8-4 液相色谱之体积排阻色谱

一. 分离原理尺寸排阻色谱法：是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称凝胶色谱法。

排阻色谱的固定相多为凝胶。

凝胶是一种由有机分子制成的分子筛, 其表面惰性, 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构。

凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当, 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度。

尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内, 但进不了小孔, 甚至于完全被排斥，先流出色谱柱。

尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出。

因此, 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出。

小的组分分子在色谱柱中停留时间较长。

经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离。

当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散。

当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时：Xm ⇌ Xn组分的分配系数为：尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合：0 ≤ K ≤ 1二. 固定相尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类。

无机凝胶：又称硬质凝胶。

是具有一定孔径范围的多孔性凝胶，如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，此类凝胶化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱效较低。

有机凝胶：又称半硬质凝胶。

如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶，能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱效较高。

但在有机溶剂中有轻度膨胀。

新型凝胶色谱填料，克服了传统软填料的一些弱点，粒度细，机械强度高，分离速度快，效果好，特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离。

三. 流动相尺寸排阻色谱流动相：从样品的溶解性考虑，流动相应与凝胶本身有相似性，黏度低，与样品的折光率相差大;能润湿凝胶，防止吸附作用。

常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、N，N’-二甲基甲酸胺、三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等。

(可用于分离相对分子质量大的分子，如蛋白质、核酸等)。

高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。

2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。

3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。

4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。

5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。

6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。

反之称为反相色谱。

7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。

8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。

9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。

二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。

（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。

（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。

（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。

（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。

（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。

（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。

（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。

（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。

水相分子尺寸排阻色谱柱TSKgel PW系列使用说明书东曹株式会社安全注意事项［注意标签］■远离火源使用易燃溶剂时，请务必小心。

否则可能会导致火灾、爆炸或中毒。

■使用环境必须通风良好如果通风不良，易燃或有毒溶剂可能会导致火灾、爆炸或中毒。

■请勿喷洒溶剂溶剂发生喷洒或泄露可能会导致火灾、触电、中毒、受伤以及腐蚀。

清除漏出的溶剂时，请佩戴合适的护具。

■请佩戴护目镜和防护手套有机溶剂和酸属于有害物质，切勿直接接触皮肤。

■请小心处理包装处理不当可能会导致产品破裂或溶剂飞溅。

■请勿将本产品用于其他目的本产品仅可用于分离和提纯，请勿用于其他用途。

■请确认化合物的安全性请确认分离和提纯后的化合物和溶剂安全可靠。

■正确废弃请根据当地法律法规正确废弃。

注请将本说明书保存在本产品附近，以便日后参阅。

目录1. 简介 (1)2. 打开包装 (1)3. 色谱柱部件 (2)4. 安装 (2)5. 维护 (3)6. 溶剂 (4)7. 流速 (6)8. 温度 (8)9. 准备样品 (8)10. 理论塔板数和不对称因子的计算方法 (9)11. 保护柱 (10)12. 故障排除 (11)13. 质量标准和质量保证 (13)1. 简介TSKgel PW系列色谱柱是东曹株式会社开发的高效液相色谱柱，主要用于水相高效凝胶过滤色谱（GFC），适用于各类水溶性物质。

该类色谱柱适用于水溶性合成聚合物、低聚物以及生物物质，如多糖、核酸、蛋白质、肽等的分析或制备。

请仔细阅读本使用说明书，确保正确、有效地使用该类色谱柱。

表1应用领域应用领域适用的色谱柱水溶性合成聚合物水溶性生物聚合物多糖G4000PW(XL)，G5000PW(XL)，G6000PW(XL)，GMPW(XL)水溶性低聚物肽G2500PW(XL)，G3000PW(XL)非离子低聚物（低聚糖）G-Oligo-PW，G2000PW核酸G-DNA-PW注：TSKgel G-Oligo-PW和G2000PW可以在较宽的pH值范围内吸附离子型样品。

