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主题：液相色谱进阶讲座之梯度洗脱简介：通过实例详细介绍“梯度洗脱”的意义、应用领域、操作方法以及优化，相信能够使广大网友的液相色谱技术有一些崭新的提高欢迎参与交流和讨论梯度洗脱gradient elution1 简介通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。
2 梯度洗脱的应用梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。
B 大分子样品分析。
C 样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。
D 单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。
(1)多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。
假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。
图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。
图T1 (等度，流动相：80%乙腈水溶液)图T2 (等度，流动相：100%乙腈)图T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)其他色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 μm流速：1.0 ml/min检测器：UV254 nm1 邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4 邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)5 邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)6 邻苯二甲酸二戊酯(DPP)7 邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)8 邻苯二甲酸二己酯(DHP)9 邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)三种洗脱方式对比条件最小分离度分析时间灵敏度等度1(T1)＞4＞100 min 1-9，灵敏度逐渐降低，8和9难以检出等度2(T2)＝0.811 min 1-9，灵敏度逐渐降低，均较高梯度(T3)＞325 min 1-9，灵敏度相差不大，均较高由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值”。
梯度洗脱的原理范文梯度洗脱（Gradient Elution）是一种常用的液相色谱分离方法，其原理是通过改变色谱柱中流动相的成分，使得不同溶质在流动相中的重新分配，达到分离的目的。
在梯度洗脱中，液相色谱系统通常采用两种或多种不同性质的溶剂混合而成的混合溶剂作为流动相。
这些溶剂具有不同的极性或成分，可以在一定程度上影响溶质在流动相中的分配行为。
在分离过程中，根据分析物的特性，通过改变相对浓度的梯度来实现不同时间点分离物质的最佳洗脱条件。
1.吸附作用：溶质与固相材料表面相互作用力，使得溶质在固相上吸附。
吸附作用力的强弱与溶质与固相的相互作用有关，大部分液相色谱中的固相为极性的硅胶、氮化硅、脱脂棉等，因此有极性或似极性的物质更容易吸附于固相上，而非极性物质则较难吸附。
2.解吸作用：溶质与溶剂之间的相互作用力，使得溶质从固定相上解吸到流动相中。
溶剂与固相之间更强的相互作用力能够将吸附在固相上的溶质解吸下来。
通过改变流动相溶剂的成分，可以调整溶质与固相的相互作用力，从而控制解吸的速度。
3.离子交换作用：在离子交换液相色谱中，固相为吸附有离子交换功能的树脂。
通过改变流动相中离子浓度，可以改变溶质与固相树脂上交换的离子类型和数量，实现分离。
