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hplc梯度洗脱流动相配制最科学HPLC（高效液相色谱法）是一种在化学分析中广泛应用的方法，可以用于分离、检测和测定复杂混合物中的不同化合物。
梯度洗脱是HPLC分析中常用的一种技术，它可以通过调整流动相的组成，从而实现对样品中不同化合物的分离效果的优化。
本文将讨论HPLC梯度洗脱流动相配制的科学性，并介绍一些常用的方法和技巧。
首先，我们来了解一下HPLC的基本原理。
HPLC是一种液相色谱法，它通过将样品注入固定相（通常是填充在柱子中的吸附剂）中，然后通过流动相的作用，让样品中的化合物在固定相上发生分离。
流动相可以是各种溶剂，其组成和浓度的选择直接影响到分离的效果。
梯度洗脱是一种在HPLC中常用的方法，适用于分离复杂的混合物。
传统的等浓度洗脱方法通常需要较长的分析时间，而且在一些情况下可能无法实现有效的分离。
梯度洗脱通过在分析过程中改变流动相的组成，从而使得样品中的不同化合物在不同时间点出现在柱子上，并得到更好的分离效果。
在进行梯度洗脱实验之前，首先需要确定合适的流动相组成和浓度梯度。
一般来说，梯度洗脱的目的是在保证分离效果的同时尽量缩短分析时间。
因此，我们需要根据样品的特性和分离目标来选择合适的溶剂和浓度梯度。
首先，确定合适的溶剂组成是非常重要的。
一般来说，流动相中的溶剂可以选择有机溶剂和水。
有机溶剂常用的包括甲醇、乙腈和丙酮等，它们具有一定的极性，可以用来分离许多不同极性化合物。
水则是一种无机溶剂，具有较高的极性，用于分离一些极性较强的化合物。
选择合适的溶剂组成需要考虑样品的特性和目标化合物的亲疏水性，以及柱子的选择，确保溶剂组成不会对柱子和检测器产生不良影响。
其次，浓度梯度的选择也是至关重要的。
浓度梯度可以通过改变两种溶剂的比例或者改变其中一种溶剂的浓度来实现。
一般来说，浓度梯度应尽量选择平稳的曲线，避免出现突变，以确保分离效果的稳定性。
此外，还需要考虑柱子的选择和运行参数的调整，以确保浓度梯度的实际效果符合预期。
一、梯度洗脱（gradient elution）又称为梯度淋洗或程序洗脱。
在气相色谱中，为了改善对宽沸程样品的分离和缩短分析周期，广泛采用程序升温的方法。
而在液相色谱中对组分复杂的样品则采用梯度洗脱的方法。
在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。
从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
梯度洗脱的优点：1.缩短分析周期；2.提高分离能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加灵敏度。
但有时引起基线漂移。
梯度洗脱的原理：◎流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。
◎具体地讲，当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因分配系数(k值)较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。
一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到t C1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，t C1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。
B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于t C2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。
二、程序升温程序升温色谱法，是指色谱柱的温度按照组分沸程设置的程序连续地随时间线性或非线性逐渐升高，使柱温与组分的沸点相互对应，以使低沸点组分和高沸点组分在色谱柱中都有适宜的保留、色谱峰分布均匀且峰形对称。
各组分的保留值可用色谱峰最高处的相应温度即保留温度表示。
主要优点：程序升温具有改进分离、使峰变窄、检测限下降及省时等优点。
