity,isoelectric point/charge heterogeneity and N-glycan profiling of therapeutic monoclonal antibodies.【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2018(036)003【总页数】14页(P195-208)【关键词】毛细管电泳;毛细管凝胶电泳;毛细管区带电泳;毛细管等电聚焦;单克隆抗体药物;纯度;电荷异质性;N-寡糖;综述【作者】陈泓序;屈锋【作者单位】北京理工大学生命学院,北京100081;北京理工大学生命学院,北京100081【正文语种】中文【中图分类】O658随着单克隆抗体技术近40年的发展,其在生物医学研究和生物制药以及临床治疗中的应用发展迅速,已占有重要地位。

(仅供参考)治疗用单克隆抗体质量控制 讲义

(仅供参考)治疗用单克隆抗体质量控制 讲义
Fab段即抗原结合片段；Fc片段 即可结晶片段，相当于IgG的 CH2和CH3功能区。
Fab：fragment antigen binding Fc: fragment crystallizable
免疫球蛋白的水解片段示意图
治疗性抗体发展史
第一代抗体药物：来源于动物的多价抗血清 早年制备抗体的方法是以相应抗原免疫动物，获得抗血清。 抗原通常含有不同的表位，加之所获得的抗血清也未经免疫纯
4 应对标准物质进行稳定性考察，以确定标准物质 在特定条件下保持正常结构及适宜效价的时间。
抗体药物的质量控制
理化对照品的结构验证： 重组抗体药物空间结构复杂，正确的结构是其生物
学活性的前提和基础，因此要对抗体的结构进行验 证。 在抗体药物的常规质控中，对每批产品均进行全面 的结构分析，不仅成本昂贵，而且工作量巨大，难 以完成。 在这种情况下，理化对照品显得尤为必要，只需对 对照品进行充分的结构分析，证明其结构正确；同 时在常规质控中将待测产品与之同时测定，如果结 果一致，可基本说明待测样品结构正确。
抗体药物的质量控制
理化对照品的结构分析包括以下内容： 1 一级结构验证 1.1 质谱分子量测定：可以直接测定完整抗体的分子量，
也可以用糖苷酶将糖基切除后再测定抗体蛋白部分的分子 量，还可以用还原剂将抗体的二硫键打开，分别测定轻、 重链的分子量。测得抗体的分子量后，将其与理论分子量 进行比较，以初步判断蛋白的氨基酸序列是否正确。
免疫球蛋白的分类：根据免疫球蛋白重链 C区的氨基酸组成和抗原特异性不同，将 免疫球蛋白分为IgG 、IgA、IgM、IgD、 IgE五类。
IgG中，根据其重链抗原性和二硫键的数 目和位置的不同，又可分为IgG1~ IgG4四 个亚类。
抗体及其结构

分子体积排阻高效液相色谱法测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物的浓度

分子体积排阻高效液相色谱法测定低浓度重组人源化抗BCMA/CD3双特异性抗体药物的浓度

药物分析杂志Journal of Pharmaceutical Analysis药物分析杂志　线性关系考察　精密吸取混合对照品储备液、4、6、8、10 mL ，分别置10 mL 量瓶中，用70%甲醇水溶液定容至刻度，即得系列混合对照品溶液。

分别精密吸取上述系列混合对照品溶液10 μL ，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定峰面积。

以峰面积（Y ）葛根素（puerarin ）　2. 连翘酯苷A （forsythiaside A ）　3. 黄芩苷（baicalin 牛蒡苷（arctiin ）混合对照品（mixed reference substances ）　B. 样品（sample ）　C. 缺葛根阴性样品（negative sample of Puerariae Lobatae Radix ）　D. 缺连翘阴性样negative sample of Forsythiae Fructus ）　E. 缺黄芩阴性样品（negative sample of Scutellariae Radix ）　F. 缺炒牛蒡子阴性样品（negative sample ofArctii Fructus ）　小儿解表颗粒HPLC 色谱图　HPLC chromatograms of Xiao ’er Jiebiao granules表2　4个成分的线性回归方程、相关系数（r ）及线性范围Tab. 2　The regression equation ，correlation coefficients and linear ranges of 4 components成分（component ）回归方程（regression equation ）r线性范围（linear range ）/（μg ·mL -1）葛根素（puerarin ）Y =45.19X +7.5460.999 9 4.799~47.99连翘酯苷A forsythiaside A ）Y =16.61X +1.3590.999 93.968~39.68黄芩苷（baicalin ）Y =32.55X +13.430.999 916.76~167.6牛蒡苷（arctiin ）Y =5.843X +0.992 80.999 97.082~70.82药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志药物分析杂志。

