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乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达杨芳,余占桥,张日俊(中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)摘要:为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和P lnF,构建表达载体pG EX 4T E和pGEX 4T F,经IPT G诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS PA GE进行鉴定。
试验结果表明,pGEX 4T E和pGEX 4T F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS PA G E鉴定两融合蛋白表达正确。
说明PlnE和P lnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。
关键词:植物乳酸杆菌;细菌素;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2010)12 0055 05细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体途径合成的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质及其衍生物,产生菌对其细菌素具有自身免疫性(Ander s son等,1998;Riley等,2002;T orkar等,2003;Car o lissen M ackay等,1997)。
由于细菌素与抗生素相比无抗药性和残留性,目前国内外对细菌素的研究多数集中在开发替代抗生素治疗使用的生物保健剂和兽药上。
NCBI数据库中确定基因和蛋白质序列的细菌素有数百种,然而仅有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐,绝大多数处于试验阶段,究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低,分离纯化困难,距离产业化生产还有很长距离。
研究结果发现,细菌素异源表达对象多为 a类单肽链非修饰细菌素,最终获得的产物活性产量差异较大(余占桥等,2009)。
低水平异源表达的主要原因是直接表达的细菌素肽链对宿主细胞具有毒害作用,抑制其生长。
乳酸菌用作口服疫苗表达载体的应用研究进展亓秀晔;刘乃芝;程福亮;徐海燕;谷巍【摘要】乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,被公认为绿色安全级微生物,可以在机体内粘附、定植和复制,益生作用和免疫原性使其成为最有前景的活菌载体.利用基因工程手段插入外源基因制备重组乳酸菌口服疫苗,能够持续刺激机体分泌特异性抗原蛋白,多个基因的插入甚至能达到一免治多病的目的.口服免疫效果优于注射免疫,治疗成本也大大降低.该文论述了乳酸菌活载体疫苗的优势,对乳酸菌表达载体在动物疫病防控及代谢产物调控上的应用等方面的研究进行综述,并对其应用前景进行分析和展望.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】6页(P18-23)【关键词】乳酸菌;口服疫苗;表达载体;动物疫病【作者】亓秀晔;刘乃芝;程福亮;徐海燕;谷巍【作者单位】山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安 271000;山东宝来利来生物工程股份有限公司山东省动物微生态制剂省级重点实验室,山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】TS201.1疫苗是用病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法，制成的用于预防传染病的自动免疫制剂[1]。
作为关乎人民群众健康、公共卫生安全及国家安全的特殊产品，接种疫苗在整个人类社会安全中起着重要作用。
活载体疫苗（live vector vaccine，LVV）是通过分子生物学手段将有效的目的抗原编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒），从而构建重组菌（毒）株，使目的基因随着重组菌（毒）株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护应答，是目前最具发展潜力的新型基因工程疫苗之一[2]。
发酵法制备D乳酸研究进展李晓姝;高大成;王领民;张霖;樊亚超【摘要】D乳酸作为一种重要的有机酸,在许多领域都得到了广泛应用,以D-乳酸为单体合成的聚乳酸材料因其优异的性能亦展现出良好的市场前景.而微生物发酵法合成D-乳酸在经济效益和环境效益等方面具有着显著的优势.综述了生物法制备D乳酸的最新进展,同时指出高产稳定菌株的获得以及与其性能适应的发酵工艺的开发,是提高发酵法D乳酸生产竞争力的关键所在.%As an important organic acid,D-lactic acid is widely used in a lot of fields. PLA materials which are synthesized from D-lactic acid also show good market prospects because of their excellent performance. Synthesizing D-lactic acid via the biological way has significant advantages, such as good economic benefit and good environmental benefit. In this paper, the latest development of biological production of D-lactic acid was introduced.It's pointed that obtaining high yield and stable strains and developing corresponding fermentation process is the key point to improve the competitiveness of D-lactic acid production by biological method.