pCambia35s-ECFP植物表达载体

GUS：β-葡萄糖苷酸酶。[beta-glucuronidase]
NPTⅡ：（大肠杆菌，Escherichia coli，strain K12）新霉素-3’-磷酸转移酶。[neomycin-3’-phosphotransferase]
PAT：草丁膦乙酰转移酶。[phosphinothricin acetyltransferase]
李德安转基因植物常见外源基因及内参基因内参基因
转基因植物常见外源基因及内参基因
内参基因：
Gos：（大米，Oryza sativa）
Ivr：（玉米，Zea mays）转化酶1。[invertase 1]
Lectin：（大豆，Glycine max）植物血凝素。
Patatin：（马铃薯，Solanum tuberosum）块茎贮藏蛋白。
NOSterminator：（根瘤农杆菌，Agrobacterium tumefaciens）烟酰碱合成酶基因终止子。[nopaline synthase]
外源基因：
ACCD：1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶。[1-aminocyclopropane-1-carbox1A(b/c)：（苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种，Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki，strainHD-1 and HD-73）杀虫晶体蛋白b和c的融合蛋白，对鳞翅目昆虫尤其有效。
Cry3A：（苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种，Bacillus thuringiensissubsp. Tenebrionis，strain BⅠ256-82）杀虫晶体蛋白，对科罗拉多马铃薯甲虫（Colorado patato beetle）的幼虫尤其有效。
Pg：（蕃茄，Lycopersicon esculentum）多聚半乳糖醛酸酶[polygalacturonase]

转基因植物35S基因核酸检测试剂盒说明书转基因植物35S基因核酸检测试剂盒说明书试剂盒简介货为了适应新加坡石斑鱼虹彩病毒染料法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照 OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。

应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。

试剂盒组成及试剂配制：酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。

2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。

3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶4.生物su标记抗体稀释液（Biotinantibody Diluent）：1×10ml/瓶。

5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRPavidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.生物su标记抗体（Biotinantibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRPavidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

样本处理及要求：1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。

用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【摘要】为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒栽体pNULPGE200.该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflowermosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site).利用pNULPGE200构建植物基因表达栽体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ (neomycinphosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP (synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选.本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒栽体pBI121构建了植物表达栽体,验证了文中质粒栽体的实用性.%In order to overcome the defects that the commonly used plasmids have a limited number of restriction sites for target gene cloning, and lack expressing elements such as promoter, terminator and selection marker genes, a plasmid named pNULPGE200 for construction of plant gene expression vector was modified. The plasmid contains cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (NOS) ter-minator, and a multiple cloning site between them. The target gene amplified by PCR can beinserted directly between the 35S promoter and the NOS terminator, and can be expressed in plants stably. pNULPGE200 also contains two independent expression marker genes, encoding neomycin phosphotransferase Ⅱ(NPT Ⅱ) and synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation (sGFP), which can be used for mutual selection in plant transformation. The practicability of the plasmid was confirmed by comparing with a conventional plas-mid pBI121 in the construction of the gene encoding xylene monooxygenase from Pseudomonas putida to create a plant gene expression vector.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2018(022)002【总页数】8页(P114-121)【关键词】质粒改造;植物基因表达载体;载体构建;二甲苯单加氧酶基因【作者】安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【作者单位】宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】Q782自1984年首次获得转基因烟草[1]以来,以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。

小麦育种中的分子标记技术应用研究小麦是世界上最重要的农作物之一，也是人类最古老的粮食作物之一。

在全球范围内，小麦是最广泛栽培和消费的作物之一，也是粮食产量最高的农作物之一。

然而，小麦的育种工作一直面临着许多困难和挑战，如繁殖周期长、杂交不易、基因广泛等。

随着分子生物学和生物技术的不断发展，分子标记技术被广泛用于小麦育种中，为小麦品种的改良和优化提供了有力的支撑。

一、分子标记技术在小麦育种中的应用分子标记技术是指对DNA分子上的一些特定区段进行检测和分析，以识别和区分不同品种或个体之间的遗传差异。

分子标记技术可以根据不同的检测方法分为PCR技术、RFLP技术、SSR 技术、AFLP技术、SNP技术等。

小麦育种中，分子标记技术主要应用在以下几个方面：1. 分子鉴定：通过对小麦中特定基因的片段进行PCR扩增，并用特定酶切方法对PCR产物进行测序和比对，从而快速鉴定小麦中的病原体、杂交种、杂交后代等。

这在小麦种质资源保护和繁殖中具有重要意义。

2. 密度图谱构建：通过对小麦不同基因座位的特定序列进行扩增和分子检测，可以构建小麦品种间的遗传连锁图谱，从而为小麦的基因组测序、基因图谱构建、群体遗传学研究等提供了必要的技术支撑。

3. 基因定位：通过对检测到的分子标记和相关表型性状进行关联分析，可以在小麦物理和遗传连锁图谱上精确定位相应的基因，进而揭示小麦重要性状的遗传机理，为小麦品种改良提供精确的分子标记和命中率高的候选基因。

4. FISH karyotyping：通过使用荧光原位杂交技术(FISH)，以小麦染色体的比较序列为探针，在活体细胞的染色体上进行显微分析，从而揭示小麦的染色体组成与结构，为小麦遗传变异和组合育种提供必要的基础支撑。

二、小麦育种中分子标记技术面临的问题和挑战虽然分子标记技术在小麦育种中具有重要意义，但也面临着一些问题和挑战。

1. 技术标准化问题：不同地区、不同实验室对分子标记技术的操作标准和质控要求存在差异，导致相同小麦品种的分子标记结果不一致，限制了小麦育种研究的进展。

究,以阐明防治肝纤维化的现代作用机理中药复方抗肝纤维化的现代药理学研究包括药效学和药动力学,其中药效学研究开展的较早相对容易,但多数研究局限于药物效应方面,真正涉及到作用机制方面的研究还不广泛和深入。

而药动学的研究尚处在起步阶段,更深层次的研究较为少见,故中药复方药效学和药代动力学的研究应是今后重点研究方向之一。

由于中药复方对器官或组织的选择性不明显,药物活性不强烈,药效作用温和,往往长期服用才显现药效,所以应用中药复方进行抗肝纤维化的防治研究时应注意时效和量效关系的研究,但由于复方药物成分复杂,各药配合后药性、药效的变异,给复方抗肝纤维化的药动学研究增加了很多困难,所以目前从时效和量效关系方面着手的抗肝纤维化复方研究并不很多。

杜以兰等[3]提出采用由量—效关系和时—效关系求效量半衰期的方法研究其药动学。

还有人提出证治药动学伪说,根据证候与治疗的关系探讨方剂的效应,并相继提出“效应成分动力学”“中药复方活性成分群”等概念,代表了复方药理学研究的新思路。

中药复方抗肝纤维化的药效学和药动学研究是研究中药的药理效应及引起这种效应的有效成份在体内吸收、分布、代谢和排泄等量变规律的科学,可为临床抗肝纤维化时合理用药,优选用药方案及精选复方中的药味提供重要的理论依据,所以应是中药复方抗肝纤维化现代研究中新的研究思路和研究方向。

综上所述,若能立足于中药复方抗肝纤维化多靶点、多环节、多层次的整体优势,把握肝纤维化复杂的病理变化,建立起方证相符的病理学模型,有效开展中药复方的药理学研究,以中医理论为指导,筛选出疗效确定、临床与实验结果一致、经得起重复的复方制剂,那么,相信中药复方抗肝纤维化的防治研究和临床疗效将会跨上一个新的台阶。

参考文献:[1]王宝恩.中药复方861冲剂治疗肝纤维化远期疗效的观察[J ].中西医结合肝病杂志,1993,1(2):69.[2]董筠.乙肝抗纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床与实验研究[J ].南京中医药大学学报,1998,14(6):335-338.[3]李成韶,杜以兰.以药效为指标进行中药药动学研究的思路和体会[J ].中药药理与临床,1998,4(1).(收稿日期:2004-03-16)DNA 分子诊断技术在中药鉴定中应用刘雯霞1　雷国莲2(1.陕西中医学院研究生,陕西咸阳712046;2.陕西中医学院药学系生药教研室,陕西咸阳712083)摘　要:综述DNA 分子诊断技术在中药鉴定中的应用研究,重点论述分子诊断技术的分类及常用RAPD 技术,AFL P 技术及基因片段序列研究状况。

利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性β-甘露聚糖酶是一种重要的水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物组织中，是一种能够水解β-甘露聚糖的酶类。

β-甘露聚糖酶在许多生物学过程中起着重要作用，比如在植物的生长发育、细胞壁代谢、应激响应等方面都发挥着重要的作用。

研究β-甘露聚糖酶的活性对于理解植物生长发育和抗逆性有着重要的意义。

刺萼龙葵（Solanum aculeatissimum Jacq.）是茄科植物中的一种，广泛分布于南美洲和亚洲热带地区，又名刺浆果茄，具有较高的经济价值和药用价值。

刺萼龙葵的种子中富含β-甘露聚糖酶，因此利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性，可以为深入研究刺萼龙葵的生物学特性提供重要依据。

本文将介绍利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的方法和步骤，并对测定结果进行初步分析和讨论，旨在为该领域的研究工作提供理论和实验基础。

一、实验材料与方法1. 实验材料（1）刺萼龙葵种子：新鲜采集的刺萼龙葵种子；（2）β-甘露聚糖酶提取液：含有一定浓度的β-甘露聚糖酶的提取液；（3）琼脂：用于制备凝胶；（4）碘液：用于染色检测。

2. 实验方法（1）β-甘露聚糖酶提取将刺萼龙葵种子磨碎并加入适量的缓冲液进行提取，通过离心等操作获得β-甘露聚糖酶提取液。

（2）制备琼脂凝胶将琼脂按照说明书中的方法配制成适当浓度的琼脂溶液，并倒入培养皿中，待凝固后在表面钻孔。

（3）凝胶扩散反应在琼脂凝胶上均匀涂布一定浓度的β-甘露聚糖酶提取液，再在固定位置上钻孔注入碘液，观察并测定孔周围的清晰圈和直径。

二、实验结果与分析通过上述实验方法，我们成功利用凝胶扩散法测定了刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性。

观察结果显示，在琼脂凝胶表面形成了一定大小的清晰圈，且直径随着β-甘露聚糖酶提取液中酶活性的增加而增大。

这表明刺萼龙葵种子中存在一定浓度的β-甘露聚糖酶，并且具有一定的活性。

从实验结果可以初步推断，刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性较高，这与刺萼龙葵种子中富含β-甘露聚糖酶的特点相吻合。

表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。

请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。

同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。

2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。

本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M ATTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。

