下载文档原格式
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。
以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。
质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。
2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。
这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。
4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。
5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。
6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。
7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。
8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。
需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。
![一种植物表达载体及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/84cf120082c4bb4cf7ec4afe04a1b0717fd5b3c4.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.11.27C N 103409459 A(21)申请号 201310079547.0(22)申请日 2013.03.13C12N 15/82(2006.01)C12N 15/66(2006.01)C12N 1/21(2006.01)A01H 5/00(2006.01)(71)申请人天津大学地址300072 天津市南开区卫津路92号(72)发明人季静 王罡 吴疆 刁进进(74)专利代理机构天津市杰盈专利代理有限公司 12207代理人王小静(54)发明名称一种植物表达载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种植物表达载体及其构建方法和应用。
用PCR 的方法从出发表达载体pGreenII0229、pCAMBIA3300-35S-HAK 和pGH-X6145G 上克隆1#、2#、3#和4#片段。
用NotI 和MIUI 分别酶切1#和2#片段并连接得到载体pJWW-12；用XhoI 分别酶切pJWW-12和3#片段并连接得到载体pJWW-123；用SacI 分别酶切载体pJWW-123和4#片段并连接得到表达载体pJWW0230。
本发明可以方便地进行TA 克隆。
本发明载体可以方便快捷插入启动子和目的基因，启动子可通过简单的TA 克隆连接入载体，目的基因可通过一步克隆插入到本载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。
该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书7页序列表9页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页序列表9页 附图5页(10)申请公布号CN 103409459 A *CN103409459A*1/1页1.一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300-35S-HAK ，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段分别为1#和2#片段，分别含有LB 和RB ；从pCAMBIA3300-35S-HAK 上克隆35S-NOS 片段为3#片段；以质粒pGH-X6145G 为模板克隆4#片段，最后将这4个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWW0230；其中，RB 位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB 位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；所述1#片段如序列SEQ ID NO ：1所示；所述2#片段如序列SEQ ID NO ：2所示；所述3#片段如序列SEQ ID NO ：3所示；所述RB 如序列SEQ ID NO ：4所示，所述LB 如序列SEQ ID NO ：5所示；所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO ：6所示；所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO ：7所示；连接4#片段测序结果如序列SEQ ID NO ：8所示。
DGLA及ETA合成的多基因植物表达载体的构建作者：孙觅真李新征周佳佳等来源：《山东农业科学》2014年第07期摘要：Δ8去饱和酶和Δ9链延长酶是二高-γ-亚麻酸（DGLA）和二十碳四烯酸（ETA）合成的关键酶。
本研究利用大豆种子特异性启动子替换35S启动子构建了新的多基因辅助载体PAUX-2，并在此基础上构建了包含来自小眼虫藻的Δ8去饱和酶基因和来自球等鞭金藻的Δ9链延长酶基因的植物表达载体pCambia2300-Δ8Δ9。
为进一步利用转基因技术研究这些基因在植物中的表达提供了条件。
关键词：超长链多不饱和脂肪酸；Δ8去饱和酶基因；Δ9链延长酶基因；种子特异性启动子；表达载体中图分类号：S188+.1∶Q784文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0001-06AbstractThe Δ8 desaturase （Δ8Des）and Δ9 elongase （Δ9Elo） are the key enzymes for the synthesis of dihomo-γ-linolenic acid （DGLA） and eicosatetraenoic acid （ETA）. In the research， a new assistant expression vector， PAUX-2， was constructed through replacing the 35S promoter with a soybean seed-specific promoter BCSP952. Then a plant expression vector，pCambia2300-Δ8Δ9， simultaneou sly containing Δ8Des gene from Euglena gracilis and Δ9Elo gene from Isochrysis galbana， was constructed， which provided essential tool to study the expression of these exogenous genes in plants.Key wordsVery-long-chain polyunsaturated fatty acids （VLCPUFAs）；Δ8 desaturase gene；Δ9 elongase gene； Seed-specific promoter； Expression vector超长链多不饱和脂肪酸（very-long-chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs），通常指含有20个碳原子以上及4～6个顺式不饱和双键的直链脂肪酸[1]。