【期刊名称】《当代化工》【年(卷),期】2017(046)008【总页数】4页(P1659-1662)【关键词】D-乳酸;发酵;应用【作者】李晓姝;高大成;王领民;张霖;樊亚超【作者单位】中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺 113001;中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺 113001;中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺 113001;中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺 113001;中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺 113001【正文语种】中文【中图分类】TQ201乳酸在自然界中分布广泛，存在于多种植物、动物和微生物中，是生物体的常见代谢产物之一。
第38卷第6期 注 為 科 修Vol. 38 No. 62020 年 12 月JIANGXI SCIENCED" 2020doi ：10.13990/j. ()1001 -3679.2020.06.016枯草芽抱杆菌表达系统研究进展马平英，罗雯3,詹怡昕，吴楚楚，熊雨顺，许小群，陈梅4南昌师范学院生物系,330032，南昌)摘要:枯草芽抱杆菌是一种土壤来源的、低G + C 、内生抱子革兰氏阳性细菌。
其所属芽抱杆菌属是微生物发酵中的主要细菌，该细菌被认为是理想的模式生物。
枯草芽抱杆菌应用广泛，且因其具有非致病性、抗药性有限、为益生菌菌株等优点，可以直接用于人体和动物。
综述枯草芽抱杆菌的优点、表达系统的发展及其在各个领域的应用进展，从而在理论和实践两方面为枯草芽抱杆菌的表达系统研究提供可以借鉴的依据和思路。
关键词：枯草芽抱杆菌；遗传转化;表达;应用；进展中图分类号:Q939. 9文献标识码:A 文章编号:1001 -3679(2020)06 -867 -05Research Progress of Bacillus subtilis Expression SystemMA Pingying, LUO Wen ** , ZHAN Yixin, WU Chuchu , XIONG Yushun, XU Xiaoqun, CHEN Mei 收稿日期:2020 - 10 - 24；修订日期:2020-11 -10作者简介:马平英(1999—),女，本科，研究方向:生物科学。
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目(201614437004)；南昌师范学院学生科研项目(19XSKY51 )o*通信作者:罗 雯(1974—),女，博士，教授，研究方向为应用微生物学。
E-mail ： ***************。
(Department of Biology, Nanchang Normal University , 330032, Nanchang , PRC)Abstra^: BadUus subtilis is a kind of soil - derived gram 一 positive bacterium with low G + C andendospore. Badllus is the main bacmia in microbial feanentation , which is sonsidered th be an iVe- al model oreanism. BadUus subtilis is wiVely used and it ccn be directly used in human body andanimals beccuse of its non - pathoocnic , limited resistance and being probiotic strains. The purpose of this paper was ta eeview the adventages of Badllus subtilis , the development of the expression sys tem and i I s application in veaoueields, ss as th previde referencc basis and ides for the study of the exprssion system of Bacillus subtilis in theory and practica.Key %ords ：Bad,llus subtilis p genetic transformation ； expression ； application ； prooress0引言枯草芽抱杆菌(Badllus subtilis)是一种理想 型的模式生物，其应用价值很高,培养简单快速, 具有非致病性及良好的发酵基础和生产技术等优势，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。
植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，扩增PPP3启动子。
构建基因表达载体时需要考虑的因素构建基因表达载体的目的是为了顺利实现目的基因的表达，即让目的基因能够顺利完成转录和翻译这两个过程。
据此，在构建基因表达载体时，需要考虑以下因素。
1．转录有效起始目的基因能够表达的第一个关键步骤就是有效起始转录。
选择强的可调控的启动子及相关的调控序列是构建一个高效表达载体首先需要考虑的问题。
构建基因表达载体常用的启动子一般可以分为组成型启动子和诱导型启动子。
组成型启动子是指在生物体的所有组织中都有活性的启动子。
例如，在双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子；T7噬菌体启动子也是一种常用的组成型启动子，因为T7 RNA聚合酶几乎能完整地转录由该启动子调控的所有DNA序列，从而能够实现目的基因的高效表达。