BGH rev BGH rev,c-mycrev BGH rev,V5rev EBVrev EBVrev EBVrev,T3 T3 EBVrev,T3 T7 PCM V5R pCM V6-3、HGHrev pCM V6-3、HGHrev PCM V-R，EBVrev PCM V-R, EBVrev BGH rev,c-mycrev T7 SP6/M 13rev DuetDOWN1
p B42ADF p BMN_5' BAC1 p BAD-F p BAD-5' T3/M 13rev p BD-GAL4-F 35S GAL4-Bdfor M 13F/T7 T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev PBRforBam p BRforEco PBRforBam PBRforBam GAL4-Bdfor not available T3/M 13rev T7 T3 CM V-Profor,T7 EF-1α Fwd CM V-Profor,T7 p BV220F T7/Tac-Profor
p DSRED-N-R T7/ M 13R T7/ M 13R（距离插入位点合适， 优先安排） M 13R（距离插入位点合适，优 先安排）
p EASY-T 1 p EASY-T 3 p ECFP-N(C) p EF/my c/cyt o/ER/mit o/nuc p EF1(4,6/my c-His) p EF1(4,6/V5-His) p EF1(4;6/His_A;_B;_C) p EF5/FRT /V5-D(-T OPO) p EGFP p EGFP-1 p EGFP-C p EGFP-C1 p EGFP-C2 p EGFP-C3 p EGFP-F p EGFP-N p EGFP-N1 p EGFP-N2 p EGFP-N3 p ENT R p ET -11(-a,-b,-c,-d) p ET -12(-a,-b,-c) p ET -14b p ET -15b p ET -16b p ET -17b p ET -17xb p ET -19b p ET -20b(+) p ET -21(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -22b(+) p ET -23(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -24(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -25b(+) p ET -26b(+) p ET -27b(+) p ET -28a(-b,-c)(+) p ET -29a(-b,-c)(+) p ET -3(-a,-b,-c,-d) p ET -30_Ek/LIC p ET -30_Xa/LIC p ET -30a(-b,-c)(+) p ET -31b(+)

沙漠小球藻转植物表达载体的表达预测微藻是地球上出现最早的生命之一，是一种能利用光合作用生活和生长的微生物，广泛分布于海洋、陆地、湖泊以及干旱的沙漠之中。

它们的形态各异，呈丝状、球形和椭圆形等等，只要是有光和潮湿的地方都能找到这些生命的痕迹[1]。

新疆古尔班通古特沙漠是我国第二大沙漠，年降水量70～150 mm，冬季有积雪，其最低温度可达-25 ℃，而最高温度可达35 ℃[2]。

即使在这样的条件下，也分布着百余种藻类，小球藻就是其中之一[3]。

小球藻和其他生长在沙漠里的藻类一样，适应了沙漠的极端环境，表现出较强的生命力。

小球藻是绿藻门的一种，细胞呈球形或椭圆形，细胞的大小在3～8 μm之间，也是单细胞藻类植物和真核生物的一种。

由于遗传的相对保守性?p生长快?p分布广?p营养要求简单和成本低廉等特点，是在单细胞水平上研究基因表达及其生理生化的理想材料。

而基因工程也是研究热点之一，目前的转基因技术有鸟枪法[4]?p根癌农杆菌介导法[5]和电转化法[6]。

由于电转化法有效率较高、简单、方便、成本低等特点，在微藻遗传转化过程中也被广泛使用。

启动子是外源基因是否表达的关键，这决定着基因表达与否及其表达量，所以在小球藻基因工程的研究中也起着至关重要的作用。

目前，CaMV35S 是基因工程中常用的启动子之一。

CaMV35S是一种花椰菜花叶病毒启动子，能够在植物表达系统中启动基因的表达[7]，也有研究表明CaMV35S可以在小球藻表达外源基因[5，8]。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是由238个氨基酸组成的多肽链，分子量约为27 ku，基因编码序列约 750 bp。

纯化的GFP蛋白与体内表达的GFP蛋白的发光光谱相似，在蓝光或紫外光激发下，无论其表达在原核或真核细胞中，都能利用荧光显微镜在不需要其他辅助条件下看见绿色荧光。

绿色荧光蛋白还具有低毒性和不干扰细胞正常生活等优点，使得GFP在生物研究领域中得到广泛应用。

camv35s启动子是什么高等植物启动子研究进展启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游。

一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。

在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。

一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是启动子调控基因转录的实质。

根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。

1 组成型启动子在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子，双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子，它具多种顺式作用元件。

其转录起始位点上游-343～-46bp是转录增强区，-343～-208和-208～-90bp是转录激活区，-90～-46bp是进一步增强转录活性的区域，在了解CaMV 35S启动子各种顺式作用元件的基础上，人们利用它的核心序列构建人工启动子，以得到转录活性更高的启动子，Mitsuhara等利用CaMv 35s核心启动子与CaMV 35S启动子的5'端不同区段和烟草花叶病毒的5'非转录区（omega序列）相连，发现把两个CaMV 35S启动子-419～-90（E12）序列与omega序列串联，在转基因烟草中GUS有最大的表达活性，把7个CaMV35S启动子的-290～-90（E7）序列与omega序列串联，非常适合驱动外源基因在水稻中的表达。

用这两种结构驱动GUS基因表达，在转基因烟草和水稻中GUS活性比单用CaMV 35S启动子高20～70倍。

V ol.30,N o.11pp.1135-1139　N ov.,2004作　物　学　报ACT A AG RONOMICA SI NICA第30卷第11期2004年11月　1135～1139页花椰菜花叶病毒(C aMV )35S 启动子在转基因棉花中的表达焦改丽1　孟钊红2　聂安全1　南芝润1　张换样1　李俊峰3　王娇娟1赵俊侠1　李燕娥1　郭三堆4Ξ(1山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000;2山西大学生物技术研究所,山西太原030031;3中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266000;4中国农业科学院生物技术研究中心,北京100081)摘　要　利用G US 作为报告基因,通过G US 组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚,R 0代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚G US 基因表达情况,详细阐述了CaM V 35S 启动子在棉花细胞中的表达轮廓。

结果表明,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中G US 基因能稳定表达并遗传给后代细胞;在根、茎、叶细胞中检测到G US 表达活性。

在胚胎发育过程中,最早检测到G US 表达活性的为开花11d 的鱼雷胚和胚乳。

随着胚胎的发育,G US 表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织,表明CaM V 35S 启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。

在花粉和特殊的纤维细胞中,也检测到G US 的表达活性。

资料证明,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

关键词　G US 基因;花椰菜花叶病毒(CaM V )35S 启动子;转基因棉花;胚胎发育;表皮细胞中图分类号:S562Expression of C aMV 35S Promoter in T ransgenic CottonJ IAO G ai 2Li 1,ME NG Zhao 2H ong 2,NIE An 2Quan 1,NAN Zhi 2Run 1,ZH ANG Huan 2Y ang 1,LI Jun 2Feng 3,W ANG Jiao 2Juan 1,ZH AO Jun 2X ia 1,LI Y an 2E 1,G UO San 2Dui 4(1Institute o f Cotton Research ,Shanxi Academy o f Agricultural Sciences ,Yuncheng 044000,Shanxi ;2　Biotechnology Research Institute ,Shanxi Univer sity ,Taiyuan 030031,Shanxi ;3　College o f Marine Life Sciences ,Ocean Univer sity o f China ,Qingdao 266000,Shandong ;4　Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy o f Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China )Abstract The CaM V 35S prom oter is the m ost widely used prom oter for driving transgene expression in plants.It is effec 2tive driving transgene expression in both dicots and m onocots.It is usually classified as constitutive prom oter.H owever ,some reports suggest that it is not expressed in all cell and tissue types.In addition ,the available in formation on its expres 2sion profile in all cell and during the early stages of development is incom plete.In this paper ,the expression profile of CaM V 35S prom oter was detailedly described using the G US as a reporter gene in the transgenic cotton.The results of his 2tochem ical assay showed that G US gene could express steadily and transm it to next generation in the course of callus m itotic division and proliferation.Dark blue staining of G US was observed at various stages of somatic embry os (globular ,heart ,topedo ,cotyledon )and the roots ,stems and leaves of R 0.G US positive expression was first detected during the early stages of torpedo embry o and endosperm at around 11days after anthesis.W ith further growth of the embry os ,the G US staining became stronger and spread to throughout the vascular tissues in the cotyledon.Especially G US positive expression is detected in the pollens and special fiber cells.It showed CaM V 35S prom oter was the same active in these specialized epidermal cells.Thus ,our evidences suggest that CaM V 35S prom oter was developmentally regulated during embry ogenesis in cotton.The prom oter could express in m ost cell and tissue types in cotton at various developmental stages.K ey w ords β2glucuronidase (G US )gene ;CaM V 35S prom oter ;T ransgenic cotton ;S omatic embry o ;E pidern cell 早期使用G US 作为报告基因,研究CaM V 35S 启动子在转基因植物中的表达分布情况,主要局限Ξ基金项目:山西省“十五”重点攻关项目(03100521),山西省留学回国人员科技资助项目和国家“十五863”计划项目的一部分。