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术植物质体表达载体是一种用于将外源基因转化至植物质体中进行表达的工具，具有许多应用于农业、医药和工业领域的潜力。
本文将介绍一种常用的植物质体表达载体构建方法以及其在相关领域的应用和流程技术。
植物质体是细胞中的一种特殊器官，其中包含了丰富的DNA、RNA 和蛋白质。
通过将外源基因导入质体中进行表达，可以使植物细胞产生特定的蛋白质，从而实现对目标基因功能的研究和生产特定蛋白质的目的。
一种常用的植物质体表达载体构建方法是利用嵌合质粒。
嵌合质粒是由质体和细菌染色体DNA片段组合而成的具有双重起源和选择标记的质粒。
该方法的具体步骤如下：步骤一：选择合适的细菌质粒作为载体。
常用的载体包括Agrobacterium、E. coli等。
首先根据需要选择合适的细菌质粒，该质粒需要能够稳定复制并在植物中高效表达外源基因。
步骤二：选择合适的启动子和终止子。
启动子是控制基因转录起始的区域，终止子是控制转录终止的区域。
通过选择适合的启动子和终止子，可以调控外源基因在植物细胞中的表达水平。
步骤三：克隆外源基因。
将目标基因克隆到载体上，通常使用限制酶切和DNA连接技术。
可以选择不同的限制酶来线性化质粒和选择目标基因以适应不同的表达需求。
步骤四：转化植物细胞。
通过植物转基因技术将构建好的载体导入植物细胞中。
常用的方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。
步骤五：筛选转化成功的植物。
使用适当的选择标记基因，如抗生素抗性基因，来标记成功转化的植物细胞。
通过诱导植物细胞分化和培养，最终得到转化植株。
植物质体表达载体在农业、医药和工业领域有广泛的应用。
在农业领域，该技术可以用于改良作物，使其具备抗病虫害、耐逆性、提高产量等特点。
在医药领域，植物质体表达载体可以用于生产重要的药物和疫苗，如疫苗蛋白、抗体等。
在工业领域，该技术可以用于生产生物材料和生物燃料等高附加值产品。
总结起来，植物质体表达载体构建方法主要包括选择合适的载体、启动子和终止子，克隆外源基因，转化植物细胞，筛选转化成功的植物等步骤。
多选择标记植物表达载体的构建李春艳;吴三民;赵建宇;樊宪伟;李有志【期刊名称】《广西农业生物科学》【年(卷),期】2011(030)001【摘要】具有多选择标记的植物基因表达载体有利于转基因植物研究中的转基因植株的筛选。
本研究对植物基因表达载体pCAMBIA1301进行了改造,产生了1个具有可溶性的红移绿色荧光蛋白基因（smRS-GFP）、抗除草剂Basta、葡萄糖苷酸酶（GUS）及潮霉素（Hpt）的多选择标记的新的植物基因表达载体。
运用这一表达载体的多选择标记可以有效降低检测和筛选转化植株时的假阳性率。
此外,如此的基因表达载体也能满足实验室的不同筛选方法的需求。
%A plant gene expression vector with multi-selectable markers benefits screening of transgenic plants in plant transgene researches. In this study, a plant gene expression vector pCAMBIA1301 was re-constructed, generating a new plant expression vector with【总页数】8页(P27-34)【作者】李春艳;吴三民;赵建宇;樊宪伟;李有志【作者单位】广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果 [J], 魏兵强;赵长增;陆璐;王福兰;李伟民2.选择标记可去除的植物高效表达载体的构建 [J], 高尚;苏鸓;贾洪革;郭洪年;田颖川;方荣祥;陈晓英3.以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建 [J], 阎淑滑;周波;赵霞;李玉花4.PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及其在雪柑转基因中的应用 [J], 曾黎辉;徐海峰;王会全;吴少华;朱艺萱5.无选择标记的植物表达载体的构建 [J], 辛翠花;刘庆昌;屈冬玉;黄三文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，扩增PPP3启动子。
双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【摘要】【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。
【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种＂优引三号＂,对所获得的转基因植株进行PCR检验。
【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。
【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。
%【Objective】The study was done to construct a binary expression vector to improve stress-tolerance of target plants by genetic transformation.【Method】 We introduced HaBADH directly into plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS,and replaced NPTⅡ with HaCMO,and constructed a binary expression vector.HaBADH and HaCMO were both cloned by our laboratory and pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO was transformed into rice Youyin-3 by Agrobacterium-mediated transformation and transgenatic plants were detected with PCR.【Result】 We constructed the plant binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO successfully,and obtained 5 transgenic rice plants which contained the vector by PCRanalysis.【Conclusion】 This study introduces HaBADH and HaCMO to pCAMBIA2300-35S-OCS,and constructs a binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,and transforms it to rice,which prepares for study synthesis and accumulation of glycine betaine in transgenetic rice.