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HPLC常规清洗方法高效液相色谱（HPLC）是一种常见的分离和分析技术，广泛应用于药物、食品、环境等领域。
在使用HPLC仪器进行分析之前，必须进行常规清洗，以确保系统的稳定性和可靠性。
本文将介绍HPLC常规清洗的方法。
首先，清洗HPLC系统的第一步是清洗流体的选择。
常见的清洗溶剂包括纯水、溶剂A（一般为水性溶液）和溶剂B（一般为有机溶液）。
在选择清洗溶剂时，需要根据实际分析的样品特性和HPLC柱的要求进行合理选择。
其次，HPLC常规清洗的步骤如下：1.刷洗固定相和柱：将固定相和柱取下，用洗瓶喷洒纯水将固定相和柱表面的杂质清洗掉。
然后用纯水刷洗柱的外壁，确保柱表面的干净。
2.清洗流路：将柱和固定相重新安装到系统中，通过系统的温度控制器将温度增加到40-50℃。
然后将溶剂A通过系统进行循环，循环时间为20-30分钟。
这样可以将残留在系统中的杂质和有机溶剂清洗干净。
3.清洗柱的步骤如下：a.首先使用溶剂A进行较长时间（一般为20-30分钟）的洗脱。
b.然后使用溶剂B进行洗脱，洗脱时间一般为10-15分钟。
c.最后使用溶剂A进行柱平衡，平衡时间为5-10分钟。
4.清洗柱后，可以进行系统的性能验证，包括流速、压力、噪声等参数的测试，以确保系统恢复正常。
5.最后，可以进行柱的保养工作，如更换柱端接头、清洗流路和系统等。
需要注意的是，HPLC常规清洗应该定期进行，避免柱子和固定相表面的杂质对样品的干扰。
另外，在样品之间进行转换时，也应该进行柱的清洗。
总结起来，HPLC常规清洗的方法主要包括清洗流体的选择、刷洗固定相和柱、清洗流路、清洗柱和系统性能验证等步骤。
通过定期进行清洗，可以确保HPLC系统的稳定性和可靠性，提高分析结果的准确性。
高效液相色谱法中梯度洗脱方法的优化高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
梯度洗脱方法是HPLC分离的一种重要手段，通过改变洗脱溶剂组成，可以实现对样品中复杂成分的有效分离。
然而，在实际应用中，梯度洗脱方法的优化是一个复杂而关键的问题。
本文将就梯度洗脱方法的优化进行探讨。
首先，梯度洗脱方法的优化需要考虑洗脱过程的速度和分离效果之间的平衡。
过快的洗脱速度可能导致分离不完全，而过慢的洗脱速度又会浪费时间和溶剂。
因此，找到合适的梯度斜率是一个非常重要的问题。
其次，梯度洗脱方法的优化还需要考虑洗脱溶剂的选择。
洗脱溶剂的选择直接影响到样品分离的效果。
合适的洗脱溶剂不仅能够提高分离效果，还能够缩短分析时间。
在实际应用中，常用的洗脱溶剂包括甲醇、乙腈和水等。
对于不同的样品，需要选择合适的洗脱溶剂组合，以达到最佳的分离效果。
此外，梯度洗脱方法的优化还需要考虑洗脱温度的影响。
洗脱温度可以影响样品在固定相上的吸附和解吸速度，从而影响分离效果。
一般来说，温度较高有利于加速洗脱速度，但也可能导致部分样品的分解或者溶解度下降。
因此，合理选择洗脱温度是保证分离效果的关键。
此外，对于某些特殊的样品，为了获得更好的分离效果，可以采用前柱洗脱方法。
前柱洗脱方法是将洗脱溶剂与样品分开处理，先用较弱的洗脱溶剂洗脱样品，再用较强的洗脱溶剂冲洗固定相，以达到更好的分离效果。
当然，对于不同的样品，需要进行不同程度的优化，才能得到最佳的分离条件。
梯度洗脱方法的优化是一个综合性的问题，需要考虑多个因素的综合影响。
在实际应用中，可以通过实验设计的方法，对洗脱条件进行系统优化。
例如，采用正交试验设计方法，通过有限次数的试验，确定最佳的洗脱条件。
此外，也可以运用现代优化算法，如遗传算法和模拟退火算法等，对梯度洗脱条件进行优化。
综上所述，梯度洗脱方法的优化是一个复杂而关键的问题。
被分离组分在柱中的洗脱原理Ⅱ基本概念和理论一、基本概念和术语1.色谱图和峰参数⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
⊕噪音（noise）――基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。
⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。
T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。
⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。
⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W=4σ。
⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。
W h/2＝2.355σ。
⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
表４ ３批心舒宝片中３种成分的含量测定结果（ｎ＝２）批号没食子酸（ｍｇ／片）芍药苷（ｍｇ／片）丹酚酸Ｂ（ｍｇ／片）１８０９００９２ ０９ ２０ ８５１８０５０１１２ ２９ ３０ ８２１８０３００１１ ９８ ８０ ７３３ 讨论３ １ 丹参是心舒宝处方的君药，该制法对丹酚酸Ｂ等水溶性成分损失较少，故选择丹酚酸Ｂ作指标成分。
白芍是处方中的主药之一，参考中国药典选择芍药苷作为指标成分〔２〕，而试验发现其没食子酸的含量也较高，易检测，可一起作为指标成分。
