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外泌体（Exosome）知识与检测方法一、 Exosome 简介最近几年，一种叫做Exosome的小囊泡正受到大家广泛的关注。
Exosome是直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。
Exosome天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体(Exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。
Exosome在30年前被人们所发现。
早期的研究认为，exosome 执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。
直到2007年，研究人员发现exosome也运输核酸，参与细胞间通讯。
总之，其蛋白、RNA和脂肪成分特异，且携带了一些重要的信号分子，有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用，这使得exosome的市场也在快速扩展，并成为热门的研究对象。
不同组织细胞来源exosome由于携带的蛋白质不同，而能够发挥不同的生物学功能。
例如，肿瘤细胞分泌的exosome能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸；而树突状细胞源性exosome则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。
目前研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故exosome有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
Exosome携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。
前者可能与exosome的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的exosome，而这些特定细胞源的exosome与其生物学功能有着密切联系，例如分子来源的Exosome上含有MHCII类分子。
二， Exosome 提取Exosome是由活细胞分泌的，它是一种亚细胞成分，组要成分是磷脂双分子和携带的膜性分子，其界定依据形态学和生物化学及提取方式不同细胞源的exosome是不同的，这些不同的理化性质有利于exosome的提取。
基于蛋白质组学的胸腔积液蛋白标志物筛选与验证李志斌;束军;孟静【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2017(052)005【摘要】目的用蛋白质组学技术对比分析良、恶性胸腔积液标本,寻找蛋白标志物为其鉴别诊断提供帮助和新线索.方法采用双向电泳分离、搜寻蛋白,基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定蛋白,ELISA验证蛋白在良恶性胸腔积液样本中具体含量.结果恶性组胶图对比良性组共显示明显差异蛋白点(上调或下调≥2倍)43个,上调9个,下调34个;对其中7个显著差异点(上调或下调≥3倍)质谱鉴定明确了具体类型;挑选显著差异点中免疫球蛋白λ(Igλ)、结合珠蛋白(Hp)进行ELISA验证,结果表明Igλ在良、恶性胸腔积液中含量差异无统计学意义,Hp含量组间差异有统计学意义(P<0.05).进一步评估显示诊断标准为胸腔积液中Hp<389.02 μg/L时,诊断恶性胸腔积液灵敏度为75.00%,特异度为52.38%.结论蛋白质组学技术的应用对胸腔积液蛋白标志物搜寻具有较大帮助,本研究搜寻到的标志物Hp对于良、恶性胸腔积液鉴别诊断具有一定价值,值得进一步研究.%Objective Through analyzing benign and malignant pleural effusion samples by proteomic techniques, finding protein biomarkers to provide help and new clues for effusion differential diagnosis.Methods Two-dimensional electrophoresis(2-DE) and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) were used to search and identify protein biomarkers, enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) was to validate the biomarkers.Results By comparingmalignant group with benign group, 43 significantly different protein spots(Up or down regulated≥2 times) were found.Including 9 up regulated spots and 34 down regulated spots.And 7 spots were identified(Up or down regulated≥3 times) by MALD I-TOF-MS and validated 2 spots immunoglobulin λ(Igλ) and haptoglobin(Hp) by ELISA.The results showed that Igλ showed no statistical significance between two groups, while Hp showed the statistical significance(P<0.05).The diagnostic sensitivity and specificity of Hp in malignant pleural effusion were 75.00% and 52.38% at diagnostic cut-off point of 389.02 μg/L.Conclusion The application of proteomics technology has a great help with protein biomarkers searching in pleural effusion.HP has a certain value for the differential diagnosis of benign and malignant pleural effusionand and worthy of further study.