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重组蛋白表征目录1. 重组蛋白介绍重组蛋白治疗药物的生产 . ........................................................................04 ........................................................................04 从药物发现到药物开发 ............................................................................04 蛋白治疗药物的表征 ................................................................................05 执行关键的QA/QC 程序 . ......................................................................... 05 应对重组蛋白药物表征的挑战 (05)2. 生物过程监控 .........................................................................06 生物过程分析技术总结 ............................................................................08 安捷伦应用文献........................................................................................ 083. 完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析技术汇总 . ................................09 ......................................11 安捷伦应用文献........................................................................................ 124. 糖基化分析糖链分析技术汇总 . .............................................................................13 . ................................................................................... 17 安捷伦应用文献........................................................................................ 185. 肽图分析肽图分析技术汇总 . .................................................................................19 . ................................................................................... 22 安捷伦应用文献........................................................................................ 226. 电荷异构体电荷异构体分析技术汇总 . ............................................................................ 23......................................................................... 25 安捷伦应用文献........................................................................................ 257. 聚集聚集体分析技术汇总 . ........................................................................................26 ................................................................................28 安捷伦应用文献........................................................................................ 288. 氧化氧化分析技术汇总 . .........................................................................................29 ....................................................................................31 安捷伦应用文献........................................................................................ 319. 氨基酸分析氨基酸分析技术汇总 .............................................................................32 . ....................................................... ........................ 34 安捷伦应用文献. (34)3重组蛋白治疗药物的生产从药物发现到药物开发4过去，大多数药物都是化学合成的小分子。
单克隆抗体和重组治疗性蛋白质的聚体分析生物制品中的聚体的来源，类型和大小不同，并且是由多种因素引起的。
监管机构特别关注的是具有增强免疫应答从而引起不良临床反应的蛋白质聚体，或可能损害抗体或蛋白药物产品安全性和功效的聚体。