梯度洗脱的步骤可以简单概括为：首先，将流动相组成相对富含一种极性溶剂的梯度洗脱剂，当溶质的保持时间较长时开始加入另一种相对非极性的溶剂。
其次，逐步改变极性和非极性成分之间的浓度比例，实现不同溶质的洗脱。
在梯度洗脱过程中，有几种重要的参数需要注意。
首先是梯度洗脱剂的浓度梯度和梯度变化的速度，这直接影响洗脱曲线的斜率和分离效果。
其次是洗脱剂的流速，它与柱温、柱径、固相材料等因素有关，可以影响到洗脱效果。
此外，还有颗粒度、孔径大小、pH值、离子强度等参数都需要根据具体分析要求进行综合考虑调整。
总的来说，梯度洗脱利用了不同溶质与流动相成分的相互作用，通过梯度改变流动相溶剂的成分，实现了组分之间的分离。
高效液相色谱梯度洗脱时应该注意的问题
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，我们必须充分地重视。
1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。
有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。
例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。
当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。
进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。
用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。
3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。
因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。
(使用恒流泵)
4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。
需让10～30
倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。
液相梯度设置技巧摘要：液相梯度设置技巧一、液相梯度的概念与作用1.液相色谱的基本原理2.梯度洗脱的定义与过程3.梯度洗脱在液相色谱中的应用与优势二、液相梯度设置的关键因素1.流动相的选择2.梯度洗脱方法3.梯度洗脱参数的优化三、液相梯度设置的实战技巧1.分离效果的评估与调整2.梯度过渡的平滑处理3.起始梯度与结束梯度的设定4.梯度洗脱过程中的监控与调整四、液相梯度设置的注意事项1.色谱柱的选择与使用2.流速的控制与优化3.温度对梯度洗脱的影响4.避免过度梯度洗脱带来的问题五、液相梯度设置在实际应用中的案例分析1.分析目标与样品特点2.梯度设置的具体实施3.实验结果与分析正文：液相梯度设置技巧在液相色谱（LC）分析中，梯度洗脱作为一种常用的分离技术，得到了广泛的应用。
液相梯度设置不仅关乎到色谱分离效果的好坏，而且影响着分析周期和仪器设备的损耗。
因此，掌握液相梯度设置技巧对于提高液相色谱分析的准确性和可靠性具有重要意义。
一、液相梯度的概念与作用1.液相色谱的基本原理液相色谱是一种基于样品在固定相和移动相之间分配系数的差异进行分离的分析方法。
在液相色谱过程中，流动相（移动相）与固定相发生相互作用，样品组分在两相之间分配，从而实现分离。
2.梯度洗脱的定义与过程梯度洗脱是指在色谱分析过程中，通过改变流动相的组成来实现样品组分的分离。
梯度洗脱方法主要有两种：线性梯度洗脱和恒流梯度洗脱。
线性梯度洗脱是按照一定的时间或体积比例改变流动相的组成，而恒流梯度洗脱则是保持流动相的总流量不变，通过调整不同组成流动相的流速来实现梯度。
3.梯度洗脱在液相色谱中的应用与优势梯度洗脱在液相色谱中具有以下优势：（1）提高分离效果：通过改变流动相的组成，可以实现对不同样品组分的选择性分离，提高分辨率。
（2）缩短分析周期：梯度洗脱可以在较短的时间内完成复杂的分离任务，提高分析效率。
（3）减少峰形扭曲：梯度洗脱可以减少某些组分在色谱柱中的滞留时间，降低峰形扭曲程度。
