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国家自然科学基金资助项目结题报告资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：CPK10基因调控拟南芥响应干旱胁迫的分子机制研究负 责 人：魏凤菊电话：0312-*******电子邮件：weifj98@依托单位：河北农业大学联 系 人：张永升电话：0312-*******资助金额：22（万元）累计拨款：22.0（万元）执行年限：2012.01-2014.122015年01月16日填表日期：国家自然科学基金委员会制（2012年）NS FC-R E PORT -2014412-TROPER-CFSN报告正文一、研究计划要点及执行情况概述。
研究基本按照原计划执行，一些研究内容稍作调整。
（1）检测了CPK10与HSP1蛋白的可能互作方式。
通过酵母双杂交技术得出HSP1可以发生自身互作。
在利用TAP （串联亲和纯化）技术结合质谱技术分析HSP1与CPK10的作用方式过程中，纯化获得的杂蛋白信号较强，试验未能顺利进行下去。
（2）筛选了与CPK10可能互作的其它靶蛋白。
分离保卫细胞并建立酵母cDNA 文库，通过酵母双杂交技术筛选互作蛋白，获得的蛋白经测序分析多为持家基因表达产物，利用构建的保卫细胞酵母文库筛选CPK10互作蛋白的方法暂告一段。
利用串联亲和纯化技术筛选CPK10可能的互作蛋白，再结合质谱分析技术测得蛋白的氨基酸序列，获得多个候选基因。
（3）对靶基因是否参与干旱逆境进行了初步分析。
检测靶基因受干旱诱导后的表达情况，组织及亚细胞表达情况。
（4）初步检测了cpk10突变体材料中靶基因的表达情况，明确的试验结果有待重复。
（5）获得了CPK10与CPK30的双突变体，初步进行了基因功能分析。
二、研究工作主要进展和所取得的成果。
（一）酵母cDNA 文库的构建及筛选将一定数量的拟南芥第3、4轮莲座叶叶片剪下后洗净，放入匀浆机中，加入适量的冷蒸馏水，打磨成碎表皮条，用孔径为75 μm 滤膜过滤，去除含有大量叶肉细胞的液体，收集碎表皮条。
一、pGADT7(Amp)酵母表达载体(AD-Amp)AD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'F：GC AT CGA TAC ATG GC T TG T GCTACTCTGAR：GGCC GGATCC TTAAGAGAGGTAGCTGGGAGAD forward primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'AD reverse primer: 5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3'二、pGBKT7(Kan0酵母表达载体(BD-Kan)三、BIFC(Kan)验证互做蛋白表达载体（德国）四、pGR107(Kan)表达载体（PVX-10kb）吴建国MCS:ClaI/SmaI/SalI(pgR107)MCS:ClaI/AscI/NotI/SalI(pgR106) 五、BIFC(Amp)载体（美国）3075（nEYFP-329bp）3076 (cEYFP-218bp)F：GGC GAATTC ATG GCTTGTGCTACTCTGA R：GGC CCTAGG AGAGAGGTAGCTGGGAG TAA TAG TGA六、RNAI(Kan)载体-pFGC5941（王宗华）七、pGEX-4T-1(Amp)原核表达载体八：pET-29a(Kan)原核表达载体九、. pEGAD(Kan)植物表达载体*XbaⅠ cleavage blocked by overlapping dam methylation. Must grow in dam-strain to cut. Note, XhoⅠ is not unique.pTRV2(a) Genome organization of TRV. The TRV-RNA1 open reading frames (ORFs) correspond to 134 and 194 kDa replicase, movement protein (MP) and a 16-kDa cysteine-rich protein. The TRV-RNA2 ORFs corresponds to coat protein (CP), and the 29.4 and 32.8 kDa proteins. gRNA, genomic RNA; sgRNA, subgenomic RNA. Asterisks (*) indicate the readthrough of 134 kDa protein.(b) TRV based VIGS vectors. TRV cDNA clones were placed in betweenthe duplicated CaMV 35S promoter (2×35S) and the nopaline synthase terminator (NOSt) in a T-DNA vector. LB and RB refer to left and right borders of T-DNA. Rz, self-cleaving ribozyme. MCS, multiple cloning sites.十、十一、1103-YFP十二：pBINPLUS十三、pBin438。
PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及转化白花丹参体系的建立目的：构建含有大肠杆菌6- 磷酸甘露糖异构酶（6-phosphomannose isomerase，PMI）基因并替换潮霉素抗性（hygromycin，hyg）基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，同时建立以PMI/甘露糖为筛选标记的白花丹参转基因体系。
方法：首先从大肠杆菌Escherichia coli DH5α中克隆PMI基因，然后以PMI基因替换植物表达载体pCAMBIA1305 中的hyg基因，构建了以PMI 基因为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1305-PMI，并用电击转化方法导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 中，用叶片浸染法转化白花丹参。
结果：在白花丹参MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1固体分化培养基中附加20 g·L-1甘露糖和10 g·L-1蔗糖为碳源的选择压力下，pCAMBIA1305-PMI 的转化率为23.7%，对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。
结论：建立了以PMI-甘露糖为选择系统的白花丹参转基因体系，可应用于后续目的基因的转化奠定了基础。
标签：6-磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因；甘露糖；白花丹参；转基因筛选标记传统方法获得的转基因植物中存留的抗生素筛选基因可能会危害人类肠道内的正常菌落或传播到周围环境中引起基因污染。
虽然目前还没有关于标记基因迁移带来危害的报道[1]，但抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性一直颇具争议。
因此，培育具有无抗生素的生物安全性标记基因的转基因植株势必成为未来植物转基因的重要发展方向。
6-磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）基因编码6-磷酸甘露糖转移酶，其产物可催化6-磷酸甘露糖转变为6-磷酸果糖。
（转载）欧阳家百（2021.03.07）一.九种表达载体Pllp-OmpA,pllp-STII,pMBP-P,pMBP-C,pET-GST,pET-Trx,pET-His,pET-CKS,pET-DsbA 二.克隆载体pTZ19RDNApUC57DNAPMD18TPQE30pUC18pUC19pTrcHisApTrxFuspRSET-ApRSET-BpVAX1PBR322pbv220pBluescriptIIKS( )L4440pCAMBIA-1301pMAL-p2XpGD926三.PET系列表达载体ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETDsbFusionSystems39 band40bProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystem33b ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystems ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETExpressionSystemsplu sCompetentCellsProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETGSTFusionSystems41 and42ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETNusAFusionSystems4 3.1and44ProteinExpression?ProkaryoticExpression?pETVectorDNA ProteinPurification?PurificationSystems?Strep?TactinResinsandPurifi cationKits四.PGEX系列表达载体TEcoR?pGEX-1I/BAP pGEX-2TpGEX-2TKpGEX-4T-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pGEX-5X-1 pGEX-5X-2 pGEX-5X-3 pGEX-6P-1 pGEX-6P-2 pGEX-6P-3五.PTYBsystem PTYB1PTYB2PTYB11PTYB12六.真核表达载体pCDNA3.1(-) pCDNA3.1( ) pPICZalphaA pGAPZαA PYES2.0pBI121pEGFP-C1pPIC9KpPIC3.5K如何阅读分析质粒图谱载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