在动物和临床研究中已经报道了蛋白质聚体可以增强免疫反应。
尽管可以预期对人外源蛋白物质的免疫反应，但免疫系统可能会通过耐受性分解机制对具有内源性的聚集蛋白制品产生强烈反应。
在耐受性破坏机制中，蛋白质聚体可在蛋白质复合物的形成中充当促进剂，这些蛋白质复合物可触发B细胞针对该蛋白质抗体的产生，而与T辅助细胞无关。
这类反应的基础来自免疫原概念，其中抗原具有多于半抗原的聚合结构形式存在，在病毒样颗粒组织中间隔5-10nm，大小超过100kDa，可以克服免疫力。
这种情况可能解释了内源性蛋白质的意外中和，并且产生了深远的临床效果。
这种类型的机制最受关注的是高分子量（HMW）聚集体，这些聚体保留了其单体对应物的大多数天然构型，并且可以以这种方式使抗原成核。
另外，显示非天然蛋白质构象的聚体可能被免疫系统视为新抗原，这可能会触发抗抗体形成。
在这里我们提供了有关蛋白质药物中的聚体的表征，检测方法以及药物制造商已实施的各种控制措施的监管观点。
抗体或蛋白聚体的分类聚体的分类是一项复杂的任务，目前还没有全面的分类方法。
分类的困难在于可以对聚合进行多个类别的分组。
下表1列出了生物制药中最常见的聚体类别。
为了有助于理解所讨论的聚体类型，常见的聚体类型有：二聚体，可逆聚体，共价聚体和颗粒，这些都是蛋白聚集中常见的形式。
聚体的其他分类可以基于聚体的大小，因为这可能与潜在的不良临床反应直接相关。
聚体的大小范围从可溶性二聚体和其他多聚体（表观球状直径约5-10nm），包括高分子量（HMW）聚集体到可溶或不溶的有核聚集体，到较大的不溶性物质（被识别为亚可见和可见）颗粒（表观球状直径约20–50µm）。
在可溶性聚集体组中，较大的聚集体（例如HMW物）可能更能引发产生不良临床后果的免疫原性应答。
抗CD52单克隆抗体HPLC-肽图分析方法的建立乔玉玲;黄铮;秦海艳;宋兰兰;陈继军;安晨;叶星;毛晓燕【摘要】建立高效液相色谱(HPLC)-肽图分析方法,用于抗人CD52单克隆抗体的专属性鉴别.抗CD52单抗样品经盐酸胍变性、DTT还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷基化.超滤置换酶切缓冲液后进行胰蛋白酶酶切并终止.色谱条件:采用Eclipse XDB-C 18 4.6×250 mm 5 μtm(Aglient)色谱柱,0.1％TFA水溶液与0.1％TFA乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为214 nm,柱温为30℃;质谱条件:分析时长135 min;检测方式正离子,TOF;MS+扫描范围350-1 500 Da;Product Ion+扫描范围100-1 500 Da;质谱分辨率40 000;Exceeds,150 Cps.CD52单抗重链CDR1、CDR3、轻链CDR1对应肽段由质谱鉴定出.HPLC-肽图方法专属性验证显示辅料制剂及异种抗体对检测结果无干扰;精密度验证结果显示目标峰的峰面积RSD％均在1.7％-7.6％之间.且目标峰的保留时间RSD％均在0.1％-0.2％之间,小于5％的可接受标准;耐用性结果显示,3μg胰蛋白酶、37℃和18h的酶切条件是最合适的样品处理条件.基于CDR相关肽段鉴别的HPLC-肽图分析方法可定性鉴定出抗CD52单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人CD52单抗的专属性鉴别并可用于质量控制及批检验放行.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)011【总页数】7页(P216-222)【关键词】单克隆抗体;肽图分析;高效液相色谱;质谱【作者】乔玉玲;黄铮;秦海艳;宋兰兰;陈继军;安晨;叶星;毛晓燕【作者单位】兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;上海泰因生物技术有限公司,上海201499;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046;兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗工程技术研究中心,兰州730046【正文语种】中文人类CD52属于短链GH锚定糖蛋白家族，定位于人1号染色体（1p36.1）［1］，它广泛分布于人淋巴细胞、单核细胞等造血细胞上，其直接的生物学功能至今尚未明确，但是多组实验室及临床数据显示对其进行人工干预及调控，可以治疗和预防多种与淋巴细胞有关的疾病［2-4］。
体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱体积排阻色谱柱—水溶性体积排阻色谱柱水溶性体积排阻色谱柱概述SRT 、Zenix 、SRT-C 和Zenix-C 系列体积排阻色谱柱均采用经特殊表面修饰的高纯硅胶作为填料，其修饰方式为在硅胶表面化学键合一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。
SRT 、Zenix 和SRT-C 、Zenix-C 键合方式的不同之处在于：前两者固定相表面键合的是一层“站立”着的单分子层，而后两者则是一层“平躺”着的单分子层。
同时Zenix 和Zenix-C 为3 um 粒径，SRT 和SRT-C 为5 um 粒径，这四款体积排阻柱相互配合，可满足客户对分辨率及柱效的不同要求。
赛分科技完整的产品线为生物分子体积排阻分离提供了稳定、重现和最高分辨率的最优选择。
固定相的差异图1. 固定相修饰的差异：SRT 和Zenix 在硅胶表面修饰了一层“站立”着的亲水中性单分子层，SRT-C 和Zenix-C 在硅胶表面修饰了一层“平躺”的亲水中性单分子层。
粒径差异图2. Zenix 和Zenix-C 以3 µm 多孔硅胶为基质； SRT 和 SRT-C 以5 µm多孔硅胶为基质Zenix 和Zenix-C 的独特优点Zenix 和Zenix-C 色谱柱采用3 µm 粒径的填料，为生物分子的分离提供最高的柱效。
表1. Sepax SEC 色谱柱的主要特点SRT体积排阻色谱柱SRT SEC键合固定相采用专利的表面修饰技术，通过在高纯度具有良好机械稳定性的硅胶基质上，键合一层均匀的纳米厚度中性亲水薄膜而制备得到。
工艺采用可控的化学修饰技术，因此能确保柱与柱之间有着可靠的重现性。
SEC填料采用化学键合技术，表面亲水涂层覆盖完全，因此不仅具有优异的稳定性，而且对蛋白等生物样品的非特异性吸附作用也非常小。
精心设计的大孔体积可保证高的分离容量以及优异的分辨率。
