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亲和层析洗脱条件梯度洗脱
亲和层析是一种分离和纯化生物分子的方法，它利用靶分子与其亲和配体之间的特异性相互作用来实现分离。
层析是指物质在固定相和流动相之间的分配过程，而亲和层析则是在这个过程中利用靶分子与亲和配体之间的特异性结合来实现分离。
在亲和层析中，洗脱条件是指用来将目标分子从亲和柱中洗脱出来的条件，而梯度洗脱则是一种洗脱方法，通过改变洗脱缓冲液中亲和剂的浓度或者pH值的梯度来实现分离。
在亲和层析中，洗脱条件的选择对于分离纯化目标分子非常重要。
梯度洗脱是一种常用的洗脱方法，它可以根据靶分子与亲和配体的结合强度来选择合适的洗脱条件，从而实现目标分子的有效洗脱和分离。
梯度洗脱的优点在于可以在一定程度上避免非特异性结合物的洗脱，提高目标分子的纯度。
在进行亲和层析洗脱时，可以根据靶分子与亲和配体的结合特性和亲和力来选择合适的洗脱条件。
通常可以通过改变洗脱缓冲液的pH值、离子强度或者亲和剂的浓度来实现梯度洗脱。
此外，还可以根据靶分子的特性和亲和柱的选择来优化洗脱条件，从而实现更好的分离效果。
总的来说，亲和层析洗脱条件的梯度洗脱是一种重要的分离方法，通过合理选择洗脱条件可以实现靶分子的高效纯化和分离。
在实际操作中，需要根据具体的实验要求和目标分子的特性来优化洗脱条件，从而获得理想的分离效果。
2.3 观察指标总胆固醇(T C)、甘油三脂(T G )、高密度脂蛋白(HDL )、低密度脂蛋白(L DL )、超氧化物歧化酶(SO D)、丙二醛(M DA );检测方法:T C 、T G 用氧化酶法,HDL 用磷钨酸钠—镁法,SO D 用黄嘌呤氧化酶,550nm 比色,M DA 为硫代巴比妥钠(T BA )缩合法532nm 比色。
2.4 统计方法治疗前后用t 检验,个体疗效用V 2检验,参数用均数加减标准差(x ±s )表示,临床症状疗效用积分法统计。
3 结果3.1 参考1988年卫生部公布调整血脂药物临床研究指标原则标准,制定评定标准如下:治疗后T G,T C,L DL ,M DA 下降≥20%为显效,下降10%～19%为有效,下降≤9%为无效。
症状累计分值治疗后下降≥50%为显效,下降30%～49%以下为有效,下降20%～29%为好转,下降19%以下为无效。
3.2 两组降脂作用比较见表1。
治疗组有明显的降脂作用,与治疗前比较有显著性差异(P <0.05或P <0.01)。
治疗后两组间比较有显著性差异(P <0.05或P <0.01)。
M D A 、T C 、T G 、L DL 降低幅度,治疗组较对照组组为优,有显著性差异(P <0.05,或P <0.01),有升高HD L 、SOD 趋势。
3.3 两组分型疗效比较治疗血瘀型21例,其中显效9例,有效7例,好转3例,无效2例,总有效率为76.19%;湿阻型18例,其中显效5例,有效6例,好转3例,无效4例,总有效率为61.11%;气虚组9例,其中显效4例,有效3例,好转2例,无效0例,总有效率为77.78%;对照组血瘀型8例,其中显效3例,有效2例,好转3例,无效0例,总有效率为62.50%;湿阻型5例,其中显效1例,有效2例,好转2例,无效0例,总有效率为60.00%;气虚组3例,其中显效0例,有效2例,好转1例,无效0例,总有效率为66.66%;治疗组疗效高于对照组,治疗组平均总有效率为71.69%,对照组为61.02%。
梯度洗脱反相高效液相色谱法测定恩替卡韦的有关物质蒋银妹1,罗秀琴2,徐燕2,毕开顺13(1.沈阳药科大学药学院,沈阳110016;2.长沙市华美医药研究所,长沙410007)摘要 目的:建立测定恩替卡韦有关物质的梯度洗脱反相高效液相色谱法。
方法:采用W aters C18色谱柱(5μm,416mm×250 mm),以乙腈-水(3∶97)为流动相A,乙腈为流动相B;梯度洗脱条件:0～10m in,A从100%→90%;10～15m in,A为90%;15～25m in,A从90%→60%;25～28m in,A从60%→100%;以110mL・m in-1的流速进行梯度洗脱,检测波长为254n m。
结果:在上述色谱条件下,恩替卡韦与各中间体杂质及降解杂质均能有效分离,分离度大于210;检测限为014ng,精密度良好(RS D为018%)。
结论:本方法操作简便,专属性强,灵敏度高,可用于恩替卡韦有关物质的测定。
关键词:恩替卡韦;有关物质;反相高效液相色谱法;梯度洗脱中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:0254-1793(2009)04-0676-04HP LC deter m i n ati on of rel ated subst ances i n entecavi rJ I A NG Yin-mei1,LUO Xiu-qin2,XU Yan2,B I Kai-shun13(1.Shenyang Phar maceutical University,Shenyang110016,China;2.I nstitute of HameiMedicine of Changsha City,Changsha410007,China.) Abstract