【总页数】5页(P700-704)【作者】李志斌;束军;孟静【作者单位】安徽医科大学第四附属医院呼吸内科,合肥 230032;安徽医科大学第四附属医院呼吸内科,合肥 230032;安徽医科大学第四附属医院呼吸内科,合肥230032【正文语种】中文【中图分类】Q51;R561.3【相关文献】1.基于蛋白质组学筛选获得的乙型肝炎病毒相关肝癌诊断标志物的研究进展 [J], 张丽军;贾小芳;滕珍林;程能能2.蛋白质组学研究中生物标志物的验证 [J], 赵红梅3.基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证 [J], 王素兰;高华萍;张菁;叶翔4.基于蛋白质组学筛选单肺通气潜在肺损伤标志物 [J], 张叶;黎阳;彭丹晖;老启芳;陈肖东;黄冰5.蛋白质组学RPPA技术筛选乳腺癌患者预后相关血清分子标志物的研究 [J], 张爽;林冰;周平;刘沙;刘玉;罗志飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
WWOX基因在良恶性胸水中的异常表达分析景国慧;周玉龙;王燕【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2010(037)003【摘要】目的:检测WWOX(WW domain containing oxidoreductase)基因6-8外显子在良恶性胸水中的mRNA表达.探讨WWOX基因是否在恶性胸水的发生、发展中起重要作用,更为重要的是尝试WWOX基因6-8外显子mRNA检测可否作为良、恶性胸水鉴别重要指标.方法:收集恶性胸水56例,良性胸水20例,分别提取恶性胸水及良性胸水中的RNA;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术对76例良、恶性胸腔积液进行WWOX基因mRNA 6-8外显子表达的检测;从恶性胸水及良性胸水沉淀物中提取的RNA经逆转录合成cDNA,再经PCR反应,用电泳直接检测cDNA的扩增产物.结果:在76例胸水标本中有39例PCR未能扩增出预期长度的DNA片段,其中56例恶性胸水中,39例(69.6%)标本未能扩增出WWOX基因6-8外显子片段,而相对应的20例良性胸水标本全部扩增出WWOX基因6-8外显子片段,两者相比较有显著性差异(X~2=6.765,P<0.05).31例经胸水细胞学及胸水沉淀物病理确诊肺癌的样本均未能扩增出WWOX基因6-8外显子片段,而胸水细胞学及胸水沉淀物病理阴性,最后经胸膜活检证实肺癌的25例恶性胸水样本中有8例未能扩增出WWOX基因6-8外显子片段.结论:研究表明,位于16q23.3-24.1的WWOX基因在非小细胞肺癌中存在较高的6-8外显子转录本缺失率,提示WWOX 基因可能在恶性胸水的发生、发展中起重要作用;WWOX基因6-8外显子转录本的丢失是恶性胸水的重要分子标志;WWOX基因6-8外显子mRNA检测可作为良、恶性胸水鉴别重要指标.【总页数】3页(P146-147,155)【作者】景国慧;周玉龙;王燕【作者单位】天津医科大学,天津市,300070;天津市胸科医院胸内科,天津市,300051;天津市胸科医院胸内科,天津市,300051【正文语种】中文【相关文献】1.FHIT、WWOX和MDR1基因在鼻咽癌中的表达 [J], 黄春妮;杨峥;黄健;李屏;莫武宁2.WWOX基因在乳腺癌中的表达及临床病理意义 [J], 练玲芝;顾凤华;顾国建3.CHD5 和 WWOX 基因在胃癌中的表达及其对预后的影响 [J], 邢晓静;卢达新;谷小虎4.NDRG-1、WWOX及P53基因在大肠癌组织中的表达及临床意义 [J], 张云昌;王凤安;赵培荣5.WWOX、p53及Bcl-xl基因在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义 [J], 赵帅;吕文玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
外泌体分离提纯草案By 朱旭峰一、以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）1.1细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。
（sigma）1.2快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。
超速离心于120,000_g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotorA-641) 4 ℃. 2 小时1.3用1mL 冷的PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃. 2 小时1.4再用100μL 冷的PBS 重悬后转移到低粘附的管中1.5快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect™(Millipore)2材料a)细胞培养液b)蛋白酶抑制（Sigma）c)过滤筛(Millipore)d)冷的PBSe)低粘附的管f)Direct Detect™(Millipore)二、以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）1.1在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)1.2将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟4℃1.3小心地再将上清液移至新的管中离心10000*g 30分钟于4℃来去除较大的囊泡、1.4此阶段的样品可以1.5将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g(Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时4℃1.6用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，1.7将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬1.8外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏2.材料a)蛋白酶抑制（Sigma）b)过滤筛(Millipore)c)冷的PBSd)低粘附的管e)Direct Detect™(Millipore)三、ExoQuick TM化学沉淀法1.1ExoQuick TM的使用要按照厂家提供的说明书来实行1.2该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuick TM试剂盒里的溶液1.3溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃1.4在流式细胞仪缓冲液中洗涤1.5试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences) 配合使用CellQuest 的软件。