诱导型启动子是指能被诱导表达的启动子。
常见的诱导型启动子有Lac乳糖操纵子以及在此基础上衍生出的多种诱导型启动子。
2．mRNA有效延伸和转录顺利终止转录有效起始后，需要保证目的基因的mRNA能够有效延伸并顺利终止转录。
在转录过程中，衰减子和非特异性终止都可能诱发转录中的mRNA分子提前终止转录。
衰减子位点具有简单的终止子的特性，是负调控元件。
为了保证转录的顺利进行，在构建基因表达载体时要尽量去除衰减子位点。
同时，还可以加入抗终止序列元件来防止mRNA在转录过程中非特异性终止。
转录的顺利终止对基因表达载体来说十分重要，因此在构建基因表达载体时一定要有正常的转录终止序列以防止不必要的转录，增加外源基因的稳定性。
例如，对真核细胞而言，基因表达载体需要含有终止序列以及RNA的二级结构，以及mRNA上游的5′端非翻译序列等。
在构建基因表达载体时，可以注意以下几个方面以最大效率地起始翻译。
（1）AUG是首选的起始密码子。
（2）一般RBS序列至少含有AGGAGG中的4个碱基。
（3）RBS与起始密码子之间的距离以6～12 b为宜。
（4）起始密码子之后的序列是GCAU或AAAA，翻译效率会提高。
ShiYan YanJiu植物乳杆菌高表达组成型表达载体构建王 雪，尚晓敏，李桂玲,刘 琼*吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春 130052摘 要：乳酸菌宿主对表达载体的启动子具有高度的选择性，本研究利用PCR技术扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，以诱导型表达载体pSIP409为基本框架删除其诱导型启动子，采用能快速连接的无缝克隆技术将SlpA 基因启动子连接到gusA基因上游，获得重组质粒409SlpA电转化至植物乳杆菌NC8中，Western Blot定性测定的gusA表达情况，同时利用MRS-X-gluC培养基特异性显色反应来鉴定阳性重组子表达gusA的活性，为利用该启动子表达外源蛋白研制新型基因工程微生态制剂奠定基础。
关键词：嗜酸乳杆菌；启动子；组成型表达载体；Construction of constitutive Expression Vector Base on SlpA GenePromoter and the Function AnalysisWang Xue, Shang Xiao-min，Li Gui-ling，Liu Qiong*College of Food Engineering Jilin Engineering Normal University, Changchun, Jilin, 130052Abstract: Lactobacillus hosts have a high selectivity for the promoter of the expression vector. In this study, the promoter of the SlpA gene from Lactobacillus acidophilus was amplified by PCR, and the expression vector pSIP409 was used as the base frame to remove its inducible promoter. The promoter of the SlpA gene was ligated upstream of thegusAgene by Seamless Assembly Cloning technology and the recombinant plasmid 409SlpA was transformed into Lactobacillus plantarumNC8 by electrotransformation. The positive colony was screened by MRS-X-gluC medium and the specific colony was screened, and the complex steps of detecting the activity of expressed proteins were avoided. This study lays the foundation for further application of SlpA gene constitutive promoter. Keywords: Lactobacillus acidophilus; promoter; constitutive expression vector乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一群革兰氏阳性、能够发酵碳水化合物、以乳酸为主要代谢产物的各类细菌统称，是人与大多数动物肠道内常见优势菌群。
由于乳酸菌在医药、食品、饲料生产等相关领域具有较高的应用价值，被公认为安全级微生物(generally recognized as safe，GRAS)[1]。
构建乳酸菌工程菌株最重要的是高效稳定表达，而启动子是决定外源基因表达效率的关键遗传组件[2]，且乳酸菌属的启动子对宿主有着高度的选择[3]。
因此，在LAB表达系统中很少使用外源启动子。
目前可用于构建LAB表达载体的启动子主要有lac A、lac R、lacS、nisA/nisZ、nisF和usp等[4]，启动子数量偏少，并且大多数属于诱导型启动子[5]。
组成型乳酸菌表达载体在不添加诱导物情况下可以不断地表达目的蛋白，在饲料生产、食品基金项目：吉林省教育厅科技研究项目（2016120）；吉林工程技术师范学院（2016）校科研发展基金项目。
作者简介：王 雪（1995-），女，本科，生物工程专业，河北省阜城，E-mail:7107172322@.*通讯作者：刘 琼（1980-）,女,实验师，研究方向为动物微生态与黏膜免疫学。
E-mail:liuqiong@.ShiYan YanJiu发酵、疫苗开发等生产中简化操作步骤，同时降低成本，便于大规模生产。
嗜酸乳杆菌S-层蛋白是由SlpA 基因编码，是菌体含量最丰富的细胞蛋白质之一，占总蛋白质的10%～20%，研究证实认为S-层蛋白的启动子是强启动子，是细菌中最强启动子之一的乳酸脱氢酶基因启动子的两倍[6]。