pET-3a(+)pET-3c-sumo pET-3d(+)pET-11a(+)pET-12a(+)pET-15b(+)pET-16b(+)pET-17b(+)pET-19b(+)pET-20b(+)pET-21a(+)pET-21b(+)pET-21d(+)pET-22b(+)pET-23a(+)pET-23b(+)pET-24a(+)pET-25b(+)pET-26b(+)pET-27b(+)pET-28a(+)pET-28b(+)pET-28c(+)pET-28a(+)-sumo pET-28a(+)-GFP pET-28a(+)-SMT3 pET-29a(+)pET-30a(+)pET-30c(+)pET-31b(+)pET-32a(+)pET-32a(+)pelB pET32a-LC3pET-32a(+)LicpET-35b(+)pET-38b(+)pET-39b(+)pET-40b(+)pET-41a(+)pET-42a(+)pET-43.1a(+)pET-44a(+)pET-49b(+)pET-50b(+)pET-52b(+)pMCSF1pMSCF3pRSFDuet1 pCDFduet1pColA duetE.coli EPI300Ecoli MC1061BL21BL21goldBL21(DE3)BL21(DE3)plysSBL21(DE3)GoldplysS BL21AIBL21SIBL21codonplusRIPL BL21codonplus（DE3) BL21TrxB（DE3)BL21（DE3)RDBL21Star（DE3）BL21RPBL21RILRosetta(DE3)Rosetta(DE5)Rosetta Blue(DE3) Rosetta(DE3)plysS Rosetta2(DE3)Rosetta2(DE3)plysS Rosetta-gami(DE3) Origami(DE3)Origami2(DE3) OrigamiB(DE3)Origami(DE3)plysS Rosetta-gami 2(DE3)placI Rosetta-gami 2(DE3)pLysS Rosetta-gami B(DE3)pLysS BLR(DE3)Novablue（DE3)B834(DE3)JM83AD494（DE3)HM174（DE3）HM174（DE3）plysSC41(DE3)C41(DE3)plysSC43(DE3)Turner（DE3）Turner（DE3）plysSJM101JM105JM109JM109（DE3)DH5aλpirK12MG1655XL1blueXL10 goldTop10Top10F’BM25.8BW23473SG1117TurboT1TG1TB1M15ER2566C2566ER2529ER2738HB2151S-17SM10JF1125BJ5183HB101K802C600JM110TH1AM1W3110DH10bacY1089Y1090Antarctic Express Antarctic Express(DE3) Antarctic Express(DE3)RP Antarctic Express(DE3)RILDH5αJM110TOP10XL2-Blue MRF’Mach1 T1OmniMAX2 T1 Phage-Resistant Cells EZ10DH10BSUREpubs 520DB3.1pCold IpCold IIpColdIIIpCold-sumopCold-TFpPin point xa1pPin point xa2pPin point xa3pPin point CATpMAL-c2xpMAL-p2xpMAL-p5xpMAL-c5xpMAL-c4xpMAL-p4xpMAL-p5epTWIN1pTWIN2pLLP-OmpApLLP-STIIpMBP-PpMBP-CpET-TrxpET-HispTrc-CKSpET-DsbApET-MBPpET32M3CpGEX-4T-3pGEX-5x-1pGEX-6p-1pGEX4T-1/Gst-His-HA pGEX3XpGEX-1λT-6His-GST-PP pGEX2tkpkk223-3pkk232-8pBV220pBV221pBV222pRsetApRsetBpRsetCpRsetB td Tomato pBBRMCS pBBRMCS2 pBBRMCS3 pBBRMCS4 pBBRMCS5pTrcHisApTrcHisBpTrcHisCpBADHis ApBADHis BpBADHis CpBADMycHisA pQE2pQE9pQE30lacIqpQE30pQE31pQE32pQE40pQE60pQE70pQE80L pQETrisystem pEZZ18pSE380pWHM3pQBI63pTrc99A pTrcMECTpTrcpTYB1pTYB2pTYB11pTYB12pCYB1pBAD18pBAD24pBAD33pBAD43pBAD24-GFP pDest15-N-throbin pDest22pDest32pED-Trx-pp-air pED-pppED-DsbA-pp-airpED-GST-pp-airpCWori+pITG TrxpT7tspTT5pALEXpUC18pUC19-GFPpUC19pUC18-p43pUC118pGEM3ZF+pEGM-7ZF(+)pEGM-11ZF(+)pKT100pME6032SuperCosmidpBR322pACYC184pACYC177pBluescript II SK(+) pBluescript SK(+) pBluescript II KS(+)pG-KJE8pGro7pKJE7pG-Tf2pTf16pEC86pET-28a-fabppETcoco-1酵母杂交系统pACTpACT-MyoDpBIND-IdpG5 lucpCMV-BDpCMV-ADpBD-p53pBD-NF−κBpAD-SV40TpAD-TRAFpFR-lucpGBKT7pGADT7pCL1pGBKT7-53pGADT7-TpGBKT7-LampACT2 ADY187AH109pSospMyrpSos MAFBpHis2pHisSi-1p53bluepGAG424pLaczip53hispGAD53mpBridgeY2H Gold Yeast strain Y187pINDpOPRSVIpOPI3CATpCMVLacIpSwitchpGene v5-His BpcDNA4/TO/Myc-His A pcDNA4/TO/Myc-His B pcDNA4/TO/Myc-His C pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ pcDNA6/TRpTet-OnpTet-OffpTRE2pTRE2 hygropTK-hygpRevTet-OnpRevTet-OffpRevTREpTet on advancedpTRE TightpTRE Tight Luciferase pCMV-Tet3GpTRE3GpTRE3G-LucpNI v2pNG v2pNN v2pHD v2pTALETF v2 (NN) pTALETF v2 (NG) pTALETF v2 (NI) pTALETF v2 (HD) pTALEN v2 (NI) pTALEN v2 (NG)pTALEN v2 (NN)pTALEN v2 (HD)pX335pX260pX320pShuttle-CMVpShuttlepAdTrack-CMVpAdTrackpAdEasy-1BJ5183AdEasy-1pAd/BLOCK-iT-DEST RNAi Gateway Vector pDC315pBHGloxdelE13crepShuttle-IRES-hrGFP2pAAV-MCSpAAV-RC2pAAV-RCpHelperpAAV-LacZpAAV-IRES-hrGFPpCMV-MCSRNAi-Ready pSIREN-RetroQRNAi-Ready pSIREN-RetroQ-DsRed-Express RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen pSilencer5.1-U6-RetropSilencer5.1-H1-RetropRetroX-IRES-ZsGreen1pRetroX-IRES-DsRed ExpresspLNCX2pQCXIHplvx-RNA1plvx-RNA2pMSCVpuropSuperpSuper retro GFP-neo pSupeior puropBabe puropCMV-Gag-polpCMV-VSV-GpCL AmphopSuper retro puropLVX-shRNA1pLVX-shRNA2pSicoRpSicoR pGK puro pLentilox 3.7pLKO.1 puroPLKO.1pLKO.3GpTet-PLKO-puro pPRIME-TET-GFP-FF3 pPRIME-TREX-GFP-FF3 pSIH1-H1-CoGFPpGIPZ emptypGIPZ controlpTRIPZ emptypTRIPZ controlpLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-AcGFP1-N1pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-td Tomato pLVX-IRES-mCherry pLVX-IRES-neopLVX-IRES-puropLVX-puropLVX-Tight-PuropLVX-Tet-On-AdvancedpLVX-TRE 3GpLVX-Tet 3Gplvx-i-TDpLenti4 TO/V5 DESTpLenti6 V5 DESTpLenti6-UbC-V5-DESTpCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pCDH-CMV-MCS-EF1-puro pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pWPXLFUGWpLVTHpLVTHMpLp1pLp2pLp VSV GpCgpVpVSV GpCMV-dR8.91pCMV-VSV-GpSPAX2pMD2.GpMDLg pRREpRSV-revpCMV-VSV-GpLentG-KOSMTetO-FUW-OSKMFUW-M2rtTAFUW-tetO-hOCT4FUW-tetO-hSOX2FUW-tetO-hKLF4FUW-tetO-hMYCpCDF1-MCS2-EF1-copGFPpFP93LeGO-iC2pLOX-CW-CREpLOX-CWBmi1pLOX-TERT-iresTK pLOX-Ttag-iresTK pGensil-1Stbl3Stbl4Stbl4PiggyBac Dual promoter Super PiggyBac Transposase pGAS-TA-LucpSTAT3-TA-LucpISRE-TA-LucpTA-LucpIκB-EGFPpNFAT-TA-Luc pCaspase3-sensorpAP1(PMA)-TA-Luc pCRE-LucpGRE-LucpHSE-Lucp53-LucpAP-1-LucpNF-κB-Lucp38-betap38-бp38-γπp-JNKK2pCDNA3.1-flag-TRAP2 pCDNA3.1-flag-TAK1HA-ASK1pCDNA3-myc-MEKK3pCMV-MDMZpEGFP-N1-raf通路pSRE-LucpGL4.10pGL4.13pGL4.19pGL4.26pGL4.27pGL4.29pGL4.30pGL4.75TOPFlashFOPFlash SuperTopFlashpE2F-TA-LucpSilencer1.0pSilencer 2.1-U6 hygro pSilencer3.0-H1 pSilencer 3.1-H1 hygro pSilencer 3.1-H1 neo pSilencer 4.1-CMV neo pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase pSV-β-galacosidase psiCHECK-2pmir GLOpGenesil-1pmR mCherrypmiRZip anti-microRNA pRNATin-H1.2/Neo pRNATin-H1.2/Hygro pRNATin-H1.2/Retro pRNA-H1.1/Adeno pYES2pYES2-EGFPpYES2-KanpYES2-flagpYES3/CTpYES6/CTpYES2 NTApYES2 NTBpYES2 NTCpFA6a-GFP(S65T)-His3MX6_1x pFA6a-GFPS65T-KanMX6 pESC-LeupESC-TrppESC-HispESC-UrapRS316pRS316HApRS426pRS426galpRS41HpRS41H-启动子pYCP211pYIP5pYRP7pYX212pYIP211pADH2PACT2-ADpDR195p416GFDpYEplac112pYEplac195Ycp22lac-EGFPYcplac33pAUR123pUG6pUG35pSH65pSH63pSH47 INVSc1S288cW303-1ABY4741BY4742FY837YPH499YS58YM4271 pPIC9pPIC9kpPIC9khis pPIC9kmut pPICZalphaA pPICZalphaB pPICZalphaC pPICZA pPICZB pPICZC pGAPZalphaA pGAPZalphaB pGAPZalphaC pGAPZA pGAPZB pGAPZC pPIC.5k pPIC3.5pAO815 pPink HCpPink LCpPink HC alphapMET αBpMET αCpPIC ZαGBpPIC ZαFCpPIC ZαDpHIC-PILA503ZαGApFLD-catp334BFD15pink1pink2pink3pink4SMD1168SMD1168HSMD1163KM71KM71HGS115GS190GS200JC308JC220pENTR 1ApENTR3CpDONR221pDONR ZeopcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative pLenti6/TRDB3.1pYD1EBY100pDisplay植物载体pcambia35s-EGFP pcambia2301-101 pcambia35s-EYFP pcambia35s-ECFPpTCK303pBI101pBI221-GFPpBI121pBI121-GFPpcambia1300-221Super1300pcambia1300GFP pcambia 1200pcambia1201pcambia12811Zpcambia1300pcambia1301pcambia1302pcambia1303pcambia1304pcambia1305.1pcambia1305.2pcambia1380pcambia1381xcpcambia1381xapcambia1381pcambia1381xbpcambia1381Zpcambia1390pcambia1391pcambia1391Zpcambia1391xapcambia1391xcpcambia1391xbpcambia2200pcambia2300pcambia2301pcambia0380pcambia0390pcambia2201pcambia1291ZATCC15834 发根农杆菌LBA9402pKANNIBALpHANNIBALpGreen029pSPYCE（M）pSPYCE（MR）pspYCEMpspYCEMRpspYNE173pspYNE173RpSAT4 nVenus-CpSAT1 CCFP-NpSAT1 CCFP-CpPZp-RCS2-BarpSAT6 nCerulean C(A+)p416GFDpDF15枯草芽孢杆菌表达系统pMUTIN4pMUTIN4GFPpCSN44pMA5pMA5MCSpMA-H3pMA09-JpMA09-HpHY300pHY300plkpXMJ19pIL253pZL507pDG1363pSG1154pHT304pHCMC04 pHCMC05pAD43-25pMA5pMA5MCSpGFP315pGFP22pHT01pHT43BCL10501A75WB600BS168WB600WB800WB800NpHIS1525pK18mobSacB巨大芽孢菌 WH320巨大芽孢菌YYB pHT1谷氨酸棒杆菌ATCC13032其他酵母表达系统pKLAC1GG499pSEP1pSEP2pSEP3粟酒酵母SP01粟酒酵母SPQ01T载体系列pCXSNpCUXNpXDGpXDR细胞通路载体p38-betap38-бp38-γπp-JNKK2pCDNA3.1-flag-TRAP2 pCDNA3.1-flag-TAK1HA-ASK1pCDNA3-myc-MEKK3 pCMV-MDMZpEGFP-N1-raf通路JM109 MEKK1 fl pcDNA3-HA-TAB1ERK （WT）Pgex4t1-GST-IKB pSicheck2pQCXINpDONR221Top10 pROSEJM109 MEKK1 fl ERK （WT）pBabc-puroHA A8F1HAcdc37pcMV flag MEKK1 pBARK1pBD67其他表达系统pOS7001pHGF9050pIJ8860pRK2013pVLT33pJLA 502pIL253PSM-402pAP-B03pECX99EpXJM19pCS2-HApDG148pMK3S17-lamda pir pMG36ePYCTpNZ8048MG1363NZ9000pBIG2R-HPH2pAN7-1pAN8-1pKC1139哺乳动物真核表达质粒pSR-GFP/NeopVAX1pBudCE4.1pSFV1pCEP4pUB6/V5 His ApUB6/V5 His BpUB6/V5 His CpUB6/V5 His lacZpCMV5pCMV-Tag 2 BpCMV-Tag 5BpSecTag2 ApNTAP-BpBK-CMVpTracer CMV2pSG5pCI-neopCIpSIpCMV-mycpCMV-HApIRESpIRES neopIRES neo3pIRES hyg3pIRES puro3pIRES2-EGFPpIRES-hrGFP-1a pIRES-Dsred-Express pBI CMV1pFLAG CMV2pVitro2-neo-mcs pCAGGSpWHEREpBC1pcDNA4T/0pcDNA4/V5-His A pcDNA6TRpCDNA3.0-GFPpCDNA3.0pcDNA3 flagpcDNA3 EGFPpcDNA3.1HApcDNA3.1MycpcDNA 3.1-c-His/myc pcDNA3.1(+)/Myc HisB pcDNA3.1(zeo)+ pcDNA3.1/GSpcDNA3.1(-)/myc-His A pcDNA3.1-V5-HisA pcDNA3.1-CT-GFP pcDNA3mito RFP pcDNA4/HisMax B pcDNA6-Myc/His B pIE1pIEX-bac3pCDNA6 myc His C pfastbacIpFastBacIIIpFastBacI-Gus pFastBacHT ApFastBacHT B pFastBacHT C pFastBacHT-CAT pFastBacDualpFastBac-c-His-TEV pFastBac-N-GST-TEV pBlueBacHis2 A pBlueBacHis2 B pBlueBacHis2 CpIEXBac-1pIEXBac-c-EGFP-3 pIEXBac-c-EGFP-1 pIEXBac-c-EGFP-4pVL1392pVL1393pVL1392-XyIE control vector pCo-blastpAc5.1apAc5.1bpAc5.1 V5-His BpMT/V5 HispMT-Bip-V5-HisApEF1/myc-His BpEF1/V5 HisApEF4/V5 HisApEF6/Myc-HisCpMIB v5-His BpIZT/V5-Hissf9细胞High Five细胞DH10BacpFBDMpUCDMpBADZ-His6CreDH10MultiBac pDsRed2-N1 pDsRed2-C1 pDsRED-Monomer-N1 pDsred2-4T-1 pDsred2-32a pscherry1pmCherry-N1 pmCherry-C1pRFP-N3pEYFP-N1pEYFP-C1pEGFP-N1pEGFP-C1pEGFP-N3pEGFP-C3pECFP-N1pECFP-C1pEGFP-1pAcGFP1-1pDsRed2-1 pZsYellow-N1 pAmCyan-N1 pLEGFP-N1 pLEGFP-C1 pDsRED2-ER pDsRED2-Mito pDsRED2-Nuc pDsRED2-Peroxi pDsred-Express C1 pEYFP-GolgipEYFP-MempEYFP-ERpEYFP actinpEYFP tubpEGFP-ActinpECFP-ERpECFP-Mito pPAmCherry-Tubulin mRFP-ERDkeima fluorescent protein mAmetrinepDsRed-Monomer pEBFP-N1pEBFP-C1pEBFP-C2pAcGFP1-1pGreen0029pSicor EGFPpCDNA3.1（-）-MRFP pGL3-basicpGL3-controlpGL3-enhancerpGL3-promoterPGL3-SV40PGL3-CM 转DH6αpRL-TKpRL-CMVpRL-SV40pGluc-basicpSIM5pSIM6pKD3pKD4pKD20pKD46PCP20基因野生型P53myc-hTERTSV40 Large TTaqklentaqPfuKODT4 DNA ligaseT4 PNKTEVSUMOSUMO protease 2pP-αSUMO3GST-3CLYZ-pPICZα(溶菌酶表达毕赤酵母载体）Vaccinia viru Topoisomerase Imouse RITNFTGFLysozymeM-MLVM-MLV(-)CreCCDB-TsfGFP大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenow）大肠杆菌DNA聚合酶I普通微生物菌种红发夫酵母（自己分离）酿酒酵母S288c（自己分离）葡萄牙假丝酵母(自己分离）多形汉逊酵母 NRRL Y-11170白色念珠菌ATCC 10231酿酒酵母 S.c197管囊酵母(自己分离）原毛黄孢平革菌 ATCC 34540热带假丝酵母 NRRL Y-12968马其顿假丝酵母CICC 1765巴斯德假丝酵母 NRRL Y1603三角酵母（自己分离）南极假丝酵母NRRL Y-7954 Ash bya gossypii NRRL Y-1056酿酒酵母 CGMCC2.1多形汉逊酵母 NRRL Y-11170出芽短梗霉 CICC40333黑曲霉（自己分离）简青霉CGMCC3.4402热带假丝酵母 CICC 1272树干毕赤酵母 NRRL Y-11545光滑假丝酵母NRRL Y-65长娄德酵母CGMCC2.1589季也蒙毕赤酵母CGMCC2.1801克鲁维酵母K.aestuarii Y-5370出芽短梗霉 NRRL Y-2311-2出芽短梗霉（自己分离）出芽短梗霉 ATCC 62921美季假丝酵母CGMCC2.1919安格斯毕赤酵母 NRRL Y-2214德巴利汉逊酵母NRRL Y-2021解脂亚罗酵母 CICC1441白色假丝酵母CGMCC 2.538卡尔斯博厄酵母 CICC1746赭色掷孢酵母CGMCC2.2113赭色掷孢酵母NRRL Y-5483简青霉（自己分离）乳酸克鲁维酵母CICC1773近平滑假丝酵母 CGMCC2.1786构巢曲霉ATCC38163博伊丁假丝酵母 NRRL Y-2332-2荚膜毕赤酵母 NRRL Y-1842博伊丁假丝酵母 NRRL Y-2332安格斯毕赤酵母 NCYC 495绿色木霉 NRRL3652大毛霉 NRR3635黑曲霉 NRR566米根霉（自己分离）嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-1102嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-1172嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-14316嗜热脂肪地衣芽孢杆菌 NRRL B-14318解淀粉芽孢杆菌 CGMCC1.1099地衣芽孢杆菌 ATCC33632巨大芽孢杆菌NRRL B-14308巨大芽孢杆菌CGMCC 1.223蜡状芽孢杆菌 NRRL B-3711嗜碱芽孢杆菌ATCC BAA-125蜡状芽孢杆菌 CICC10040地衣芽孢杆菌 ATCC 14580巨大芽孢杆菌 ATCC12872芽孢杆菌 NRRL B-11291紫红红球菌 NICMB 11216紫红红球菌DSM11097紫红红球菌DSM44541赤红红球菌 CGMCC4.1187红串红球菌 CGMCC 1.2362红串红球菌 DSM 43297紫红红球菌 CGMCC 1.2348紫红红球菌 DSM6263紫红红球菌 DSM46022紫红红球菌 DSM363紫红红球菌DSM43002嗜吡啶红球菌JCM10940恶臭假单胞菌 NRRL-18668荧光假单胞菌 DSM7155荧光假单胞菌CGMCC 1.758洋葱假单胞菌（自己分离）绿叶假单胞菌 CICC10216洋葱假单胞菌（自己分离）野油菜黄单胞菌 DSM3586丁香假单胞菌 ATCC BAA-978粪产碱杆菌CGMCC1.767粪产碱杆菌ATCC8750反硝化产碱杆菌N4谷氨酸棒杆菌ATCC13032金黄节杆菌ATCC BAA-1386藤黄节杆菌 CGMCC1.1525柠檬黄节杆菌CGMCC1.1893植物乳杆菌 NCIMB8826鲍曼不动杆菌 CICC22934鲍曼不动杆菌CICC22934醋酸钙不动杆菌NCIMB9871糖多孢菌 NRRL 2338四联球菌 NRRL B-108肺炎链球菌ATCC 49619肺炎克雷伯氏菌（自己分离）敏捷食酸菌72w睾丸酮丛毛单胞菌 ATCC55746运动发酵单胞菌 ZM4嗜水气单胞菌2（自己分离）嗜水气单胞菌1（自己分离）睾丸酮丛毛单胞菌 ACCC10192睾丸酮丛毛单胞菌 ATCC 55744聚团斯塔普氏菌JCM 20685耐辐射甲烷菌JCM2831四联球菌NRRL B-108金黄色葡萄球菌 ATCC 6538金黄色葡萄球菌ATCC29213臭鼻克雷氏菌CGMCC1.1734哈维氏弧菌ATCC33842河流弧菌CGMCC1.1608副溶血弧菌（自己分离）嗜热假诺卡氏菌CGMCC10280沉积物希瓦氏菌 DSM17055脆壁希瓦氏菌 NCIMB 400农杆菌 NRRL B-11291铅青链霉菌阿维链霉菌 NRRL 8165茎瘤固氮根瘤菌 DSM 5975放射根瘤菌ATCC 33970粪肠球菌ATCC29212粪肠球菌 ATCC 7080洋葱伯克霍尔德菌ACCC 10506根瘤菌ATCC BAA-1182结核分枝杆菌 JCM13017 Prosthecochloris vibrioformis DSM263 Oceanicola granulosus ATCC863质控标准菌株人伤寒沙门菌(自己分离）猪伤寒沙门菌（自己分离）大肠杆菌ETEC大肠杆菌EIEC大肠杆菌EHEC大肠杆菌EPEC苏云金芽孢杆菌ATCC10792枸橼酸杆菌CMCC48001小肠耶尔森菌ATCC23715黄色微球菌ATCC58166宋内志贺ATCC9290阴沟肠杆菌ATCC45031溶藻胶弧菌ATCC17749枯草芽孢杆菌ATCC63501白色葡萄球菌8032鲍曼不动杆菌ATCC19606肺炎克雷伯氏菌ATCC13883甲型副伤寒ATCC9250拟志弧菌ATCC33847河弧菌NCTC11218大肠杆菌ATCC25922创伤弧菌ATCC27526铜绿假单胞菌ATCC27853金黄色葡萄球菌ATCC25923鼠伤寒杆菌ATCC14028单增李斯特菌CMCC54002变形杆菌CMCC49027白色念珠菌ATCC10231副溶血弧菌ATCC17082福氏志贺菌ATCC12022鲍氏志贺菌ATCC9207蜡样芽孢杆菌ATCC11778阪琦肠杆菌ATCC51329表皮葡萄球菌ATCC12228粪链球菌CMCC3200马红球菌ATCC6939大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达宿主菌大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌报告基因质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌克隆质粒分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣大肠杆菌克隆质粒大肠杆菌表达质粒大肠杆菌表达质粒哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统哺乳动物双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母双杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母单杂交系统酿酒酵母三杂交系统酿酒酵母三杂交系统酿酒酵母三杂交系统蜕皮激素诱导表达系统蜕皮激素诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统LacSwith II哺乳动物诱导表达系统GeneSwith 哺乳动物诱导系统GeneSwith 哺乳动物诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统四环素诱导系统Tale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kitTale ToolBox kit Tale ToolBox kit CAS9系统CAS9系统CAS9系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统腺相关病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统逆病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统慢病毒系统PiggyBac转座子系统PiggyBac转座子系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统信号通路报告系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统RNAi系统酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒酿酒酵母表达质粒。