O bjecti ve:T o establish an RP-HP LC method f or related substances deter m inati on of ent ecavir.M eth2 od:The W aters C18colu mn(5μm,416mm×250mm)was used.Mobile phase A:acet onitrile-water(3∶97);Mo2 bile phase B:acet onitrile.Conditi on of the gradient eluti on:0-10m in,A:100→90%;10-15m in,A:90%;15-25m in,A:90→60%;25-28m in,A:60%→100%;The gradient eluti on was purf or med with a fl ow rate of110 mL・m in-1,the detecti on wavelength was254nm.Results:Good chr omat ographic separati on of entecavir and its inter mediate p r oducts and by-p r oducts were obtained.The detecti on li m it is014ng and the p recisi on was good with RSD of018%.Conclusi on:The method is convenient,highly s pecific,sensitive and suitable for deter m inati on of the related substances of entecavir.Key words:entecavir;related substance;RP-HP LC;gradient eluti on 恩替卡韦化学名为2-氨基-9-[(1S,3R, 4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1,9-二氢-6H-嘌呤-6-酮一水合物,是由百时美施贵宝公司自主研发的一种核苷类似物,已于2005年3月30日在美国获得美国食品药品监督管理局(F DA)的上市批准,剂型有片剂(规格:015, 110mg・片-1)和口服液(规格:0105mg・mL-1),适用于病毒复制活跃、血清转氨酶(ALT)持续升高或有肝脏组织学显示活动性病变的成人慢性乙型肝炎患者。
对于组分复杂的样品，采用一种色谱体系，很难得到理想的分离结果。
要么分离时间太长，要么分离度太差。
液相色谱中采用梯度洗脱,目的：缩短的时间；提高分离效果。
梯度洗脱：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。
梯度洗脱特点：提高柱效改善检测器的灵敏度当样品中的一个峰的k'值和最后一个峰的k'值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。
梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。
梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。
梯度范围：指流动相中强溶剂分别在起始液和终止液中的浓度。
调节梯度范围对得到最佳的梯度分离起重要作用。
最佳梯度范围：第一个峰处分时间大约为2倍的t0，梯度结束时把最后一个峰洗脱出来。
梯度洗脱的形式线形梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化与梯度时间成线性比例。
在一定时间内流动相强度越大，直线斜率越大。
指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度岁梯度时间变化称指数关系。
凹形：梯度起始阶段强度变化缓慢，随时间增加，强度变化加快。
凸形：起始阶段梯度速度变化快，终止阶段梯度速度变化慢。
折线形：选择适当的A,B溶剂强度：A溶剂为低强度；B溶剂为高强度，B溶剂的强度应能够在梯度过程中使所有欲测谱带都能被洗脱，并使各谱带的k’值在2- 10之间。
初步分离选择好A、B两种溶剂，先按中等强度进行配比，在此恒定强度下进行初步分离。
A、B混合溶剂强度应使所有谱带的k’值在1-10之间。
梯度形式选择经过初步分离，一般可能得到3种分离色谱图：①前半部峰重叠，后半部峰分离度过大，保留时间太长；可选择线形梯度，或凹形梯度。
②前半部分离良好，后半部峰重叠；可选择凸形梯度。
③前后两部分分离良好，中间部分峰重叠。
可选择折线梯度。
梯度洗脱一般应给出下列条件：起始液（A液）、终止液（B液）、起始时间（min）、终止时间（min）、梯度速度（B% /min）。
c18色谱柱梯度洗脱C18色谱柱是一种广泛使用的反相色谱柱，常用于分离和纯化有机化合物。
梯度洗脱是一种常见的色谱洗脱方法，它通过改变溶剂组成的梯度来实现化合物的分离和提纯。
下面将详细介绍C18色谱柱梯度洗脱的原理、步骤和优缺点。