因此，利用便于检测的β-葡萄糖醛酸酶（gusA）作为报告基因，以诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSSIP409为基础框架，利用编码嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因的启动子构建高效组成型表达载体，对拓宽LAB 的应用范围具有重要意义。
1 材料1.1 菌株及质粒载体嗜酸乳杆菌ATCC4356，植物乳杆菌NC8，大肠杆菌T OP 10，植物乳杆菌诱导型表达载体pSSIP409由吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存。
1.2 主要试剂Pureplasmid Mini Kit、Bacteria Geno-mic DNA Kit、Gel Extraction Kit 购自康为世纪生物科技有限公司；DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、Bgl Ⅱ、Nco Ⅰ购自Ta-KaRa 宝生物；红霉素（20 mg/mL ）购自宜昌翔荣化工有限公司；5溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-gluc）购自北京驰名瑞生物科技有限公司；兔源gusA 抗血清购自北京生命科学研究所；HRP 标记羊抗兔IgG 购自康为世纪生物科技有限公司；Seamless Assembly Cloning Kit 购自中美泰和生物技术（北京）有限公司。
2 方法2.1 目的基因的扩增取37 ℃静置过夜培养的嗜酸乳杆菌按照Bacteria Genomic DNA Kit 说明书提取嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组。
以基因组为模板，根据Genbank 上发表的SlpA 基因启动子序列设计含有同源碱基序列的长引物(5’GTTTTTATATTACA GCTCCAGATCTACCGGTTGCTTGTGG3’)和SlpA YR （5’GGGGTTTCTACAGGACGTACCATGGATGCGTTAATA GTAG 3’)扩增嗜酸乳杆菌表面蛋白SlpA 基因启动子，下划线标注的是同源序列。
在100 µLPCR 反应管中建立如下反应体系：嗜酸乳杆菌基因组1 µL，2×prime star max 50 µL，上、下游引物各2 µL，加灭菌水至100 µL。
反应条件： 98 ℃条件下变性10 s，45 ℃条件下退火5 s，72 ℃条件下延伸8 s，30个循环，最后一个循环72 ℃延伸1 min。
PCR 产物经0.8%琼脂凝胶电泳后观察结果，并对PCR 产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。
2.2 组成型表达载体构建与鉴定将SlpA 基因启动子序列经凝胶回收纯化后，采用Seamless Assembly Cloning Kit 无缝克隆连接到经Nco Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切的含有gusA 报告基因表达载体pSIP409上，CaCl 2化学转化法转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞中。
用含红霉素的（200 µg/mL）的LB 固体培养基筛选阳性克隆。
挑取单克隆37 ℃过夜培养并抽提质粒获得含有报告基因的表达载体载体409SlpA，并进行限制性内切酶酶切鉴定及测序鉴定。
2.3 表达gusA 植物乳杆菌构建将表达载体409SlpA 电转化到植物乳杆菌NC8中，用含有红霉素（200 µg/mL）和X-gluC （20 µg/mL）的MRS 固体培养基，37 ℃厌氧培养36 h 显色反应，同时选用不添加X-gluC 的MRS 固体培养基设定阴性对照，获得阳性重组植物乳杆菌L P_409S lp AG us A，挑取单克隆接种于5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中37 ℃厌氧过夜培养，质粒小量制备，酶切鉴定。
2.4 Western Blot 测定重组植物乳杆菌gusA 的表达情况挑取重组植物乳杆菌LP_409SlpAGusA 单克隆接种于含有5 µg/mL 红霉素的液体MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS 培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，Western Blot 一抗使用兔抗gusA 血清室温孵育2 h，二抗使用HRP 标记羊抗兔IgG 室温孵育1 h，TBST 洗膜三次后显色。
3 结果3.1 目的基因扩增以嗜酸乳酸杆菌的染色体DNA 为模板，用引物SlpA YF 和SlpA YR 进行PCR 扩增S-层蛋白ShiYan YanJiu基因的启动子SlpA，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，结果表明PCR成功扩增出含有同源碱基序列的SlpA基因。
3.2 重组载体构建通过无缝克隆试剂盒将删除启动子含有报告基因的载体与启动子连接后转化到大肠杆菌感受态Top10后获得重组表达载体409SlpA，质粒小量制备，测序结果通过NCBI Blast分析比较同源性100%。
结果表明，成功将SlpA基因启动子连接到目的载体上，测序结果经NCBI网站blast对比分析后同源性100%。
3.3 重组植物乳杆菌409SlpAGusA的显色反应将表达载体409SlpAGusA电转化入植物乳杆菌NC8感受态中，涂布于添加显色底物X-gluC 和红霉素的MRS固体显色培养基，植物乳杆菌409SlpAGusA菌落有明显蓝色显色反应，结果表明SlpA启动子在植物乳杆菌中具有启动外源基因表达的功能，表达的β-葡萄糖醛酸酶具有与底物X-gluC发生显色反应生物学功能，同时获得了组成型表达载体409SlpAGusA。
3.4 Western Blot 检测植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA 表达gusA情况通过Western Blot 分析，可见重组植物乳杆菌NC8-409SlpAGusA表达出与预期大小相符的目的条带（≈67 kDa）。