pBI221-­‐GFP编号 载体名称北京华越洋生物VECT0320 pBI221-­‐GFPpBI221-­‐GFP载体基本信息出品公司: -­‐-­‐载体名称: pBI221-­‐GFP质粒类型: 植物双元表达载体高拷贝/低拷贝: -­‐-­‐启动子: -­‐-­‐克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: -­‐-­‐5' 测序引物及序列: -­‐-­‐3' 测序引物及序列: -­‐-­‐载体标签: GFP载体抗性: -­‐-­‐筛选标记: -­‐-­‐备注: -­‐-­‐产品目录号: -­‐-­‐稳定性: -­‐-­‐组成型: -­‐-­‐病毒/非病毒: -­‐-­‐载体质粒图谱和多克隆位点信息其他植物载体质粒：pBI101 pDF15pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221-­‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301 pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen pCambia1300GFP pGreen 0029 pCambia1301 pGreen0029 pCambia1302 pGreen029 pCambia1303 pGreenII pCambia1304 pGreenII 0049 pCambia1305.1 pGreenII 0179 pCambia1305.2 pGreenII 0229 pCambia1380 pGreenII 0579 pCambia1381 pHANNIBAL pCambia1381Xa pHELLSGATE pCambia1381Xb pHELLSGATE 12 pCambia1381Xc pHELLSGATE 4 pCambia1381Z pHELLSGATE 8 pCambia1390 pKANNIBAL pCambia1391 pPZP100 pCambia1391Xa pPZP101 pCambia1391Xb pPZP102 pCambia1391Xc pPZP111 pCambia1391Z pPZP112 pCambia2200 pPZP121 pCambia2201 pPZP122 pCambia2300 pPZP200 pCambia2301 pPZP201 pCambia2301-­‐101 pPZP202 pCambia3200 pPZP211 pCambia3201 pPZP212 pCambia3300 pPZP221 pCambia3301 pPZP222 pCambia35s-­‐ECFP pPZp-­‐RCS2-­‐Bar pCambia35s-­‐EGFP pRI 101-­‐AN pCambia35s-­‐EYFP pRI 101-­‐ONpCambia5105 pRI 201-­‐AN pSB1 pRI 201-­‐ON pSB11 pRI 909 pSoup pRI 910 pSPYCE(MR) pRI101pTCK303 pSAT1-­‐cCFP-­‐C Super1300 pSAT1-­‐cCFP-­‐N pSAT6nCeruleanC(A+) pSAT4-­‐nVenus-­‐C。