液相色谱梯度洗脱摘要：I.液相色谱简介A.液相色谱的定义B.液相色谱的原理II.梯度洗脱的原理A.梯度洗脱的定义B.梯度洗脱的作用C.梯度洗脱的应用III.液相色谱梯度洗脱方法A.方法原理B.实验操作C.结果分析IV.梯度洗脱的注意事项A.溶剂的互溶性B.溶剂的纯度要求C.系统压力的变化D.鬼峰的产生E.梯度选择V.总结A.液相色谱梯度洗脱的优势B.液相色谱梯度洗脱的应用前景正文：液相色谱是一种常见的分离和分析技术，通过样品在液相色谱柱中的分配系数的不同，达到分离的目的。
而梯度洗脱是液相色谱中一种常用的技术，可以进一步提高液相色谱的分离效果。
梯度洗脱是指在色谱柱中，流动相的组成逐渐变化，从而使得样品中各组分在色谱柱中的运行速度不同，最终达到分离的目的。
梯度洗脱的作用主要在于可以提高液相色谱的分离度，缩短分析时间，降低最小检测量，提高分离精度。
液相色谱梯度洗脱方法主要分为高压梯度和低压梯度两种。
高压梯度是通过两台高压输液泵将两种溶剂输入，而低压梯度则是在常压下将两种溶剂混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。
在实验操作过程中，需要注意溶剂的互溶性、纯度要求、系统压力的变化、鬼峰的产生以及梯度的选择等问题。
液相色谱梯度洗脱的应用非常广泛，主要应用于药物分析、生物制品分析、食品安全分析等领域。
在药物分析中，梯度洗脱可以用于药物的杂质分析、药物代谢产物分析等；在生物制品分析中，可以用于蛋白质的分离和纯化；在食品安全分析中，可以用于农药残留分析、重金属离子分析等。
总的来说，液相色谱梯度洗脱是一种高效的分离和分析技术，具有广泛的应用前景。
液相色谱梯度洗脱原理嘿，咱今儿来聊聊液相色谱梯度洗脱原理哈！这玩意儿啊，就好比是一场奇妙的旅程。
你看啊，在液相色谱这个大舞台上，各种成分就像是一群演员，它们要依次登场表演呢。
而梯度洗脱呢，就是那个厉害的导演，指挥着这一切。
想象一下，柱子就像是一条长长的跑道，不同的成分在上面奔跑。
一开始呢，用一种洗脱液，就好像给跑道铺了一层特定的地面。
有些成分跑得快，有些跑得慢。
但如果一直用这一种洗脱液，可能有些成分就不太容易被区分出来啦。
这时候梯度洗脱就发挥大作用啦！它会慢慢改变洗脱液的组成，就像是跑道的地面在慢慢变化。
一会儿变得更光滑，一会儿又变得有点阻力。
这样一来，那些原本跑得差不多快的成分，就会因为跑道条件的改变而拉开差距，更容易被我们看清楚它们的真面目啦。
比如说吧，有个成分刚开始不太显眼，但是随着洗脱液的变化，它突然就变得突出了，就好像原本在人群中不太起眼的一个人，突然换了一身特别的衣服，一下子就吸引了大家的目光。
而且啊，这个过程可不是随便乱来的。
就像导演安排剧情一样，要恰到好处，不能太急也不能太慢。
洗脱液的变化要有节奏，要有条理，这样才能让这场表演精彩绝伦。
要是洗脱液变化得乱七八糟，那可就糟糕啦，成分们就会被搞得晕头转向，我们也看不清它们到底是谁啦。
所以说啊，这梯度洗脱真的是个技术活呢！它能让我们更清楚地看到那些复杂混合物中的各种成分，就像在黑暗中点亮了一盏明灯，让我们找到我们想要的东西。
你说这神奇不神奇？咱搞科研、做分析的，可真得好好感谢这个神奇的梯度洗脱原理呢！它让我们的工作变得更加有趣，也更加有意义。
反正我是觉得这玩意儿太厉害啦，你们觉得呢？。
表 3 液相色谱梯度洗脱条件随着科学技术的不断进步，液相色谱技术在生物化学、医药、环境监测等领域得到了广泛的应用。
其中，梯度洗脱是液相色谱法中一种常见的分离技术，能够有效地提高分离效率和分析速度。
梯度洗脱技术的优势在于可以通过改变洗脱溶剂的混合比例，使不同组分在不同时间点得到分离和检测。
本文将介绍液相色谱梯度洗脱条件的具体内容，提供给需要的读者参考。
一、梯度洗脱条件的基本原理在液相色谱法中，梯度洗脱是基于组分在不同溶剂混合比例下的亲和力不同，从而实现分离的原理。
梯度洗脱条件是通过调整流动相的组成，使得不同组分在不同时刻被洗脱出来。
通常，梯度洗脱条件由起始缓冲液组成和洗脱溶剂组成两个部分，二者按照一定的比例混合，根据实际需要来设定。
二、梯度洗脱条件的优化1. 起始缓冲液的选择在梯度洗脱条件中，起始缓冲液的选择是至关重要的。
通常选用的起始缓冲液是对样品无害的、能够提供稳定的pH值和离子强度的缓冲液，比如磷酸盐缓冲液、乙醇胺缓冲液等。