３ ２ 检测波长的选择 芍药苷和丹酚酸Ｂ的波长参考中国药典２０１５年版一部白芍及丹参项下含量测定〔２〕，没食子酸的最大吸收波长靠近丹酚酸Ｂ，可一起采用２８６ｎｍ检测。
３ ３ 溶剂与流动性的选择 用６５％甲醇水溶液提取，很难过滤，操作性偏差。
加热回流１ｈ与超声提取３０ｍｉｎ，峰数量和峰面积无显著差别。
流动相用甲醇 ０ １％磷酸水溶液或乙腈 水，分离度与峰型都不理想。
本方法准确可靠，可用于心舒宝片的质量控制。
参考文献〔１〕卫生部药品标准·中药成方制剂〔Ｓ〕 第十四册，２１〔２〕国家药典委员会编 中国药典（２０１５年版，一部）〔Ｓ〕 北京：中国医药科技出版社，２０１５，７６〔３〕国家药典委员会编 中国药典（２０１５年版，一部）〔Ｓ〕 北京：中国医药科技出版社，２０１５，１０５ＲＰ ＨＰＬＣ梯度洗脱法测定吡嘧司特钾滴眼液的有关物质刘春亮，张 磊（滁州市食品药品检验中心，安徽滁州２３９０００）摘要：目的 建立ＲＰ ＨＰＬＣ梯度洗脱法测定吡嘧司特钾滴眼液的有关物质。
方法 采用ＷＡＴＥＲＳＳｕｎｆｉｒｅＣ１８分析柱（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，５μｍ），流动相Ａ为甲醇 三氟乙酸（１→１０００）（１∶４），流动相Ｂ为甲醇 三氟乙酸（１→１０００）（３∶２），检测波长为２６０ｎｍ，柱温为４０℃。
结果 在选定的色谱条件下，吡嘧司特钾与有关物质完全分离；滴眼液中基质无干扰。
HPLC术语介绍（高效液相色谱术语指南）1.氧化铝使用一种多孔、颗粒状氧化铝[Al203]作为正相吸附色谱中的固定相。
氧化铝具有高活性的碱性表面；10%水性浆液的pH约为10。
继续用强酸清洗，可制成中性和酸性级浆液[pH分别为7.5和4]。
氧化铝的吸湿性高于二氧化硅。
其活度根据Brockmann†级含水量进行判定；例如，活度I级包含1%的水。
2.基线*记录当仅有流动相从色谱柱中流出时检测器响应的色谱图部分。
3.小柱一种不带末端接头的色谱柱，仅由一个开放管路组成，其中填料被两端筛板保留。
SPE小柱可以在真空萃取装置上并行使用。
HPLC小柱放置在小柱卡套中，该小柱卡套的每一端都有流路连接。
与带有一体式末端接头的传统色谱柱相比，小柱易于更换、成本更低且使用更方便。
4.色谱图*检测器响应或洗脱液中分析物浓度的其他量度相对于洗脱液体积或洗脱时间所作的图或其他表示。
在平面色谱[例如，薄层色谱或纸色谱]中，色谱图可以表示包含分离区域的纸或薄层。
5.色谱*一种动态物理化学分离方法，待分离组分被分配到两相中，其中一相静止[固定相]，另一相[流动相]相对于固定相流动。
6.柱体积* [Vc]管路部分的几何体积，包含填料[管路的内横截面积乘以填充床长度L]。
色谱柱的颗粒间体积，又称柱隙体积，是填充床中颗粒间流动相所占据的体积。
死体积[V0]是流动相占据的总体积，即柱隙体积与颗粒间体积的总和[又称孔隙体积]。
7.检测器* [请参阅“灵敏度”]通过测定物理或化学特性（例如紫外/可见光吸光度、折射率差、荧光性或导电率）指示洗脱液组分变化的装置。
如果检测器的响应与样品浓度呈线性关系，则使用标准品进行适当校正，可以对组分进行定量。
通常，串联使用两种不同类型的检测器是有利的。
这种方式有助于获得有关样品分析物的更多确证或具体的信息。
某些检测器[例如电化学检测器、质谱检测器]是破坏性的，即它们会导致样品组分发生化学变化。
如果这类检测器与非破坏性检测器配合使用，则通常将这类检测器置于流路后方。
HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。
等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。
采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。
梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。
两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。
线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：
①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。
有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。
当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。
进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。
用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。
③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。
例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。
因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。
④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。
需让10~30倍柱容积的初始流
动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。