基金项目:郑州工程技术学院高层次人才科研项目;河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(编号:２２２１０２１１０３１３)作者简介:李镁娟,女,河南国德标检测技术有限公司高级工程师,硕士.通信作者:张军(１９７８ ),男,郑州工程技术学院副教授,博士.E Ｇm a i l :j u n z h a n g＠＠z z u t ．e d u ．c n 收稿日期:２０２４Ｇ０１Ｇ０３㊀㊀改回日期:２０２４Ｇ０３Ｇ１１D O I :１０．１３６５２/j ．s p j x ．１００３．５７８８．２０２４．６０００９[文章编号]１００３Ｇ５７８８(２０２４)０３Ｇ００４４Ｇ０８网络药理学结合分子对接技术揭示芹菜籽抑制痛风的潜在分子机制P o t e n t i a lm o l e c u l a rm e c h a n i s mo f c e l e r y se e d i n g o u t t r e a t m e n t of n e t w o r k p h a r m a c o l og y w i t hm o l e c u l a r d o c k i n g李镁娟１L IM e i ju a n １㊀张㊀军２Z HA N GJ u n ２㊀张云数２Z HA N GY u n s h u ２㊀李乾伟２L IQ i a n w e i ２张㊀娜２Z HA N G N a ２㊀刘梦娇２L I U M e n g j i a o ２㊀张人平２Z HA N GR e n p i n g２(１．河南国德标检测技术有限公司,河南郑州㊀４５１１００;２．郑州工程技术学院化学与食品工程学院,河南郑州㊀４５００４４)(１．H e n a nG u o d eS t a n d a r dT e s t i n g T e c h n o l o g y C o ．,L t d ．,Z h e n g z h o u ,H e n a n ４５１１００,C h i n a ;２．C o l l e g e o fC h e m i c a l a n dF o o dE n g i n e e r i n g ,Z h e n g z h o uU n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y ,Z h e n g z h o u ,H e n a n ４５００４４,C h i n a )摘要:目的:运用网络药理学和分子对接研究芹菜籽抑制或治疗痛风的分子机制.方法:利用T C M S P 数据库等在线靶点筛选平台收集芹菜籽主要成分潜在靶点,并利用C y t o s c a p e ３．９．０软件构建芹菜籽化合物 靶点网络图.在G e n e C a r d 数据库㊁OM I M 数据库收集痛风相关靶点,与芹菜籽主要成分靶点取交集并导入S T R I N G 数据库进行蛋白质 蛋白质相互作用(p r o t e i n Ｇp r o t e i n i n t e r a c t i o n ,P P I )分析,得到核心作用靶点,将核心靶点导入D A V I D数据库进行G O 功能富集及K E G G 通路富集.最后,应用A u t o D o c k 软件对芹菜籽关键成分与痛风靶点蛋白进行分子对接验证.结果:通过数据库收集到芹菜籽主要成分１６个,对应２０２个活性成分靶点,经过韦恩图取与痛风交集靶点６９个,经过拓扑分析表明,芹菜籽通过槲皮素㊁芹菜素㊁木犀草素㊁柯伊利素㊁芹菜甲素５种核心成分与１０个痛风关键靶点T N F ㊁M A P K １４㊁I L ４㊁C X C L ８㊁L Y N ㊁P D G F R β㊁H C K ㊁V E G F A ㊁I T G A ㊁I L ２密切关联发挥抑制或治疗痛风的作用.G O 及K E G G 分析结果显示,芹菜籽核心成分通过调控细胞凋亡过程㊁增殖㊁迁移等生物过程,通过P I ３K ＧA k t 信号通路㊁I L Ｇ１７信号通路㊁MA P K 信号通路㊁N F ＧκB 信号通路等多条通路发挥作用.分子对接结果表明,５种核心成分与１０个痛风疾病靶点蛋白对接结合紧密,可信度高,验证了网络药理学预测结果的准确性.结论:芹菜籽通过调控多靶点㊁多途径抑制或治疗痛风的作用.关键词:芹菜籽;痛风;网络药理学;分子对接;代谢性疾病;药食同源A b s t r a c t :O b je c t i v e :T o s t u d y t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mof c e l e r y s e e d i n h i b i t i ng o r t r e a t i n gg o u tb y u s i n g n e t w o r k ph a r m a c o l o g y a n d m o l e c u l a r d o c ki n g ．M e t h o d s :T C M S P d a t a b a s e a n d t h e n e t w o r k m a p s w e r ec o n s t r u c t e d w i t h C y t o s c a p e ３．９．０s o f t w a r e ．G o u t Ｇr e l a t e dt a r ge t s w e r ec o l l e c t e di n G e n e C a r d d a t a b a s ea n d OM I M d a t a b a s e ,c r o s s e d w i t ht h e m a i nc o m p o n e n tt a r ge t sof c e l e r y s e e d a n di m p o r t e di n t o S T R I N G d a t a b a s ef o r p r o t e i n Ｇp r o t e i n i n t e r a c t i o n (p r o t e i n Ｇp r o t e i ni n t e r a c t i o n ,P P I )a n a l ys i s ,c o r et a r g e t s w e r eo b t a i n e d ,c o r et a r g e t s w e r ei n t r o d u c e di n t o D A V I D ,a n d G O f u n c t i o n e n r i c h m e n t a n d K E G G p a t h w a ye n r i c h m e n tw e r e p e rf o r m e di nt h ed a t a b a s e ．F i n a l l y ,A u t o D o c k s o f t w a r ew a s u s e d t o v e r i f y t h e k e y c o m p o n e n t sw i t hk e y t a r ge t s ．R e s u l t s :T h e r e w e r e１６m a i nc o m p o n e n t so fc e l e r y s e e d s ,６９c o mm o n t a r g e t s ．Af t e r t o p o l og i c a l a n a l y s i s ,q u e r c e t i n ,a p i ge n i n ,l u t e o l i n ,c e l e r y ,f i v e c o r e c o m p o n e n t s a n d １０k e y t a rg e t s o f go u t T N F ,MA P K １４,I L ４,C X C L ８,L Y N ,P D G F R β,H CK ,V E G F A ,I T G A ,I L ２,w e r ec l o s e l y i n v o l v e di ni n h i b i t i n g or t r e a t i n gg o u t ．T h e r e s u l t s o fG Oa n dK E G Ga n a l y s i s s h o w e d t h a t t h ec o r e c o m p o n e n t s o fc e l e r y s e e d a c t e d t h r o u g h r e g u l a t i n g４４F O O D &MA C H I N E R Y 第４０卷第３期总第２６９期|２０２４年３月|b i o l o g ic a l p r o c e s s e s s u c h a s a p o p t o s i s,p r o l i f e r a t i o n a nd m i g r a t i o n,a n d t h r o u g h P I３KＧA k t s i g n a l i n g p a t h w a y,I LＧ１７s i g n a l i n g p a t h w a y,MA P K s i g n a l i n g p a t h w a y,a n d N FＧκB s i g n a l i n gp a t h w a y．T he m o l e c u l a rd o c k i n g r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ef i v e c o r e c o m p o n e n t sw e r e c l o s e l y b o u n d t o t h e１０k e y t a rg e t p r o t e i n s w i th hi g h c o n f i d e n c e,v e r i f y i n g t h e a c c u r a c y o ft h e n e t w o r k p h a r m a c o l o g yp r e d i c t i o n r e s u l t s．C o n c l u s i o n:T h i s s t u d y r e v e a l s t h e r o l e o f c e l e r y s e e d i n i n h i b i t i n g o r t r e a t i n gg o u t,a n d l a y s af o u n d a t i o nf o rt h ed e v e l o p m e n to fs i n g l eC h i n e s eh e r b a l m e d i c i n ea n dt h es t u d y o f＂m e d i c i n ea n df o o d h o m o l o g y＂t o c o n t r o lm e t a b o l i c d i s e a s e s．K e y w o r d s:c e l e r y s e e d;g o u t;n e t w o r k p h a r m a c o l o g y;m o l e c u l a r d o c k i n g;m e t a b o l i c d i s e a s e s;h o m o l o g y o fm e d i c i n e a n d f o o d近年来,随着物质生活水平的日益提高和生活方式的改变等因素的影响,代谢性疾病已经成为全球亚健康状态的主要原因[１].代谢性疾病是指因生物体自身代谢引起的疾病,包括代谢减少或合成旺盛等,包括糖尿病㊁血糖紊乱症㊁高尿酸症等[２],高尿酸症已成为继高血糖㊁高血压㊁高血脂后的 第四高 [３].高尿酸症可以引起高血压[４]和一系列血管疾病[５],更是痛风形成的直接诱因[６].痛风是人体嘌呤合成代谢增加,尿酸产生过多或排泄不畅而致血中尿酸浓度升高,尿酸盐呈针状结晶沉积在关节滑膜㊁肾脏及其他组织中引起的一种代谢炎性疾病[７].痛风在一般人群中的患病率为１％~４％,男性比女性患病风险多２~６倍,全球痛风发病率仍有增加之势[８].痛风常用药物秋水仙碱㊁别嘌呤醇㊁非布司他等都有一定的副作用而不能长期使用[９].因此,寻找无副作用的药物,或开发新的治疗方法成为解决痛风等代谢性疾病的关键.D o w n e r等[１０]认为,代谢引起的疾病最好用饮食方法来解决,即 食品就是药品 .中国自古就有 药食同源 之说,用食物治疗或减轻疾病是中国中医药最伟大的思想之一[１１－１２].芹菜(A p i u m g r a v e o l e n s L．)是二年或多年生草本类植物,香气浓郁,是深受消费者喜爱的菜蔬之一,自古就有芹菜籽(种子)作为调料食用或中药使用.实践[１３－１５]表明,芹菜籽对抑制痛风的发生,缓解症状有一定效果,但芹菜籽对痛风的抑制机理仍不清晰.随着生物信息学和系统生物学的快速发展,网络药理学方法已被完美地用于寻找关键靶点及其潜在的分子机制[１６].基于 药物 疾病 靶点 相互作用网络的网络药理学,全面㊁系统地评价药物对疾病的干预效果,符合中医学的特点;分子对接是一种重要的计算机辅助药物发现方法,可用于预测药物成分与靶蛋白之间的相互作用,以及药物可能的结合位点[１７],这为药物发现或疾病治疗机理提供了重要思路和方法.研究使用网络药理学预测芹菜籽治疗痛风的潜在机理㊁用分子对接技术验证分子机制,为治疗或预防痛风开发新药提供理论依据.１㊀材料与方法１．１㊀芹菜籽关键成分筛选及靶点基因提取从已有能查到文献[１４－１５,１８－１９]中筛选芹菜籽的成分共计７４种,再使用化源网(h t t p s://w w w．c h e m s r c．c o m)查询其C A S号,使用中药系统药理学分析平台数据库(h t t p s://w w w．t c m s pＧe．c o m,T C M S P)以查找C A S号的方式来查找芹菜籽的关键成分,并且以类药性(D L)ȡ０．１０,口服生物利用度(O B)ȡ２０％为筛选条件,筛选出具有药物性质且人类肠道易于吸收的成分,经由T C M S P数据库筛选得芹菜籽核心活性分子作用靶点;借助U n i P r o t资料库(h t t p://w w w．u n i p r o t．o r g)查询并确立相应靶蛋白归属的规范化基因名,经过去除冗余后,精准锁定芹菜籽主要成分的靶向基因.１．２㊀痛风疾病相关靶点的搜集检索孟德尔人类遗传学数据库(h t t p s://o m i m．o r g/, OM I M)和人类基因数据库(h t t p s://w w w．g e n e c a r d s．o r g,G e n e C a r d s),搜索 g o u t ,删除重复项,获得痛风疾病所有的靶点基因.