广泛应用于生物分子及水溶性聚合物的分离和检测。
Agilent InfinityLab 生物惰性液相色谱解决方案真正的生物惰性实现高效生物分子分析利用安捷伦缓冲液顾问软件进行自动化方法开发和简捷的 pH 筛选，结合最新的生物色谱柱技术，可实现更快的生物分析。
出色的样品输送和高样品容量确保仪器利用率达到最高，另外还适用于多属性分析。
100% 生物惰性流路保证提高方法和仪器稳定性，从而延长仪器正常运行时间并减少维护需求。
分析效率 始终如一仪器效率始终如一实验室效率 始终如一2量身定制的生物惰性液相色谱解决方案 助您优化工作流程效率Agilent InfinityLab 生物惰性液相色谱解决方案带给您全新水平的生物分析可靠性。
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服务与支持软件与信息学3日复一日持续稳定运行的液相色谱系统值得您的信赖：InfinityLab 生物惰性液相色谱解决方案基于可靠且稳定的 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统。
此外，全新生物惰性备件能够实现多属性分析，在分析之间无需更换色谱柱。
4实现高级生物分离所需的灵活性和模块化更高的色谱柱性能通过 Agilent AdvanceBio 色谱柱，您可以利用常规和超高性能液相色谱系统分析完整及片段单克隆抗体，从而推进生物药物发现、开发和 QA/QC 。
针对最常见生物分析工作流程的 Agilent AdvanceBio 色谱柱选择。
精确的色谱柱处理配备生物惰性热交换器的 Agilent 1260 Infinity II 高容量柱温箱 (MCT) 能够在较宽的温度范围内保持精确的色谱柱温度，这有助于实现稳定可靠的分离，从而获得最大的应用灵活性。
流路材料：PEEK灵敏的生物分子检测Agilent 1260 Infinity II 二极管阵列检测器 WR 可实现多波长和全谱检测，采样速率高达 120 Hz。
应对肽图谱法中的色谱挑战肽图谱法是生物制药产品综合表征的重要技术。
个单峰，由于蛋白酶解产物很复杂，因此，这就成为一个非常重要的色谱挑战。
除了蛋白质酶解所产生的大量肽段外，还有许多变化的肽结构(翻译后修饰，氧化等)。
得到肽图中合适的分离度是一个耗时的过程。
有些方法较好，但分析用时较长，而且往往达不到所要求的重现性。
您可以轻松地获得您实验室所需利用沃特世(Waters ®) UPLC ® 肽是以 UltraPerformance LC ® 技“性能保证解决方案”(APS )完美整合了分析设备与化这种优化的综合性系统解决方案能够提供给您所需要的明确信息，这样您将尽可能多地了解您的蛋白质样品。
UPLC 肽分析方案UPLC ® 肽分析方案nACQUITY UPLC ® 系统n肽分离技术，130Å 或 300Ån灵活的检测能力，配备 TUV ， PDA 或 MS 检测器n强大的数据处理与管理软件肽图分离能力的提高乙醇脱氢酶的胰蛋白酶解产物，用 UPLC 分离，更多的小峰被分离开。
UPLC 肽分析解决方案具有更高的分离度和灵敏度，有助于进行更加全面的蛋白质表征。
更高的分离度与 HPLC 相比，UPLC 具有更强的肽图分析能力。
超高的分离度是由于采用了 UPLC 小颗粒填料而得到超窄的色谱峰。
同样，肽分离技术所采用的填充材料的表面化学特性使图谱具有极佳的峰形，广泛适用于各类肽结构分析。
利用优化的设备 ACQUITY UPLC 系统，可实现极佳的色谱柱性能，该系统可降低系统体积，最小化检测器谱带展宽，加快数据采集速度，确保高效分离，同时还可最大限度提高系统灵敏度。
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UPLC 肽分析解决方案，是基于获奖的 ACQUITY UPLC 系统分析技术以及新型肽分离技术色谱柱创建的，具有极佳的色谱分离性能。
静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs ）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。
光散射也是在荧光检测之外蛋白质多聚体的最敏感检测方法之一。
就其尺寸而言，mAb 多聚体产生散射光时比其吸收214或280 nm 的UV 光时更有效率。
尽管如此，与简单的紫外检测相比，光散射并非一种即插即用的技术。
本文提供了一些有助于提高信噪比和整个系统稳定性的建议。
首先，务必保持整个系统清洁并经常更换洗脱溶液。
当使用不含叠氮化钠的缓冲溶液时，应该要每天更换。
当检测对象为蛋白质时，叠氮化钠不会在散射信号中引起任何问题。
因此建议在含水缓冲溶液中加入0.05 %的叠氮化钠，防止细菌生长。
在使用有机溶剂时，对洗脱溶液进行适当的脱气至关重要。
对任何洗脱溶液，无论是有机溶剂还是水溶液，都需要进行彻底过滤。
因为UV 检测不到的气泡和小颗粒，对光散射信号会产生严重干扰。
建议定期更换在线过滤器，并使用0.1 μm 滤膜过滤缓冲溶液，以避免基线噪音。
由于样品自身杂质污染检测器的情况会经常出现，建议在没有安装色谱柱的系统中使用含1 % SDS 的水冲洗4～5小时，接着用水快速排气，并用20 %乙醇和80 %水的混合溶液过夜冲洗。
对于持续的噪音，可以使用样品降解溶剂冲洗系统。
分析蛋白质样品时，蛋白酶可能会有所帮助。
按照色谱柱操作手册中的清洗方法清洗色谱柱，可以减少HPLC 色谱柱产生的噪音。
色谱柱过载也会导致保留时间之外出现样品分子，导致噪音和漂移基线。
TSKgel SW XL 系列色谱柱可使用0.1 M 甘氨酸/盐酸缓冲溶液（pH 3）过夜冲洗以进行有效清洗。
由于系统流速也会影响噪音级别，只可对流速渐进调整。
用4～5倍柱体积的洗脱溶液在运行流速下平衡色谱柱可稳定基线。
1色谱柱：流速：流动相：进样量：检测：HPLC 系统：MALS 检测器：TSKgel G3000SW XL , 5 µm, 7.8 mm ID x 30 cm L ； 1 mL/min ； PBS ； 20 µl ； 90°LS （红色），RI （灰色）和UV @ 280nm （蓝色）； LC-20A prominence, Shimadzu ；minDAWNTM TREOS, Wyatt Technology Corp.时间分钟0.250.200.150.100.050.00SEC-UV-RI-MALS 法高效分析蛋白质多聚体单克隆抗体的SEC-UV-RI-LS 分析应用笔记分析实际上，静态光散射是一种多检测器测试方法，来自于浓度检测器UV 或RI 的浓度信号对其非常重要。