高效分子排阻色谱法测定注射用头孢匹胺钠中聚合物的含量

高效分子排阻色谱法测定注射用头孢匹胺钠中聚合物的含量郭艳娟;郭福庆【摘要】目的:建立高效分子排阻色谱法测定注射用头孢匹胺钠中聚合物的含量.方法:采用TSK-GEL G2000SWXL色谱柱(7.8 mm ×300 mm);以磷酸盐缓冲液(pH 7.0) [0.01 mol/L磷酸氢二钠-0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液(61∶ 39)]-乙腈(97.5:2.5)为流动相;检测波长231 nm;柱温30℃;流速0.8 ml/min;进样量10μl.结果:头孢匹胺在1.962 5～19.624 5μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1.0000),最低检出浓度0.08 μg/ml.结论:建立的方法简单、快速、灵敏度高,可有效控制产品的质量.【期刊名称】《天津药学》【年(卷),期】2015(027)002【总页数】4页(P21-24)【关键词】注射用头孢匹胺钠;高分子聚合物;TSK-GEL G2000SWXL凝胶色谱柱【作者】郭艳娟;郭福庆【作者单位】天津市药品检验所,天津300070;天津市药品检验所,天津300070【正文语种】中文【中图分类】R927.2注射用头孢匹胺钠(cefpiramide sodium)近年来广泛应用于临床，对革兰阳性菌有很强的抗菌作用，对革兰阴性菌在内的细菌亦有广谱抗菌活性。

同时，对绿脓杆菌等葡萄糖非发酵革兰阴性杆菌有很强的抗菌活性，本药作用为杀菌，并对各种细菌产生的β-内酰胺酶稳定。

研究证实，β-内酰胺类抗生素中的高分子聚合物是引发速发型过敏反应的过敏原[1，2]，且药品中高分子聚合物的含量直接影响过敏反应的发生率。

故控制产品中的高分子聚合物的含量，对减少此类抗生素过敏具有重要意义[3]。

在传统的聚合物控制中，多采用葡聚糖凝胶G10色谱柱分析。

有文献报道[4]，注射用头孢匹胺钠也采用葡聚糖凝胶柱进行聚合物的测定，但该法专属性差，分离效率低，灵敏度低，分析时间长。

单克隆抗体及其高聚体的体积排阻色谱分析方法开发-Waters


2
抗体的SEC分析方法开发
50 mM
蛋白质
分子量
6.5
200 mM
甲状腺球蛋白 670000
250 mM
γ-球蛋白
158000
5.5
卵清蛋白
44000
肌红蛋白
17000
维生素B12 1350
4.5
AU Log MW
3.5
2.5
1.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
洗脱体积(mL)
图1.氯化钠对SEC校准曲线的影响。 注：由于蛋白质在溶液中的形状不同，校准点并非呈一条直线。
200 mM 聚集体 = 5.27% USP分离度 = 1.57 USP拖尾因子 = 1.22
0.0
0.3
250 mM
聚集体 = 5.39%
0.2
方法条件 LC条件： 系统：
波长： 色谱柱：
柱温： 样品温度： 进样体积： 流速： 流动相： 最终组成：
数据管理 软件：
配备TUV和钛合金流通池 的ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统
214和280 nm
ACQUITY UPLC BEH200 SEC 1.7 µm, 4.6 x 150 mm, 部件号186005225
0.3 0.2 0.1 0.0 0.3 0.2
0.2 0.1 0.0
0.2 0.1 0.0
0.2 0.1 0.0
1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 min
0.1
50 mM 聚集体 = 1.19% USP分离度 = 0.92 USP拖尾因子 = 1.64

scfv名词解释(一)

scfv名词解释(一)SCFV名词解释SCFV（Single-Chain Fragment Variable）是一种在蛋白质工程中常用的单链抗体分子，由抗体的轻链变量区和重链变量区通过肽链连接起来形成。

SCFV拥有小分子量、高亲和力和较高的稳定性，因此被广泛应用于抗体工程、免疫治疗和生物药物研发等领域。

以下是与SCFV相关的名词解释：1. 重链和轻链•重链：抗体分子中较为重的一条多肽链，通过二硫键连接形成抗体的抗原结合区。

在SCFV中，重链变量区主要负责与抗原结合。

•轻链：抗体分子中较为轻的一条多肽链，通过二硫键连接形成抗体的抗原结合区。

在SCFV中，轻链变量区也负责与抗原结合，并与重链变量区通过肽链连接。

2. 亲和力•亲和力：指抗体与抗原结合的结合力强度。

亲和力越高，抗体与抗原的结合越牢固。

SCFV经过优化设计后具有较高的亲和力，能够更有效地与特定抗原结合。

3. 抗体工程•抗体工程：利用基因工程技术对抗体进行改造和优化的过程。

在抗体工程中，SCFV常被用作基础模块，通过引入不同的CDR序列（亮链和重链变量区间）或其他改变，以获得更高亲和力或特定特性的抗体。

4. 免疫治疗•免疫治疗：利用抗体或其他免疫分子来治疗疾病的方法。

SCFV作为一种小分子抗体，具有较好的穿透性和渗透性，使其在免疫治疗中具有优势。

5. 生物药物研发•生物药物研发：开发和生产利用生物技术制造的药物。

SCFV由于其较小的分子量和优良的稳定性，成为生物药物研发的理想选择，可以用于制备高效、安全的药物。

以上是对SCFV相关名词的解释。

SCFV作为一种重要的蛋白质工程工具，持续推动着抗体工程、免疫治疗和生物药物研发领域的发展。

单克隆抗体

单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。

他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。

下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。

1)初次免疫,间隔2～3周。

2)第二次免疫,间隔3周。

3)第三次免疫10天后,取血测效价。

4)加强免疫3天后,取脾融合。

2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。

将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。

1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。

2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。

3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。

4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。