将芹菜籽的关键成分的靶点基因与痛风疾病的靶点基因导入h t t p s://b i o i n f o g p．c n b．c s i c．e s/t o o l s/v e n n y/网站绘制韦恩图,获得芹菜籽与痛风的交集靶点基因以及数量.１．３㊀芹菜籽活性成分 痛风靶点网络构建及可视化分析通过C y t o s c a p e３．９．０软件收集芹菜籽活性物质与痛风相关基因的数据,构筑了一幅涵盖 分子 疾病靶点复杂网络图.随后,运用该软件的N e t w o r k A n a l y z e r工具,对图中的多个节点进行了精确的拓扑属性评估.特别关注的是节点的中介中心性(B C)㊁紧密中心性(C C)以及度中心性(D C)三项指标.它们的平均值超过特定阈值的节点,即为在芹菜籽对痛风治疗中发挥核心作用的关键活性成分.１．４㊀蛋白互作网络(P P I网络)的构建输入芹菜籽与痛风相关基因的交互数据,转至S t r i n g数据库(h t t p s://w w w．s t r i n gＧd b．o r g),选择 M u l t i p l ep r o t e i n s 作为搜索维度,将种属锁定为 H o m os a p i e n s ,并设定置信度阈值不低于０．９.为清晰可视化,屏蔽掉所有断裂节点,之后将信息以t s v格式导出.并将该文件纳入C y t o s c a p e３．９．０软件中,借助C y t o N C A插件进行深入的网络拓扑分析.通过综合比较６个核心参数 中介中心性㊁紧密中心性㊁度中心性㊁特征向量中心性(E C)㊁局部边连通性(L A C)以及网络中心性(N C)的平均值,从中筛选出具有代表性的网络关键节点,即为核心靶向基因.１．５㊀G O功能和K E G G通路富集分析采用D A V I D６．８数据库(h t t p s://d a v i d．n c i f c r f．g o v/),对芹菜籽潜在治疗痛风靶点进行G O功能分析,以５４|V o l．４０,N o．３李镁娟等:网络药理学结合分子对接技术揭示芹菜籽抑制痛风的潜在分子机制了解靶点的生物学过程,K E G G通路分析研究药物靶点主要信号通路,D A V I D平台列表与背景均设置为 H o m o s a p i e n s ,G O富集分析选择生物过程(b i o l o g i c a l p r o c e s s, B P)㊁分子功能(m o l e c u l a r f u n c t i o n,M F)和细胞组成(c e l l u l a r c o m p o n e n t,C C)３个模块,通路分析选择K E G G.将G O分析的B P㊁C C㊁M F通路分析的数据下载保存好,然后按照P 值从小到大排序,K E G G通路富集分析靶点信号通路,以P＜０．０５为阈值,依据c o u n t值进行排序.再选取前２０条信号通路对B P㊁C C㊁M F和K E G G通路分析的重要通路,使用微生信在线网(h t t p://w w w．b i o i n f o r m a t i c s．c o m．c n/)作带颜色富集条形图进行可视化分析.１．６㊀分子对接过程利用软件C h e m d r a w画出筛选的芹菜籽成分的２D 结构,再使用C h e m３D软件将２D结构转换为３D结构,优化力学结构,使其结构处于稳定状态,从蛋白质数据库(P D B)中提取针对痛风疾病相关的靶蛋白的三维构象文件.通过P y MO L软件的精确操作,排除了水分子及非必要的小分子配体,仅留下纯净的受体蛋白结构并保存为标准的．p d b文件.随后,借助A u t o D o c k１．２．０软件对该蛋白受体进行精细化处理,包括加氢和调整分子的柔韧性.同时,对小分子配体也执行了加氢处理,并精确识别了配体的活性中心.经过一系列的预处理后,将蛋白受体与配体统一转换为．p d b q t格式,并利用G r i d模块仔细设定对接盒子的参数,力求将其体积最小化以精准覆盖蛋白结构,确保空间定位的高效率和精确性.参数设置完毕后,保存配置,并运用A u t o D o c k软件进行配体与受体的分子对接工作,从而计算出结合能(B E)的分值.此过程不仅体现了对分子生物学深刻的理解,也展现了计算化学在药物设计中的实际应用.２㊀结果与分析２．１㊀芹菜籽关键成分的筛选结果芹菜籽主要活性成分为黄酮化合物㊁烯萜类成分等.利用中药系统药理学数据库和分析平台(T C M S P)检索到芹菜籽主要活性成分除洋川芎内酯ＧN㊁洋川芎内酯ＧJ㊁木栓酮㊁佛手苷内酯㊁βＧ芹子烯外均有对应靶点,总计３７５个,删除重复项,相关主要活性成分１６种,对应２０２个活性成分靶点.芹菜籽主要活性成分信息见表１.㊀㊀由于T C M S P筛选有效成分多依据D L和O B,设置较高会使本来有效果的成分无法进行全面分析,因此,将O Bȡ２０％,D Lȡ０．１０[２０],所得有效成分１６种.２．２㊀ 芹菜籽成分 痛风靶点 筛选通过G e n e C a r d s共获得芹菜籽核心成分的靶点基因共２０２个;使用OM I M d a t a b a s e筛选痛风对应的靶点基因,删除重复项后共１７３２个.其中芹菜籽与痛风疾病交集靶点基因合计６９个,见图１.表１㊀芹菜籽的活性成分T a b l e１㊀A c t i v e c o m p o u n d s i n c e l e r y s e e d成分分子编码口服生物利用度/％药物相似性新蛇床内酯MO L００８２５１６２．４６０．０７芹菜甲素MO L００２１８９４７．９００．０７槲皮素MO L００００９８４６．４３０．２８佛手苷内酯MO L００１９４５４２．２１０．１３柠檬烯MO L００００２３３９．８４０．０２洋川芎内酯ＧN MO L００２１０１３７．２７０．１０木犀草素MO L０００００６３６．１６０．２５柯伊利素MO L００３０４４３５．８５０．２７９Ｇ十六碳烯酸甲酯MO L００３７１７３４．６１０．１２６Ｇ十八碳烯酸甲酯MO L０１０４２６３１．９００．１７ɑＧ芹子烯MO L００２１１２３１．８１０．１０洋芫荽苷MO L００２８８１３１．１４０．２７木栓酮MO L０００５０８２９．１６０．７６芹菜素MO L０００００８２３．０６０．２１洋川芎内酯ＧJ MO L００２１４７２１．１４０．１０βＧ芹子烯MO L００１１６７２０．７２０．１０图１㊀芹菜籽药效成分靶点与痛风相关靶点的韦恩图F i g u r e１㊀V e n nm a p o f i n t e r s e c t i o n t a r g e t o fc e l e r y s e e da nd g o u t２．３㊀ 芹菜籽成分 痛风靶点 网络构建及可视化分析利用C y t o s c a p e３．９．０软件建立药物 活性成分 靶点 疾病的可视化网络图,再利用C y t o s c a p e３．９．０软件的A n a l y z eN e t w o r k功能,对交集靶点基因进行评分(０~１分有３８个基因,为一类评分;２~３分有２２个基因,为二类评分;４~８分有９个基因,为三类评分),一类基因在最外层,二类基因放在第二层,三类基因放在最内层.在建立芹菜籽核心成分与痛风疾病的网络图时,发现芹菜籽有５个成分所对应的靶点基因与痛风疾病靶点基因没有联系,即这５个成分对治疗痛风疾病并没有效果,因此在绘制网络图时不纳入.通过评分得到１０种关键成分, 芹菜籽成分 痛风靶点 网络详见图２.成分节点的大小表示与其相关的靶点基因数量多少,蓝色菱形越大表示与之相关联的基因数量越多,在网络中作用也就越明显.使用C y t o s c a p e３．９．０软件的N e t w o r kA n a l y e r插件６４基础研究F U N D AM E N T A LR E S E A R C H总第２６９期|２０２４年３月|菱形代表芹菜籽的关键成分,椭圆形代表 芹菜籽 痛风 交集靶点基因图２㊀ 芹菜籽成分 痛风靶点 网络F i g u r e ２㊀＂C o m p o n e n t o f c e l e r y s e e d Ｇg o u t t a r ge t ＂n e t w o r k 对上述网络中的蓝色药物节点进行拓扑分析得出,芹菜籽核心靶点网络节点平均B C 值为０．２１７５,平均C C 值为０．４５６７,平均D C 值为１３．６.其中只有槲皮素１种成分的B C 值㊁C C 值㊁D C 值均大于芹菜籽核心靶点网络节点平均值(槲皮素B C０．７２３８１４１,C C０．６８５１８５１９,D C６３),推测其可能是芹菜籽治疗痛风的重要成分.２．４㊀P P I 网络结果分析将芹菜籽与痛风的交集基因导入S t r i n g 在线平台对６９个潜在靶点进行P P I 蛋白互作网络分析.如图３所示,网络中包含６９个节点,１１５条边,平均节点度为３．３３,平均局部聚类系数０．４７５.㊀㊀靶点连接的线越多,表明该靶点D C 值越高,越是关键靶点,按照D C 值ȡ１０筛选条件[２１],获得１０个核心靶点基因,分别为丝裂原活化蛋白激酶１４(M A P K １４)㊁肿瘤坏死因子(T N F )㊁血管内皮生长因子A (V E G F A )㊁血小板衍生的生长因子受体β(P D G F R β)㊁酪氨酸蛋白激酶(L Y N )㊁白细胞介素Ｇ４(I L ４)㊁酪氨酸蛋白激酶H C K (H C K )㊁白细胞介素Ｇ８(C X C L ８)㊁整合素αV (I T G A V )㊁白细胞介素Ｇ２(I L ２),以上１０种靶点基因拓扑参数B C ㊁C C ㊁D C ㊁E C ㊁L A C ㊁N C 皆大于各自均值１２１．０３３０２,０．１４８６９,７．３９２８６,０．０８５０２,２．２１６１９,３．１２２０７,详见表２.㊀㊀通过建立芹菜籽成分 痛风基因靶点网络,发现１０个药物成分中,有５个成分与核心基因靶点密切相关,推测这５个药物成分是治疗痛风疾病的关键成分,即核心成分:槲皮素㊁芹菜素㊁木犀草素㊁柯伊利素㊁芹菜甲素,在网络中D C 值分别是６３,２８,２５,７,５,详细情况见图４.２．５㊀分子对接验证分析将２．４得到的５个核心成分为配体与痛风关键基因T N F ㊁M A P K １４㊁I L ４㊁C X C L ８㊁L Y N ㊁P D G F R B ㊁H C K ㊁V E G F A ㊁I T G A ㊁I L ２为受体进行分子对接进行验证.对接R M S D＜０．２n m ,分子对接结合能见表３.如果分子对接结合能＜０k J /m o l 时,表明小分子配体可以与蛋白受图３㊀P P I 网络与关键靶点F i g u r e ３㊀P P I n e t w o r ka n d t h e c o r e t a r ge t ７４|V o l ．４０,N o ．３李镁娟等:网络药理学结合分子对接技术揭示芹菜籽抑制痛风的潜在分子机制表２㊀核心靶点基因拓扑参数T a b l e ２㊀T o p o l o g i c a l p a r a m e t e r s o f c o r e t a r ge t N o ．基因编号中介中心性紧密中心性度中心性特征向量中心性局部边连通性网络中心性１MA P K １４１０３５．０１０４００．１９１４２２４０．３８７１９５．０００００１０．３８２８２２T N F４２０．８７３６００．１７８４６２２０．２７６０５４．７２７２７１１．７８４１３３V E G F A ６５６．５７６０００．１７７９１１８０．１６０５９４．０００００８．４９２０８４P D G F R β３２９．３４１４６０．１７３１３１８０．２１６０８３．５５５５６５．９６１７６５L Y N２６４．４４６７２０．１８１８２１８０．３１８９５６．６６６６７１０．５３１５３６I L ４５９８．５７７４５０．１７９５７１６０．２５５９４６．０００００９．１９３６５７H C K１７８．１８７４２０．１７６８３１６０．２８５０７６．０００００８．１３８５３８C X C L ８２４８．４２５２５０．１８０１２１６０．３０３０１５．５００００６．７５５５６９I T G A V ２５１．０６６８５０．１６４７７１４０．０９９８６２．８５７１４５．５３８４６１０I L ２１４４．３４１４９０．１７７３７１００．１８６３６４．０００００５．１５５５６图４㊀芹菜籽核心成分—痛风关键基因靶点网络F i g u r e ４㊀N e t w o r ko f c o r e c o m p o n e n t s i n c e l e r y s e e d Ｇk e yg e n e t a r ge t sf o rg o u t 表３㊀核心成分与靶点基因蛋白的分子对接结合能T a b l e ３㊀M o l e c u l a r d o c k i n g s c o r e s o f k e y a c t i v e i n g r e d i e n t s a n d t a r ge t s k J /m o l药效成分T N FMA P K １４I L ４C X C L ８L Y NP D G F R BH C K V E G F AI T G A VI L ２平均结合能槲皮素㊀－２９．３－２７．６－２９．７－３０．１－３６．４－２４．３－３７．７－２７．６－３５．６－２３．８－３０．２芹菜素㊀－３２．６－３１．８－３０．１－３１．０－３６．０－２３．８－３７．２－２８．５－３４．７－２３．４－３０．９木犀草素－２７．６－３３．１－２９．３－３２．２－３５．６－２４．７－３６．０－２９．３－３６．８－２５．９－３１．０柯伊利素－３３．９－３８．１－３２．２－３３．５－４０．２－２５．１－３８．９－３１．４－３３．９－３０．５－３３．８芹菜甲素－２３．８－２３．８－２１．８－２５．１－２７．６－２０．１－２８．０－２０．９－２８．０－１８．４－２３．８体结合;结合能＜－１７．７k J /m o l ,表明可以自发地结合;结合能＜－２９．３k J /m o l,说明分子间具有很强的结合活性[２２－２３].结合能越小,说明配体与蛋白之间亲和力越大,两者发生相互作用的可能性越高,进而发挥作用越大[２４].㊀㊀由表３中数据可知,５个核心成分与痛风关键基因平均结合能＜－１７．７k J /m o l ,表明活性成分与核心靶点之间可以自由结合,槲皮素㊁芹菜素㊁木犀草素㊁柯伊利素与关键基因平均结合能＜－２９．３k J /m o l ,表明其与核心靶点之间有强烈的结合力.因此,认为分子对接预测结果真实可靠,P y M o l 软件可以对每个小分子配体与疾病靶点蛋白结合能最低的分子对接结果进行可视化调节,如图５所示.㊀㊀由对接结果可知氢键是促进芹菜籽主要成分和与痛风关键基因活性位点结合的主要作用力.即槲皮素ＧH C K 结合的活性位点A L A Ｇ２９３㊁T H R Ｇ３３８㊁M E T Ｇ３４１形成３个氢键;芹菜素ＧH C K 编码蛋白的活性位点T H R Ｇ３３８㊁M E T Ｇ３４１形成２个氢键;木犀草素ＧI T G A V 的活性位点V A L Ｇ２３㊁V A L Ｇ９８㊁A R G Ｇ９９㊁P H E Ｇ２７８㊁T Y R Ｇ４０６形成５个氢键;柯伊利素ＧL Y N 的活性位点A S P Ｇ１５６㊁I L E Ｇ８６㊁L Y S Ｇ４４㊁M E T Ｇ９１㊁G L U Ｇ８９形成５个氢键;芹菜甲素ＧH C K 的活性位点T H R Ｇ３３８形成１个氢键.