热休克胶质瘤源exosomes分离鉴定及相关蛋白组成的研究摘要】目的验证胶质瘤细胞可分泌exosomes,探讨热休克对胶质瘤细胞分泌的exosomes产量及相关蛋白的影响，为进一步研究增强exosomes免疫活性及体外实验提供理论依据。
方法采用差速离心法结合超滤及蔗糖密度梯度离心纯化得到胶质瘤细胞分泌的Exosomes和经热休克处理后胶质瘤细胞分泌exosomes(Heat shocked Exosomes,HS-Exo),电镜观察两组exosomes形态。
westerrn-blot鉴定HSP70及ICAM-1表达。
结果胶质瘤细胞及经热休克处理后均可分泌exosomes，直径约30-100nm,电镜形态无明显差别。
经westerrn-blot检测热休克处理的细胞的HSP70及ICAM-1表达量增加，为进一步提高exosomes的免疫活性提供理论基础。
【关键词】胶质瘤 exosomes 热休克蛋白肿瘤疫苗Exosomes作为一种亚细胞结构的外核体，是一种具有诱导机体产生抗肿瘤免疫效应，是新型的潜在的抗肿瘤疫苗。
其中其蛋白分子HSP70及各种相关免疫分子的研究引起广泛的关注。
HSP70-多肽复合物可以激活肿瘤免疫发挥抗肿瘤作用。
胶质瘤也可以分泌exosomes,为增强exosomes免疫活性，我们对胶质瘤细胞进行热休克处理，不进行任何基因修饰，采用经典的差速离心法结合超滤和蔗糖重水超速离心法分离纯化exosomes,对其形态及免疫分子进行鉴定，探讨增强exosomes免疫活性的方法，为进一步研究胶质瘤疫苗打下基础。
1 材料和方法1.1 实验材料细胞及试剂：U251细胞购自上海细胞库 DMEM(赛墨飞世尔生物化学公司)，Centriplus离心超滤管(100kd) Amicon ultra高回收率高流速切向流超滤离管(100kd) PVDF 购自Millipor公司，重水（青岛腾龙微波科技公司）兔抗人ICAM-1单克隆抗体购自Santa Crus公司，鼠抗人HSP70 单克隆抗体BCA蛋白浓度测定试剂盒，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠,羊抗兔IgG购自碧云天生物研究所。
肿瘤细胞来源的exosomes的制备和电镜鉴定以及抗肿瘤作
用
王波;修方明
【期刊名称】《东南国防医药》
【年(卷),期】2006(8)1
【摘要】目的分离和电镜鉴定EG.7小鼠胸腺肿瘤细胞分泌的exosomes,并观察其抗肿瘤作用.方法常规分级离心分离和密度梯度离心纯化得到exosomes,并对exosomes沉淀行透射电镜鉴定.应用分离纯化的exosomes免疫小鼠然后荷瘤,观察肿瘤的生长状况.结果 EG.7细胞来源的exosomes大小40～100nm,具有膜结构.exosomes免疫能够显著抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的存活期.结论从肿瘤细胞培养上清中分离纯化的exosomes具有显著的抗肿瘤作用.
【总页数】3页(P9-11)
【作者】王波;修方明
【作者单位】解放军第117医院危重病医学科,浙江杭州,310013;浙江大学医学院免疫教研室,浙江杭州,310027
【正文语种】中文
【中图分类】R73-36
【相关文献】
1.榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca—F25／CL—16A3的抗肿瘤作用机理的实验研究Ⅳ．榄香烯的抗肿瘤作用及光镜、透射电镜的观察 [J], 张红;左云飞;等
2.骨肉瘤细胞来源的exosomes制备和鉴定 [J], 董革辉;刘福慧;韩建华;夏本杰;黄俊琼
3.喉癌 Hep -2细胞来源的 exosomes 的发现和鉴定 [J], 吉晓滨;梁俊毅;刘启才;谢景华
4.舌癌Tca8113细胞来源exosomes的制备及鉴定 [J], 李金;廖贵清;陈巨峰;刘海潮;苏宇雄;冯炼强;骆晓枫
5.肝癌细胞来源的exosomes提取方法的改进及电镜观察 [J], 萨仁高娃;吴岩;肖文华
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乳腺癌细胞来源的Exosomes的提取和鉴定赵明芳;曲晶磊;曲秀娟;侯科佐;张晔;刘静;刘云鹏【期刊名称】《山西医药杂志》【年(卷),期】2010(039)001【摘要】目的从MCF-7B乳腺癌细胞培养上清液中分离获得Exosomes,并进行形态学观察鉴定.方法通过低速、高速、超滤及超高速离心等方法, 从MCF-7B乳腺癌细胞培养上清中分离Exosomes, 用透射电子显微镜观察其形态特征,Lorry方法蛋白定量,通过用免疫印记进行组织相容性抗原(MHC)分子鉴定.结果 MCF-7B乳腺癌细胞上清中分泌大量的Exosomes,电镜下观察呈椭圆形或圆形的双层膜的囊泡, 直径为50～100 nm, 具有完整的细胞膜.结论用离心的方法可从MCF-7B乳腺癌细胞培养上清中提取Exosomes,有可能作为乳腺癌免疫治疗潜在的抗原,同时也为研究肿瘤的发病机制提供一个新的途径.【总页数】3页(P10-12)【作者】赵明芳;曲晶磊;曲秀娟;侯科佐;张晔;刘静;刘云鹏【作者单位】中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001;中国医科大学附属第一医院,110001【正文语种】中文【相关文献】1.骨肉瘤细胞来源的exosomes制备和鉴定 [J], 董革辉;刘福慧;韩建华;夏本杰;黄俊琼2.喉癌 Hep -2细胞来源的 exosomes 的发现和鉴定 [J], 吉晓滨;梁俊毅;刘启才;谢景华3.胃癌细胞来源的exosome的提取和鉴定 [J], 赵明芳;曲品磊;曲秀娟;侯科佐;张晔;刘静;刘云鹏4.喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取和鉴定 [J], 吉晓滨;梁俊毅;刘启才;谢景华5.成纤维细胞系3T3细胞来源exosome对小鼠乳腺癌细胞增殖能力的影响 [J], 王雅琴;陈智因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