起始缓冲液的选择应考虑对待分离溶质的溶解度和分离度的影响。
2. 洗脱溶剂的选择洗脱溶剂是梯度洗脱条件中的另一个关键因素。
一般情况下，洗脱溶剂的选择应考虑样品的性质、目标分离度以及流动相系统的耐受性。
常见的洗脱溶剂包括甲醇、乙腈等有机溶剂，它们能够提供足够的洗脱力，使得待分离的成分在一定时间范围内逐渐被洗脱出来。
3. 梯度洗脱程序的设计在实际的梯度洗脱条件中，需要根据待分离的样品性质和分离要求来设计梯度洗脱程序。
一般而言，梯度洗脱程序可以分为线性梯度和非线性梯度两种。
线性梯度是在整个洗脱过程中，洗脱溶剂按照固定的斜率逐渐改变混合比例；非线性梯度则是在不同的时间段内采用不同的斜率来改变混合比例。
梯度洗脱程序的设计需要充分考虑样品的特性和目标的分离度，以及流动相系统的适应性。
4. 梯度洗脱条件的验证在设定梯度洗脱条件后，需要对其进行验证和调整。
通常，可以通过改变洗脱梯度的斜率、时间和起始缓冲液的pH值等参数来验证梯度洗脱条件的有效性，从而最大程度地提高分离效率和分析速度。
主题：液相色谱进阶讲座之梯度洗脱简介：通过实例详细介绍“梯度洗脱”的意义、应用领域、操作方法以及优化，相信能够使广大网友的液相色谱技术有一些崭新的提高欢迎参与交流和讨论梯度洗脱gradient elution1 简介通常情况下，液相色谱操作中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。
2 梯度洗脱的应用梯度洗脱可在下列情形中发挥重要作用：A 在等度下具有较宽k值的多种样品分析。
B 大分子样品分析。
C 样品含有强保留的干扰物，在目标化合物出峰后设置梯度洗脱，将干扰物洗脱出来，以免其影响下一次分析。
D 单组份化合物方法建立时，不知道其洗脱情况，使用梯度洗脱，找出其较优的洗脱条件。
(1)多组分分析时，这些组分往往具有很宽的k值范围。
假如使用等度洗脱，这些化合物的k值无法同时落在1~10之间，结果就是，无法同时得到较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值。
图T1、T2、T3是笔者不同条件下分析邻苯二甲酸酯类化合物得到的色谱图。
图T1 (等度，流动相：80%乙腈水溶液)图T2 (等度，流动相：100%乙腈)图T3 (梯度，0-5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)其他色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 μm流速：1.0 ml/min检测器：UV254 nm1 邻苯二甲酸二甲酯(DMP)2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)3 邻苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4 邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)5 邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)6 邻苯二甲酸二戊酯(DPP)7 邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)8 邻苯二甲酸二己酯(DHP)9 邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)三种洗脱方式对比条件最小分离度分析时间灵敏度等度1(T1)＞4＞100 min 1-9，灵敏度逐渐降低，8和9难以检出等度2(T2)＝0.811 min 1-9，灵敏度逐渐降低，均较高梯度(T3)＞325 min 1-9，灵敏度相差不大，均较高由该分析案例可知，在多组分分析时，只要能够选出合适的梯度条件，就能够实现“较好的分离度、较短的分离时间、较高的响应值”。
(2) 样品溶液中同时含有目标化合物和强保留化合物，目标化合物流出后使用梯度洗脱将强保留化合物洗下来，以避免强保留化合物污染色谱柱或在后续的分析中流出干扰分析。