从对接结果来看,配体 受体形成氢键越多,复合体系越稳定,对蛋白质的活性控制能力就越强[２５－２６].因此,木犀草素㊁柯８４基础研究F U N D AM E N T A LR E S E A R C H 总第２６９期|２０２４年３月|图５㊀分子对接模式图F i g u r e５㊀M o l e c u l a r d o c k i n g m o d e伊利素对痛风的抑制效果较强.２．６㊀G O功能富集和K E G G信号通路分析将获得的６９个芹菜籽抗痛风的潜在靶点基因导入D A V I D数据库,限定物种为 H o m oS a p i e n s ,以P＜０．０５为筛选条件,进行G O功能富集和K E G G分析[２７],结果如图６所示.G O富集得到４６３个条目,其中B P３４９个,C C３９个,M F７５个.B P主要是细胞凋亡过程的负调控(n e g a t i v e r e g u l a t i o no f a p o p t o t i c p r o c e s s)㊁正向调控细胞增殖(p o s i t i v e r e g u l a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n)㊁细胞迁移的正向调节(p o s i t i v e r e g u l a t i o no f c e l lm i g r a t i o n)等;C C主要是细胞外间隙(e x t r a c e l l u l a r s p a c e)㊁胞外区(e x t r a c e l l u l a rr e g i o n)㊁细胞表面(c e l ls u r f a c e)等;M F主要是酶结合(e n z y m eb i n d i n g)㊁细胞因子活性(c y t o k i n e a c t i v i t y)㊁蛋白质同源二聚活性(p r o t e i nh o m o d i m e r i z a t i o na c t i v i t y)等.㊀㊀K E G G通路富集分析共得到１２２５条目,以P＜０．０５为阈值,依据c o u n t值排序,选取前２０条K E G G信号通路上的基因作为痛风治疗靶基因.由于研究的是芹菜籽抗痛风作用,因此在得到的前２０条通路中去掉与之无关的通路,得到P I３KＧA k t信号通路(P I３KＧA k ts i g n a l i n gp a t h w a y)㊁流体剪切应力和动脉粥样硬化(f l u i d s h e ar图６㊀G O功能富集分析F i g u r e６㊀G Of u n c t i o n a l e n r i c h m e n t a n a l y s i s９４|V o l．４０,N o．３李镁娟等:网络药理学结合分子对接技术揭示芹菜籽抑制痛风的潜在分子机制s t r e s s a n da t h e r o s c l e r o s i s )㊁脂质和动脉粥样硬化(l i p i d a n da t h e r o s c l e r o s i s )㊁MA P K 信号通路(MA P Ks i g n a l i n gp a t h w a y )㊁I L Ｇ１７信号通路(I L Ｇ１７s i g n a l i n gp a t h w a y )等.按照打分排列前１０的通路见表４.表４㊀通过K E G G 通路富集的前１０条通路T a b l e ４㊀T h e t o p １０p a t h w a y sb y K E G G p a t h w a y en r i c h e d 通路名称分值P 值基因名称h s a ０４１５１:P I ３K ＧA k t s i g n a l i n g p a t h w a y２０１．５７E －１１P D G F R B ,F L T ３,I T G A ３,E G F ,I N S R ,P T E N ,G ６P C １,I L ２,P I K ３C G ,I G F １R ,V E G F A ,I L ４,S P P １,K D R ,I T G A V ,R A F １,I L ６R ,T P ５３,M C L １,B C L ２L １h s a ０４０１０:MA P K s i g n a l i n g p a t h w a y１５５．２８E －０８P D G F R B ,F L T ３,E G F ,I N S R ,H S P B １,A R R B ２,MA P K １４,T N F ,I G F １R ,V E G F A ,MA P K ８,R A S A １,K D R ,R A F １,T P ５３h s a ０５４１８:F l u i d s h e a r s t r e s s a n da t h e r o s c l e r o s i s １４４．４２E －１１G S TM １,V C AM １,G S T P １,MMP ２,MA P K １４,T N F ,MMP ９,V E G F A ,TH B D ,MA P K ８,I F N G ,K D R ,I T G A V ,T P ５３h s a ０５４１７:L i pi d a n d a t h e r o s c l e r o s i s １３９．６５E －０８L Y N ,V C AM １,C X C L ８,H S P A ５,MMP １,MMP ３,MA P K １４,T N F ,MMP ９,MA P K ８,C D ４０L G ,T P ５３,B C L ２L １h s a ０４６５７:I L Ｇ１７s i g n a l i n g p a t h w a y１１２．６７E －０９I L ４,MA P K ８,C X C L ８,I F N G ,MMP １,MMP ３,I L １３,MA P K １４,P T G S ２,T N F ,MMP ９h s a ０４５１０:F o c a l a d h e s i o n１１３．６０E －０６P D G F R B ,MA P K ８,I T G A ３,E G F ,P T E N ,S P P １,K D R ,I T G A V ,R A F １,I G F １R ,V E G F A h s a ０４０１４:R a s s i g n a l i n g p a t h w a y１１１．４９E －０５P D G F R B ,MA P K ８,F L T ３,E G F ,R A S A １,I N S R ,K D R ,R A F １,B C L ２L １,I G F １R ,V E G F A h s a ０５１６５:H u m a n p a p i l l o m a v i r u s i n f e c t i o n １１２．５７E －０４P D G F R B ,I T G A ３,E G F ,P T E N ,S P P １,I T G A V ,R A F １,P T G S ２,T N F ,T P ５３,V E G F Ah s a ０５０２２:P a t h w a ys o f n e u r o d e g e n e r a t i o n Ｇm u l t i pl e d i s e a s e s １１４．０９E －０３A P P ,MA P K ８,N O S ２,H S P A ５,R A F １,MA P K １４,P T G S ２,T N F ,S L C ６A ３,B C L ２L １,S O D １h s a ０４６３０:J A K ＧS T A T s i g n a l i n gp a t h w a y１０４．７２E －０６P D G F R B ,I L ４,I F N G ,E G F ,I L １３,R A F １,I L ６R ,I L ２,B C L ２L １,M C L １h s a ０５１６７:K a po s is a r c o m a Ｇa s s o c i a t e d h e r pe s v i r u s i nf e c t i o n１０２．０３E －０５L Y N ,H C K ,MA P K ８,C X C L ８,R A F １,MA P K １４,P T G S ２,T P ５３,P I K ３C G ,V E G F A３㊀结论综上所述,研究应用网络药理学方法预测了芹菜籽药效成分及作用靶点,其中抑制或治疗痛风关键成分为槲皮素㊁芹菜素㊁木犀草素㊁柯伊利素和芹菜甲素,与痛风相关的靶点T N F ㊁M A P K １４㊁I L ４㊁C X C L ８㊁L Y N ㊁P D G F R β㊁H C K ㊁V E G F A ㊁I T G A ㊁I L ２密切相关.使用分子对接技术将芹菜籽活性成分与关键靶点进行结合能力预测,发现槲皮素㊁芹菜素㊁木犀草素㊁柯伊利素㊁芹菜甲素与１０种蛋白均具有良好的结合活性,结合能均小于－２０．９７k J /m o l ,验证了芹菜籽中多种有效成分通过作用于关键靶点起到防治痛风的作用,其中柯伊利素与１０种关键靶点蛋白结合能最低,为－３３．７６k J /m o l ,表明具有强烈的结合活性.G O 功能富集分析表明芹菜籽具有调控细胞凋亡,影响炎症反应的作用.K E G G 富集分析发现,芹菜籽活性成分与痛风靶标之间相互作用的主要信号通路可能是P I ３K ＧA k t 信号通路㊁I L Ｇ１７信号通路㊁MA P K 信号通路㊁N F ＧκB 信号通路等,表明芹菜籽通过多条通路作用于痛风的调控过程.参考文献[1]WHO.World Health Statistics 2022[EB/OL].(2022Ｇ02Ｇ10)[2023Ｇ12Ｇ21].https://www.who.int/data/gho/publications/world Ｇhealth Ｇstatistics.[2]LAKE B D.Metabolic disorders:A simplified approach to their diagnosis [M ]//Paediatric Pathology.London:Springer ＧVerlag London Limited,1996:839.[3]KUO C F,GRAINGE M J,ZHANG W,et al.Global epidemiology of gout:Prevalence,incidence and risk factors [J ].Nat Rev Rheumatol,2015,11(11):649Ｇ662.０５基础研究F U N D AM E N T A LR E S E A R C H 总第２６９期|２０２４年３月|[4]FEIG D I.Hyperuricemia and hypertension[J].Advances in Chronic Kidney Disease,2012,19(6):377Ｇ385.[5]JIN M,YANG F,YANG I,et al.Uric acid,hyperuricemia andvascular diseases[J].Frontiers in bioscience(Landmark edition), 2012,17(2):656Ｇ669.[6]WORTMANN R L.Gout and 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农杆菌感染植物的原理
农杆根瘤菌之所以会感染 植物根部是因为植物根部 损伤部位分泌出酚类物质 乙酰丁香酮和羟基乙酰丁 香酮，这些酚类物质可以 诱导Vir（Virulence region) 基因的启动表达，Vir基因 的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根 瘤染色体上的操纵子基因 产物则与单链T－DNA结合， 形成复合物，转化植物根 部细胞。
Ti质粒的结构 质粒的结构
1. T-DNA——transferred-DNA regions:是农杆菌浸染植物细胞 时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称 之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 2. Vir区—virulence region：该区段的基因能够激活T-DNA转移， 使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区和Vir区在 质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒的三分之一。 3. Con区——regions encoding conjugations：该区段上存在着 与细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌 之间的转移。冠瘿瘤碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因 此称之为结合转移编码区。 4. Ori区——origin of replication：该区段基因调控Ti质粒的自 我复制，故称之为复制起始区。
Ti质粒的结构 质粒的结构
Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在 Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA的组成结构 的组成结构
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反 复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）生长素 tmr由一个基因组成iptz：分裂素 tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物（opines），即冠瘿碱。 opines有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 章鱼碱 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 胭脂碱 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 农杆碱 据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能 利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根 癌农杆菌使用作为氮源及碳源。