hplc梯度洗脱级乙腈HPLC梯度洗脱级乙腈HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物和制药领域。
梯度洗脱是HPLC中常用的一种方法，其中乙腈是一种常用的洗脱溶剂。
本文将介绍HPLC梯度洗脱级乙腈的原理、操作步骤和相关注意事项。
一、原理HPLC梯度洗脱是通过在分析柱中不断改变流动相的组成来实现样品分离的方法。
而乙腈作为洗脱溶剂，具有良好的溶解性和流动性，可用于洗脱各种类型的化合物。
梯度洗脱中的乙腈浓度变化可以根据需要进行调整，从而实现不同化合物的分离。
二、操作步骤1. 准备工作：首先，需要准备好HPLC仪器和相关耗材，包括分析柱、进样器、流量计等。
确保仪器处于良好的工作状态。
2. 选择合适的梯度程序：根据样品的特性和分离目标，选择适当的梯度程序。
梯度程序可以通过改变乙腈浓度和流速来实现。
3. 样品预处理：将待分析的样品进行预处理，如溶解、过滤等。
确保样品的纯度和稳定性。
4. 设置仪器条件：根据所选梯度程序，设置HPLC仪器的条件，包括流速、柱温、检测波长等。
确保仪器参数的准确性和稳定性。
5. 开始洗脱：将样品注入进样器，启动HPLC仪器，开始洗脱。
根据设定的梯度程序，乙腈浓度和流速会随着时间的推移发生变化。
6. 监测和记录：在洗脱过程中，通过检测器对洗脱液进行监测，并记录相关数据。
可以根据峰的形状、峰面积等参数来评估分离效果。
7. 分析结果：根据检测到的峰的信息，进行数据处理和分析。
可以通过峰高、保留时间等参数来定量分析样品中的目标成分。
8. 仪器维护：在使用完毕后，及时对HPLC仪器进行清洗和维护，保证仪器的正常运行和使用寿命。
三、注意事项1. 选择合适的分析柱和检测器，以确保分离效果和分析灵敏度。
2. 注意乙腈的纯度和质量，避免对分析结果产生影响。
3. 注意梯度程序的设置，避免溶剂浓度和流速的突变，导致分离效果不理想。
4. 注意样品预处理的方法和条件，以确保样品的稳定性和分析结果的准确性。
液相色谱梯度洗脱摘要：I.液相色谱简介A.液相色谱的定义B.液相色谱的原理II.梯度洗脱的原理A.梯度洗脱的定义B.梯度洗脱的作用C.梯度洗脱的应用III.液相色谱梯度洗脱方法A.方法原理B.实验操作C.结果分析IV.梯度洗脱的注意事项A.溶剂的互溶性B.溶剂的纯度要求C.系统压力的变化D.鬼峰的产生E.梯度选择V.总结A.液相色谱梯度洗脱的优势B.液相色谱梯度洗脱的应用前景正文：液相色谱是一种常见的分离和分析技术，通过样品在液相色谱柱中的分配系数的不同，达到分离的目的。
而梯度洗脱是液相色谱中一种常用的技术，可以进一步提高液相色谱的分离效果。
梯度洗脱是指在色谱柱中，流动相的组成逐渐变化，从而使得样品中各组分在色谱柱中的运行速度不同，最终达到分离的目的。
梯度洗脱的作用主要在于可以提高液相色谱的分离度，缩短分析时间，降低最小检测量，提高分离精度。
液相色谱梯度洗脱方法主要分为高压梯度和低压梯度两种。
高压梯度是通过两台高压输液泵将两种溶剂输入，而低压梯度则是在常压下将两种溶剂混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。
在实验操作过程中，需要注意溶剂的互溶性、纯度要求、系统压力的变化、鬼峰的产生以及梯度的选择等问题。
液相色谱梯度洗脱的应用非常广泛，主要应用于药物分析、生物制品分析、食品安全分析等领域。
在药物分析中，梯度洗脱可以用于药物的杂质分析、药物代谢产物分析等；在生物制品分析中，可以用于蛋白质的分离和纯化；在食品安全分析中，可以用于农药残留分析、重金属离子分析等。
总的来说，液相色谱梯度洗脱是一种高效的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
液相色谱梯度洗脱原理嘿，咱今儿来聊聊液相色谱梯度洗脱原理哈！这玩意儿啊，就好比是一场奇妙的旅程。
你看啊，在液相色谱这个大舞台上，各种成分就像是一群演员，它们要依次登场表演呢。
而梯度洗脱呢，就是那个厉害的导演，指挥着这一切。
想象一下，柱子就像是一条长长的跑道，不同的成分在上面奔跑。
一开始呢，用一种洗脱液，就好像给跑道铺了一层特定的地面。
有些成分跑得快，有些跑得慢。
但如果一直用这一种洗脱液，可能有些成分就不太容易被区分出来啦。
这时候梯度洗脱就发挥大作用啦！它会慢慢改变洗脱液的组成，就像是跑道的地面在慢慢变化。