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】8页(P210-216,223)【关键词】梭梭;甜菜碱醛脱氢酶;胆碱单加氧酶【作者】石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【作者单位】宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002 宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002【正文语种】中文【中图分类】Q782在盐渍、干旱等渗透胁迫情况下，许多高等植物会在细胞内大量合成并积累一些有机渗透调节物质，如山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等，以提高自身抵抗盐渍、干旱等胁迫的能力。
专利名称：一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体
专利类型：发明专利
发明人：贾彩红,徐碧玉,金志强,胡伟,张建斌,刘菊华,谭光兰
申请号：CN200910164933.3
申请日：20090724
公开号：CN101643748A
公开日：
20100210
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原的植物表达载体，该载体利用香蕉果实特异表达的凝集素基因启动子取代植物表达载体pBI121上的组成型35S启动子，以乙肝病毒表面抗原基因置换pBI121上的gus基因，构建重组植物表达载体pCAMBIA2300HBS。
利用农杆菌介导法将该载体转化香蕉，PCR检测证明外源基因已插入香蕉基因组中；ELISA检测证明香蕉凝集素基因启动子驱动乙肝病毒表面抗原基因在香蕉果实中特异表达。
该载体的获得，为在果实中特异表达乙肝病毒表面抗原提供了有利的工具，特别是利用该载体生产乙肝口服疫苗奠定了基础。
因此，该载体在今后的转基因研究中具有重要的应用价值。
申请人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所,农业部热带作物生物技术重点开放实验室,中国热带农业科学院海口实验站
地址：571101 海南省海口市龙华区学院路4号热带生物技术研究所
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。
沙漠小球藻转植物表达载体的表达预测作者：汪文伦王丹牟云许万云胡梦薇高剑峰来源：《江苏农业科学》2016年第06期摘要：以建立小球藻（沙漠小球藻）表达系统为目的，为利用小球藻重组表达外源蛋白，以及GFP荧光特性研究沙漠中的小球藻生理及理化性质提供基础方法；同时也探索植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS能否在沙漠小球藻中表达。
通过菌落PCR验证E.coli DH5α是否含有目的基因（GFP基因）的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，然后从E.coli DH5α中提取也构建完成的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS；利用电转化的方法将重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS转入到小球藻细胞中；将电转的小球藻在含有 100 mg/L 卡那霉素的BBM固体培养基中筛选出单克隆，将单克隆在含有15 mg/L卡那霉素的BBM液体培养基中扩大培养，然后利用PCR和RT-PCR预测绿色荧光蛋白基因（GFP 基因）的存在与否和表达情况，再利用SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。
通过SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察结果表明绿色荧光蛋白（GFP）在小球藻中表达成功。
试验结果表明重组植物表达pCAMBIA2300-35S-OCS能够在小球藻中表达外源蛋白，以及利用GFP的荧光特性研究小球藻的生理生化差异；也为小球藻在沙漠环境上的应用提供基础。
关键词：沙漠小球藻；电转化；植物表达载体；绿色荧光蛋白中图分类号： S917.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0041-04微藻是地球上出现最早的生命之一，是一种能利用光合作用生活和生长的微生物，广泛分布于海洋、陆地、湖泊以及干旱的沙漠之中。
它们的形态各异，呈丝状、球形和椭圆形等等，只要是有光和潮湿的地方都能找到这些生命的痕迹[1]。
新疆古尔班通古特沙漠是我国第二大沙漠，年降水量70～150 mm，冬季有积雪，其最低温度可达-25 ℃，而最高温度可达35 ℃[2]。
pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体的构建咸洋;夏阳;张金文;庞彩红;李丽;毛秀红【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2009(0)9【摘要】将载体pCAMBIA2300-35s-OCS进行改造,增加了酶切位点Sac Ⅰ,之后,PCR扩增编码胆碱脱氢酶(CDH)的基因并用SmaⅠ和XbaⅠ将其与改造后的pCAMBIA2300-35s-OCS连接,得到单价植物表达载体p2300-gz-betA。
再通过Sal Ⅰ、HindⅢ、Sac Ⅰ等酶切位点将编码甜菜碱醛脱氧酶(BADH)的基因及其启动子和终止序列连接到载体p2300-gz-betA上,最终得到pCAMBIA2300-betA-BADH双价植物表达载体,并将其导入根癌农杆菌GV3101和LBA4404。
betA和BADH是编码甜菜碱合成途径的两个关键酶的基因(CDH和BADH),也是近年来研究较多的耐盐基因,其双价植物表达载体应用于遗传转化后,有望进一步提高转基因植物的耐盐性。
【总页数】4页(P47-50)【关键词】beta;BADH;酶切;PCR【作者】咸洋;夏阳;张金文;庞彩红;李丽;毛秀红【作者单位】甘肃农业大学生命科学技术学院;山东省林业科学研究院【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.含 GmNHX1和 LcVP1双价基因植物表达载体构建与转基因棉花的获得 [J], 冯雪;贾永红;郭红珍;张一名;赵学良;孙艳香2.转录因子DREB 1 A基因和Bar基因双价植物表达载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究 [J], 贾小霞;齐恩芳;王一航;国宏;龚成文;王红梅;李建武;马胜;胡新元3.啤酒花抗病毒双价RNAi植物表达载体的构建及遗传转化 [J], 王琨;裴娟;黎玉顺;祝建波;向本春4.中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建 [J], 廖正平;郑益平;罗鹏;吴雪琴;曾黎辉5.花生抗黄曲霉的植物双价表达载体的构建 [J], 肖宇;陈湘瑜;陈华;陈剑洪;庄伟建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