pFGC5941 pUC-SPYNE pA7-CFP pUC-35S-mCherry CaMV35S-sGFP pLXSN pGreenII 0800-Luc pER8 pCAMBIA3301 pCAMBIA3300 pCAMBIA2301 pCAMBIA2300 pCAMBIA2200 pCAMBIA1381 pCAMBIA1380 pCAMBIA1304 pCAMBIA1303 PCAMBIA1302 pCAMBIA1301 pCAMBIA1300s pCAMBIA1300 pCAMBIA1200 pCAMBIA0380 pBI121-DsRed2 pBI221-EGFP pBI221 pBI121-mCherry pBI121-EGFP pBI121 pROKII
pCAMBIA1301-35SN 载体简介： This vector contains a fully functional gusA reporter construct for simple and sensitive analysis of gene function or presence in regenerated plants by GUS assay. The construct uses E.coli gusA with an intron (from the castor bean catalase gene) inside the coding sequence to ensure that expression of glucuronidase activity is derived from eukaryotic cells, not from expression by residual A.tumefaciens cells. This vector is suitable for insertion of other genes of interest containing their own promoter and terminator. Researchers can excise the gusA gene and insert their own gene of interest in its place or use these vectors to create fusions of gusA with their gene of interest. These vectors contain the pUC18 polylinker-lacZa. pCAMBIA1301-35SN 载体其他相关的植物过表达载体： pGreenII 62-SK pCAMBIA1301-35SN pSoup+p19 pUC-SPYCE