一会儿变得更光滑，一会儿又变得有点阻力。
这样一来，那些原本跑得差不多快的成分，就会因为跑道条件的改变而拉开差距，更容易被我们看清楚它们的真面目啦。
比如说吧，有个成分刚开始不太显眼，但是随着洗脱液的变化，它突然就变得突出了，就好像原本在人群中不太起眼的一个人，突然换了一身特别的衣服，一下子就吸引了大家的目光。
而且啊，这个过程可不是随便乱来的。
就像导演安排剧情一样，要恰到好处，不能太急也不能太慢。
洗脱液的变化要有节奏，要有条理，这样才能让这场表演精彩绝伦。
要是洗脱液变化得乱七八糟，那可就糟糕啦，成分们就会被搞得晕头转向，我们也看不清它们到底是谁啦。
所以说啊，这梯度洗脱真的是个技术活呢！它能让我们更清楚地看到那些复杂混合物中的各种成分，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，让我们找到我们想要的东西。
你说这神奇不神奇？咱搞科研、做分析的，可真得好好感谢这个神奇的梯度洗脱原理呢！它让我们的工作变得更加有趣，也更加有意义。
反正我是觉得这玩意儿太厉害啦，你们觉得呢？。
第六章梯度洗脱1，引言2，梯度洗脱的应用3，梯度洗脱的原理4，建立梯度分离5，实验问题6，梯度洗脱方法建立的总结1，引言等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变，而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的。
梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。
其中线性梯度最为常用。
2，梯度洗脱的应用常规的梯度洗脱分离适合于下列样品：（1）具有较宽k值范围的样品（2）大分子样品（3）样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。
（4）溶于弱溶剂的样品称溶液即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC 方法建立的最佳起点。
2.1 梯度洗脱用于常规分析（1）样品的保留值范围选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。
前面谱峰需用较弱流动相，而后面谱峰需用较强流动相。
采用梯度洗脱的另一个原因是，在等度洗脱条件下，k＞20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。
（2）大分子样品组分大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。
这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。
（3）晚流出组分有些样品采用等度洗脱可很好地分离，但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。
（4）增强检测灵敏度梯度洗脱可增强检测，与相应的等度洗脱分离比较，样品峰变窄约两倍（且峰高增大2倍）。
（5）稀样品溶液对于溶解于弱溶剂中稀样品，梯度洗脱可以采用在体积进样，而不会引起峰展宽。
（6）梯度洗脱的替代方法有时，即使样品保留值范围超出0.5＜k＜20，仍是采用等度洗脱较好。
用极性较强的反相柱（如氰基柱）通常可以缩小保留值范围。
极性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用，而非极性组分与其作用较弱。
对于某些样品，通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。
2.2 梯度洗脱用方法建立当对组成未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处：A，初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。
第六章梯度洗脱1，引言2，梯度洗脱的应用3，梯度洗脱的原理4，建立梯度分离5，实验问题6，梯度洗脱方法建立的总结1，引言等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变，而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的。
梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。
其中线性梯度最为常用。
2，梯度洗脱的应用常规的梯度洗脱分离适合于下列样品：（1）具有较宽k值范围的样品（2）大分子样品（3）样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。
（4）溶于弱溶剂的样品称溶液即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC 方法建立的最佳起点。
2.1 梯度洗脱用于常规分析（1）样品的保留值范围选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。
前面谱峰需用较弱流动相，而后面谱峰需用较强流动相。
采用梯度洗脱的另一个原因是，在等度洗脱条件下，k＞20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。
（2）大分子样品组分大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。
这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。
（3）晚流出组分有些样品采用等度洗脱可很好地分离，但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。
（4）增强检测灵敏度梯度洗脱可增强检测，与相应的等度洗脱分离比较，样品峰变窄约两倍（且峰高增大2倍）。
（5）稀样品溶液对于溶解于弱溶剂中稀样品，梯度洗脱可以采用在体积进样，而不会引起峰展宽。
（6）梯度洗脱的替代方法有时，即使样品保留值范围超出0.5＜k＜20，仍是采用等度洗脱较好。
用极性较强的反相柱（如氰基柱）通常可以缩小保留值范围。
极性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用，而非极性组分与其作用较弱。
对于某些样品，通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。
2.2 梯度洗脱用方法建立当对组成未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处：A，初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。
c18色谱柱梯度洗脱C18色谱柱是一种广泛使用的反相色谱柱，常用于分离和纯化有机化合物。
梯度洗脱是一种常见的色谱洗脱方法，它通过改变溶剂组成的梯度来实现化合物的分离和提纯。
下面将详细介绍C18色谱柱梯度洗脱的原理、步骤和优缺点。
C18色谱柱是由具有C18烷基链的硅胶或其他固定相填充的柱子。
C18固定相具有较强的疏水性，可以与非极性、弱极性和具有疏水性功能团的化合物发生相互作用。
在梯度洗脱中，我们通常使用两种或更多溶剂来实现化合物的分离。
这些溶剂通常是水和有机溶剂（如甲醇、乙醇等）的混合物。
梯度洗脱的原理是通过改变这些溶剂的比例来调控毛细管壁上的相互作用力，以达到分离化合物的目的。
梯度洗脱的步骤通常包括预平衡、样品加载、梯度开始、梯度结束和再平衡等阶段。
首先，需要进行预平衡，将色谱柱与洗脱溶剂（通常是纯水）平衡一段时间，以保证柱子内的固定相处于最佳状态。
然后，将待分离的样品通过注射器加载到色谱柱中。
在梯度开始阶段，初始时使用高极性溶剂，如纯水，以保证样品分离出基线。
随着时间的推移，梯度溶剂中有机成分的比例逐渐增加，这将导致样品中的化合物离开色谱柱。
在梯度结束阶段，使用高有机溶剂浓度的溶剂，即纯的有机溶剂（如甲醇），来稀释梯度溶剂中的有机成分，以最大程度地将化合物从色谱柱中洗脱。
最后，进行再平衡，将色谱柱与洗脱溶剂再次平衡，以准备下一次实验。
C18色谱柱梯度洗脱的优点包括：1. 分离效果好：C18色谱柱对于非极性化合物的分离效果非常好，可以较好地分离具有相似结构和物化性质的化合物，提高色谱分离的灵敏度和选择性。
2. 操作简便：梯度洗脱相对于等温洗脱更容易实现目标化合物的分离，只需调节溶剂比例即可。