T4 某分析项目末端梯度洗脱以洗掉过剩的衍生试剂(末端梯度：39-40 min，有机相含量由38%升高到80%，保持10 min)由T4可以看出，40 min左右，最晚出峰的组分已经被洗下来，然而却把有机相在1 min内由38%升高到80%，目的就是为了洗脱衍生反应剩余的衍生试剂(50 min处的色谱峰)。
前面的杂质峰为样品基质中的强保留干扰物，末端的梯度洗脱同样也将其洗了下来，这就避免了这些化合物在随后的分析中缓慢流出造成的基线起伏。
(3)当遇到新的化合物需要分析，我们没有文献可以参考，只能初步圈定分析模式(反相、正相等等)，此时确定不了等度洗脱的流动相组成和比例，只好借助梯度洗脱。
3 梯度洗脱的原理(以反相色谱为例)梯度洗脱的实质就是，样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因k值较高而滞留于色谱柱入口附近(几乎未移动)。
一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到t C1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，t C1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。
B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于t C2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。
T5 梯度洗脱过程中的峰迁移黑色虚线代表B比例的变化(对应左侧上方纵轴)红色曲线代表化合物k值随流动相改变而发生的变化(对应右侧纵轴)绿色曲线代表化合物化合物在柱中的位置变化(对应左侧下方纵轴)紫色曲线为色谱图4 梯度分离的建立梯度洗脱可以按下列步骤建立;A 选择初始条件：色谱柱(类型和规格)、流动相组成、流速、柱温等等B 根据A的分析结果升高起始流动相中的B%并降低结束流动相中的B%，以去除色谱图中第一个峰出现前的和最后一个峰出现后的无意义时间C 当峰分离较差或运行时间过长的时候，应通过调整强洗脱溶剂B、B升高速率或使用分段梯度等方式予以解决D 考察不同仪器对梯度分离的影响。
(1)选择梯度条件流动相：选择一种强洗脱溶剂和一种弱洗脱溶剂，反相中常用强洗脱溶剂为乙腈和甲醇，弱洗脱溶剂为水,(由于反相中分离的化合物许多具有解离性，所以水相往往有酸、缓冲盐等，这些不在本讲座讨论范围以内，本讲座提到的水相可能包括纯水、缓冲盐水溶液等，具体事例会明确写出)。
正相中常用的强洗脱溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醇等，弱洗脱溶剂为正己烷。
流速：对于4.6 mm内径的色谱柱一般把流速设定为1.0~1.5 ml/min，其他内径的色谱柱可以以此标准进行换算；柱温：如有柱温箱，设定柱温35~45 ºC为宜；初始变化速率：可以按下面的公式计算确定F为流速，单位为ml/min；V m为色谱柱死体积，单位为ml；k*为期望的平均保留因子；△%B为强洗脱溶剂的变动值；t G为梯度时间，单位为min。
该公式适用于相对分子量处于50~500之间的化合物。
对于150*4.6 mm 的色谱柱，V m约为1.2 ml；流速通常设定为1.0 ml/min；k*为5是比较好的选择；因此△%B/t G应为3.3，也就是B的改变速率设定为3.3%是适宜的，当梯度范围为5%-100%，梯度时间可以设为29 min。
梯度范围：为避免峰遗漏，初始梯度范围最好设置为强洗脱溶剂变动范围为5%-100%，在反相中可以把乙腈的变动范围设置在5%-100%，如果是能够耐受纯水的色谱柱，也可以设定在0%-100%。
梯度形状：在初始梯度实验中，梯度可设置成线性(不分段)，在后续的调整中则可以设置分段梯度，每一段梯度的B变动斜率存在差别。
(2)调整强洗脱溶剂B、梯度变化速率或使用分段梯度等方式以优化梯度条件流动相对选择性起着至关重要的作用，流动相组成或比例的改变均会显著改变分离度，在梯度中亦然。
反相模式梯度的初试中，强洗脱溶剂往往选择乙腈，但乙腈只是在某些项目中具有较好的选择性，而另一些项目甲醇或许更合适。
乙腈、甲醇洗脱能力相近，但二者的选择性则具有互补性。