高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。

高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。

以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。

于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。

鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。

随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。

高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。

1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。

②高效：分离效能高。

可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。

④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。

⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。

高效液相色谱有5种类型：1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）2、分配色谱（Partition Chromatography）3、离子色谱（Ion Chromatography）4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）5、亲和色谱（Affinity Chromatography）此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。

体积排阻色谱(sec)柱用的仪器全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）是一种常用的色谱技术，也称为凝胶过滤色谱，它基于分子在流体中的尺寸和形状的差异，从而实现对分子的分离和分析。

而在SEC技术中，柱是至关重要的部分，体积排阻色谱柱是SEC技术中使用的一种特殊类型的柱，下面将详细介绍体积排阻色谱柱用的仪器。

1. 体积排阻色谱柱的特点体积排阻色谱柱是一种工程化的柱，与常规液相色谱柱有所不同。

它具有以下特点：（1）外围设计：体积排阻色谱柱通常采用不锈钢或者玻璃材质制成，外围设计均匀、结构合理，能够有效支持柱内填料，确保填料不会受到外力破坏。

（2）填料选择：体积排阻色谱柱的填料通常是粒径均匀的多孔球形颗粒，具有一定的孔径范围，能够较好地分离分子。

（3）稳定性：体积排阻色谱柱能够在一定的操作条件下保持较好的稳定性，不易受到外界影响而发生变形或损坏。

（4）易于连接：体积排阻色谱柱通常设计成易于连接的结构，可以与其他色谱设备灵活组装，便于操作和维护。

在体积排阻色谱实验中，除了色谱柱外，还需要配备一系列的仪器，以确保实验顺利进行。

主要的仪器包括：（1）色谱系统：用于将样品注入到色谱柱中，并控制流速、温度等操作参数。

色谱系统通常包括进样器、泵、检测器等部件。

（2）检测器：用于监测样品在色谱柱中的运动轨迹并进行信号采集和处理。

常见的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、光散射检测器等。

（3）设备连接：用于连接色谱柱和其他仪器，包括管道、接头、密封件等。

这些连接件需要具有良好的密封性能，以避免样品泄漏。

（4）温控设备：用于控制色谱柱和样品的温度，以确保实验在恒定的温度条件下进行。

在选择和使用体积排阻色谱柱时，需要注意以下几点：（1）填料选择：根据待分离的目标分子的分子量范围，选择合适的填料颗粒大小和孔径范围。

（2）流速控制：流速对于色谱分离效果至关重要，需要根据实验要求合理设置流速。

体积排阻色谱法
体积排阻色谱法的分离原理
SEC分离机理
SEC原理
SEC分离机理
固定相
无机填料（多孔硅胶或多孔玻璃）
优点：可以耐高温；机械性能稳定
缺点：表面具有吸附性，干扰SEC分离机理(硅烷化)有机填料（交联聚苯乙烯凝胶）【广泛使用】
优点：渗透性能好；柱效高
缺点：不宜长期高温条件使用
流动相
流动相的要求
•能完全溶解试样；但不与试样反应；
•不与填料有任何相互作用；
•黏度低；沸点比柱温高20-50摄氏度
•与检测器匹配，提高灵敏度。

SEC方法特点
•保留时间是分子尺寸的函数
•保留时间短，谱峰窄，容易检测
•柱子使用寿命长（固定相与组分作用力弱）
•不能分辨分子大小相近的化合物（相差10%以上）。

尺寸排阻色谱法原理体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。

在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。

今天就和大家一起看一看SEC的原理、实验条件选择、应用、常见问题及解决办法，我们一起分享学习。

定义排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。

又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。

分类1、凝胶过滤色谱法-GFC一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

2、凝胶渗透色谱法-GPC主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

基本原理凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。

分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。

排阻色谱不适用范围1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。

2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。

两种排阻色谱类型比较固定相与流动相流动相的选择1、必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。

2、溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。

3、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

固定相（凝胶）一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。

分类：1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。

2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。