3. 适用范围广：C18色谱柱可以应用于许多领域，如化学、制药、环境、食品等多个领域，对于不同类型的有机化合物都有良好的分离效果。
然而，C18色谱柱梯度洗脱也存在一些缺点：1. 装柱复杂：C18色谱柱的装柱相对较为复杂，需要进行柱床包装和固定相平衡等步骤，需要较多的时间和专业知识。
c18色谱柱梯度洗脱
C18 色谱柱是一种反相色谱柱，通常用于分离非极性或弱极性化合物。
在进行梯度洗脱时，可以按照以下步骤进行操作：
1. 准备流动相：根据待分离化合物的性质，选择合适的流动相。
通常使用乙腈（ACN）和水作为流动相，通过调节两者的比例来实现梯度洗脱。
2. 设置梯度洗脱程序：根据实验需要，设置合适的梯度洗脱程序。
可以使用高效液相色谱仪（HPLC）的控制软件来设置梯度洗脱程序，包括起始流动相比例、梯度时间、最终流动相比例等参数。
3. 平衡色谱柱：在开始实验之前，需要使用起始流动相平衡色谱柱，使其达到稳定状态。
通常需要冲洗一段时间，直到色谱柱的基线稳定。
4. 进样：将待分离的样品注入色谱柱中。
注意进样量应适当，避免超过色谱柱的承载能力。
5. 进行梯度洗脱：按照设定的梯度洗脱程序进行实验，观察色谱图的变化。
根据化合物的保留时间和分离效果，调整梯度洗脱程序的参数，以获得最佳的分离效果。
6. 分析结果：根据色谱图的峰值，确定化合物的保留时间和浓度，进行定性和定量分析。
需要注意的是，在使用C18 色谱柱进行梯度洗脱时，应避免使用强酸或强碱流动相，以免损坏色谱柱。
同时，应根据实验需要选择合适的流速和温度，以提高分离效果和色谱柱的寿命。
第六章梯度洗脱1，引言2，梯度洗脱的应用3，梯度洗脱的原理4，建立梯度分离5，实验问题6，梯度洗脱方法建立的总结1，引言等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变，而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的。
梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。
其中线性梯度最为常用。
2，梯度洗脱的应用常规的梯度洗脱分离适合于下列样品：（1）具有较宽k值范围的样品（2）大分子样品（3）样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。
（4）溶于弱溶剂的样品称溶液即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC 方法建立的最佳起点。
2.1 梯度洗脱用于常规分析（1）样品的保留值范围选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。
前面谱峰需用较弱流动相，而后面谱峰需用较强流动相。
采用梯度洗脱的另一个原因是，在等度洗脱条件下，k＞20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。
（2）大分子样品组分大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。
这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。
（3）晚流出组分有些样品采用等度洗脱可很好地分离，但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。
（4）增强检测灵敏度梯度洗脱可增强检测，与相应的等度洗脱分离比较，样品峰变窄约两倍（且峰高增大2倍）。
（5）稀样品溶液对于溶解于弱溶剂中稀样品，梯度洗脱可以采用在体积进样，而不会引起峰展宽。
（6）梯度洗脱的替代方法有时，即使样品保留值范围超出0.5＜k＜20，仍是采用等度洗脱较好。
用极性较强的反相柱（如氰基柱）通常可以缩小保留值范围。
极性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用，而非极性组分与其作用较弱。
对于某些样品，通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。
2.2 梯度洗脱用方法建立当对组成未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处：A，初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。