T6、T7、T8是PITC柱前衍生-反相液相色谱分析18种氨基酸的色谱图。
T6以乙腈作为强洗脱溶剂，丙氨酸和脯氨酸(7和8)分离度不足1.5；T7以甲醇作为强洗脱溶剂，9后面的组分分离很差。
上述表明，甲醇对前面一组峰的分离较好，儿乙腈则更适合后面一组峰，因此笔者把甲醇乙腈混合液作为强洗脱溶剂，T8证明这种混合溶剂的确能够将18种天然氨基酸、内标物正亮氨酸以及NH3的的分离度达到2.0以上。
T6 B为80%乙腈水溶液T7 B为80%甲醇水溶液T8 B为甲醇：乙腈：水=20:60:20其他色谱条件色谱柱：Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250*4.6 mm，5 μm；流动相B：见谱图上方的描述流动相A：0.05 mol/L乙酸钠水溶液(pH=6.5)流速：1.0 ml/min检测器：UV 254 nm柱温：35 摄氏度具体化合物：1 Asp(天冬氨酸)；2 Glu(谷氨酸)；3 Ser(丝氨酸)；4 Gly(甘氨酸)；5 His(组氨酸)；6 Arg(精氨酸)；7 Thr(苏氨酸)；8 Ala(丙氨酸)；9 Pro(脯氨酸)；10 NH3；11 Tyr(酪氨酸)；12 Val(缬氨酸)；13 Met(蛋氨酸)；14 Cys(胱氨酸)；15 Ile(异亮氨酸)；16 Leu(亮氨酸)；17 Nle(正亮氨酸)；18 Phe(苯丙氨酸)；19 Trp(色氨酸)；20 Lys(赖氨酸)化合物列表与T8上的峰号严格对应。
梯度变化速率梯度变化速率与平均保留因子k*是成反比关系的，梯度变化速率降低，k*值增加，并会产生如下结果：其一，各组分间的分离度R提高；其二，色谱峰的区域宽度增加，灵敏度下降；其三，分析时间延长。
第一点是积极的，第二、第三点是消极的。
所以应在分离度能满足要求的前提下，控制梯度变化速率不要过低。
下面是梯度变化速率的影响：测试项目为15种农药，唯一变量为梯度变化速率。
T9 甲醇变化速率20%/min，k*=1T10 甲醇变化速率5%/min，k*=4T11 甲醇变化速率1%/min，k*=15其他色谱条件色谱柱：C18,250*4.6 mm，5 μm流动相：甲醇，水流速：1.7 ml/min柱温：室温由T9、T10、T11可知，随着强洗脱溶剂变化速率降低，各组分的分离度逐渐增大，分析时间也逐渐延长。
如果改变溶剂、调整梯度变化速率仍不能较好分离则需要改成非线性梯度。
下面是偶氮释放的24种芳香胺分析：T12 偶氮释放的24种芳香胺分析的梯度设置B为甲醇，A为0.005 mol/L 磷酸二氢铵+0.005mol/L磷酸氢二钠水溶液T14 色谱图结合梯度和色谱图可知，1-6是由第一段梯度(蓝色虚线)洗脱下来，B升高速率为0.5%；7-16由第二段梯度(粉色虚线)洗脱下来，B升高速率为0.27%，色谱峰宽度较大；17-24由第三段梯度(绿色虚线)洗脱下来，B升高速率为1.85%，因而峰形最为尖锐。
(3) 不同仪器对梯度分析结果的影响以及消除影响的办法与等度分析不同，梯度分析时，色谱柱入口的流动相状态并不能与梯度曲线上的流动相状态在时间上准确对应。
比如，0 min流动相比例已经开始变化了，这种变化首先由泵或比例阀做出动作，而此刻柱入口处的流动相组成仍是初始流动相，变化的流动相穿过泵或比例阀到柱头之间的空间后才能传达到柱入口，所以色谱柱入口的流动相状态始终滞后于时间程序上的流动相状态。
滞后时间tD=VD/F，VD是泵或比例阀到柱头之间的体积，F 为体积流速。
不论是高压梯度还是低压梯度，滞后体积通常处于2~8 mL之间，滞后体积的不同会导致下列现象：其一，在不同款式仪器上使用相同梯度，保留时间会发生变化；其二，在一种款式的仪器上开发的梯度洗脱方法换到另一款仪器上，可能会出现分离度下降、峰位置变化等现象可用用下面的办法消除上述不利影响：在A仪器上(VD=V1)开发梯度方法，在开发的梯度程序前预先加入5 min等度洗脱(比例与初始流动相比例相同)，并确定这5 min的等度为影响分离，这就可以作为最终的梯度条件；等换到B仪器上(VD=V2)，若V2=V1，梯度程序不需改变；若V2大于V1，那么应把前面的等度时间调小，减小值应为(V 2-V1)/F；若V2小于V1，那么应把前面的等度时间调大，增加值应为(V1-V2)/F。