B，若等度洗脱是较好选择，初始梯度实验可为进一步实验提供最佳%B 的估计值。
若梯度洗脱更合适，则初始实验可为下一步的梯度洗脱估计出开始和终止%B的最佳值。
C，初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快（与等度分离相比），对方法建立极为有利。
D，初始梯度实验遗漏早与晚的低浓度组分的可能性不大。
（1）用等度还是梯度分离？通过谱图中标出的初峰和末峰的保留时间（tRa和tRz）确定。
保留时间差ΔtR=tRz – tRa，则比值ΔtR/tG可以决定等度分离是否可行。
最大允许k值范围为0.5＜k＜20，此时ΔtR/tG应小于0.40，也就是说，该样品保留值范围应小地梯度时间的40%。
（2）估计最佳等度条件如果实验表明采用等度条件较好，则等度实验的最佳%B值可由下表确定。
梯度分离中末峰的保留时间tRz可用于估计最佳%B值，该值在样品的等度分离中可使末峰的k值较理想。
由梯度洗脱中末峰保留时间tRz估计出的等度运行的%B（ACN）值tRz（min）等度运行中末峰k值对应的%B估计值k=5 k=10 k=205 6 0 —10 19 12 515 29 22 1420 37 30 2225 45 38 3030 53 46 3835 61 54 4640 69 62 5445 77 70 6250 85 78 7055 93 86 7860 100 94 8665 — 100 94（3）估计最佳梯度条件如果实验表明样品更适于梯度条件，可由下表估计分子量小于2000样品的初始和终止%B的最佳值。
基于初始梯度运行中的首峰和末峰的保留时间估计梯度洗脱的起始和终止%BtRa或tRz（min）起始%B 终止%B5 3 1410 11 2215 19 3020 27 3825 35 4630 43 5435 51 6040 59 6845 67 7650 75 8455 83 1003，梯度洗脱的原理梯度洗脱中，流动相强度（%B）在分离过程中逐渐增加。
也就是说随样品迁移过色谱柱中，以k衡量的样品各谱峰的保留值是减小的。
梯度洗脱的有效k值等于谱峰在柱上迁移至一半路程时的k值。
梯度洗脱中k的平均值定义为k*，与等度分离一样，它决定样品的分离度和峰宽。
不同峰的k*近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征。
因此，线性梯度色谱图中每一谱峰具有相似的峰宽。
3.1 梯度与等度洗脱等度分离中的每个谱峰在穿过色谱柱的过程中，被组成恒定不变的流动相（%B）所包围，由容量因子k衡量的某一谱峰的保留值在分离过程中保持不变。
但在梯度洗脱中，一谱峰在穿过色谱柱的过程中周围的流动相是改变的，该谱峰的即时k值也是在变化的。
另外，等度色谱图中被分离的谱峰通常具有不同的k值，而在梯度洗脱中不同谱峰的有效k值（k*）却几乎相同。
式中GS为梯度变化速率，%/min；F为流速，mL/min；Vm为柱死体积，mL。
若已知某一样品需用梯度洗脱，选择k*≈5进行初始试验较为合适，这样可以兼顾分离度、能方便检测的峰高和运行时间。
3.2 梯度变化速率的影响由于等度与梯度洗脱的相似性，较大k*值的影响应与较大k值一样：（1）k*增加，分离度Rs开始先增加，然后达到平衡；（2）谱峰伴随峰高相应减小而展宽；（3）运行时间延长。
%/min(梯度)的增加类似于%B(等度)的增加梯度k*的增加类似于等度k的增加梯度洗脱的方法建立几乎同等度分离一样。
首先优化保留值（k*），然后按需要改变选择性（α），最后可调节柱条件（N）以兼顾改善运行时间和分离度。
3.3 梯度范围的影响梯度范围指梯度起始和终止%B的差值。
初始的试探性实验可进行一次全范围梯度（即5→100%B）。
足够大的初始%B值主要影响色谱图中的前部谱峰，使它们的k*值降低；峰变窄；分离度降低。
如梯度过早结束（末峰离开柱之前），通常应增加运行时间，并使后面谱峰变宽（检测灵敏度下降）。
4，建立梯度分离梯度方法建立的步骤可总结为：（1）以等度分离的相同方式选择初始条件：色谱柱，流动相组成，流速，温度等；首次梯度试验却应采用较宽的梯度范围。
应先优化初次实验的k*，梯度变化速率不能太陡。
（2）再调节梯度范围以缩短运行时间，去除色谱图开始和结束时无用的空间。
（3）如出现谱峰重叠或运行时间太长，则需改变选择性（α）。
（4）优化峰间距后，改变柱条件以改善分离度和/或运行时间。
（5）制定平衡柱的最佳方法，并考察仪器差异对分离的影响。
4.1 选择梯度条件（1）梯度变化速率如已确定最终方法采用梯度洗脱，k*≈5是良好的首选。
选择15×0.46cm、5μmC8或C18柱、流速2ml/min较好。
通常，初次分离宜用全范围梯度：5→100%B（△%B=95）。
梯度时间tG。
（2）梯度范围如初始梯度实验条件进行（60min梯度，5→100%B；15×0.46cm柱；2ml/min；k*≈17），起始%B与终止%B的最佳值可由前表估计出。
然后进一步优化梯度范围。
初始运行之前已确定需用梯度洗脱，小分子（＜2000）最好先采用20min梯度试验。
4.2 改变峰间距在梯度洗脱中改变选择性与峰间距可通过与等度分离相同的方式实现［即通过改变k和k*（等度洗脱的%B、梯度洗脱的梯度变化速率），溶剂类型，色谱柱型，pH，HPLC方法，温度等］。
反相分离中性样品时，用于改变选择性的变量的优先次序排列为：首先是流动相强度（k*），其次是溶剂类型（乙腈＞甲醇＞THF），柱型（C8或C18＞氰基＞苯基），最后是温度。
对于离子样品，pH和温度是控制选择性的重要因素。
（1）梯度变化速率在等度分离中改变%B可使k和α发生变化；在梯度洗脱中，可通过改变梯度变化速率Gs达到相当的效果。
在梯度洗脱中改变梯度变化速率或（k*）导致α和峰间距的改变可能要比在等度分离中改变%B （k）大得多。
因此，通过改变k或k*来控制峰间距在梯度洗脱是比在等度分离中有效得多。
（2）溶剂类型改变有机溶剂为等度分离中改变选择性的一种常用手段，尤其对于中性样品。
在梯度洗脱中改换有机溶剂也可获得类似效果。
（3）其它条件梯度洗脱选择性的改变与其它条件有关（主要针对离子样品）：pH，离子对试剂浓度，温度。
4.3 调整色谱柱条件当针对参数k*和α优化了保留值以后，再改变柱长、固定柱颗粒大小和流速等柱条件，还可进一步改善分离。
等度分离中，改变柱条件对k无影响，但梯度分离k*依赖于柱尺寸和流速。
k*的恒定需保持Gs=（Vm/F）（△%B/tG）不变。
如仅改变微粒大小则不需要改变梯度时间以保持k*恒定。
5，实验问题5.1 设备对分离的影响：系统的滞留体积（1）设备差异用于梯度洗脱的仪器有两种：高压混合系统和低压混合系统。
高压混合系统在泵后（高压状态下）立刻混合A溶剂与B溶剂，而低压混合系统在泵前混合溶剂。
梯度设备的设计对分离的主要影响在于“滞留”体积（VD）。
其它条件相同时，低压混合（LPM）系统的VD值较大。
包括自动进样器在内，VD值范围一般为2~8ml，但管路安装不好的设备滞留体积值会超过10ml。
（2）不同HPLC分离效果的差异不同设备滞留体积对梯度分离时的主要影响是使样品保留时间发生变化。
增加的滞留体积相当于在梯度开始时增加的等度延迟。
由于不同HPLC系统的滞留体积不同，流动相问题可通过延长柱平衡时间加以避免。
所需的延长时间等于增加的滞留时间。
（3）减小设备滞留体积的影响因为滞留体积的差异是梯度方法在不同系统之间不能很好移置的主要原因，在方法建立步骤中有必要阐明原系统的滞留体积。
减小不同滞留体积对分离效果影响的办法有三种：第一（最好的），某些系统控制器可以在梯度开始后的精确时间进样。
如延迟进样时间tD，梯度和样品可同时到达柱进口。
第二，如梯度过程开始可插入一段等度过程，用VD值较大的系统时则可以缩短这一过程；而用VD值较小的系统时则可延长这一过程。
以此方式，样品和梯度则会同时达到柱进口。
第三，以一较陡梯度从5%B至初始%B开始。
5.2 可重现的分离（1）柱再生在梯度洗脱末尾时保持100%B或快速将梯度改变至100%B一段时间（如2~5倍体积），以便采用强溶剂来清洗柱子。
（2）柱平衡梯度洗脱中，的早期谱峰的保留值和分离效果会发生改变。
柱平衡一般需要5~10倍柱体积的初始流动相。
最好在进样和下一次梯度开始之前，用初始流动相彻底平衡色谱柱。
如不能彻底平衡柱子，色谱图中为达到柱平衡，还可以使梯度反向运行。
（3）不准确的梯度分离重现性较差也会由梯度的不准确引起。
梯度不准确更易导致不同梯度系统之间的分离产生差异，当怀疑保留时间发生变化是由梯度混合不准确所致的%B随机波动而引起时，通过避免使用储液器中的纯溶剂A和B，可降低此问题的发生。