C18色谱柱是由具有C18烷基链的硅胶或其他固定相填充的柱子。
C18固定相具有较强的疏水性，可以与非极性、弱极性和具有疏水性功能团的化合物发生相互作用。
在梯度洗脱中，我们通常使用两种或更多溶剂来实现化合物的分离。
这些溶剂通常是水和有机溶剂（如甲醇、乙醇等）的混合物。
梯度洗脱的原理是通过改变这些溶剂的比例来调控毛细管壁上的相互作用力，以达到分离化合物的目的。
梯度洗脱的步骤通常包括预平衡、样品加载、梯度开始、梯度结束和再平衡等阶段。
首先，需要进行预平衡，将色谱柱与洗脱溶剂（通常是纯水）平衡一段时间，以保证柱子内的固定相处于最佳状态。
然后，将待分离的样品通过注射器加载到色谱柱中。
在梯度开始阶段，初始时使用高极性溶剂，如纯水，以保证样品分离出基线。
随着时间的推移，梯度溶剂中有机成分的比例逐渐增加，这将导致样品中的化合物离开色谱柱。
在梯度结束阶段，使用高有机溶剂浓度的溶剂，即纯的有机溶剂（如甲醇），来稀释梯度溶剂中的有机成分，以最大程度地将化合物从色谱柱中洗脱。
最后，进行再平衡，将色谱柱与洗脱溶剂再次平衡，以准备下一次实验。
C18色谱柱梯度洗脱的优点包括：1. 分离效果好：C18色谱柱对于非极性化合物的分离效果非常好，可以较好地分离具有相似结构和物化性质的化合物，提高色谱分离的灵敏度和选择性。
2. 操作简便：梯度洗脱相对于等温洗脱更容易实现目标化合物的分离，只需调节溶剂比例即可。
3. 适用范围广：C18色谱柱可以应用于许多领域，如化学、制药、环境、食品等多个领域，对于不同类型的有机化合物都有良好的分离效果。
然而，C18色谱柱梯度洗脱也存在一些缺点：1. 装柱复杂：C18色谱柱的装柱相对较为复杂，需要进行柱床包装和固定相平衡等步骤，需要较多的时间和专业知识。
第六章梯度洗脱1，引言2，梯度洗脱的应用3，梯度洗脱的原理4，建立梯度分离5，实验问题6，梯度洗脱方法建立的总结1，引言等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变，而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的。
梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。
其中线性梯度最为常用。
2，梯度洗脱的应用常规的梯度洗脱分离适合于下列样品：（1）具有较宽k值范围的样品（2）大分子样品（3）样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。
（4）溶于弱溶剂的样品称溶液即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC 方法建立的最佳起点。
2.1 梯度洗脱用于常规分析（1）样品的保留值范围选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。
前面谱峰需用较弱流动相，而后面谱峰需用较强流动相。
采用梯度洗脱的另一个原因是，在等度洗脱条件下，k＞20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。
（2）大分子样品组分大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。
这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。
（3）晚流出组分有些样品采用等度洗脱可很好地分离，但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。
（4）增强检测灵敏度梯度洗脱可增强检测，与相应的等度洗脱分离比较，样品峰变窄约两倍（且峰高增大2倍）。
（5）稀样品溶液对于溶解于弱溶剂中稀样品，梯度洗脱可以采用在体积进样，而不会引起峰展宽。
（6）梯度洗脱的替代方法有时，即使样品保留值范围超出0.5＜k＜20，仍是采用等度洗脱较好。
用极性较强的反相柱（如氰基柱）通常可以缩小保留值范围。
极性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用，而非极性组分与其作用较弱。
对于某些样品，通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。
2.2 梯度洗脱用方法建立当对组成未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处：A，初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。
B，若等度洗脱是较好选择，初始梯度实验可为进一步实验提供最佳%B 的估计值。
若梯度洗脱更合适，则初始实验可为下一步的梯度洗脱估计出开始和终止%B的最佳值。
C，初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快（与等度分离相比），对方法建立极为有利。
D，初始梯度实验遗漏早与晚的低浓度组分的可能性不大。
（1）用等度还是梯度分离？通过谱图中标出的初峰和末峰的保留时间（tRa和tRz）确定。
保留时间差ΔtR=tRz – tRa，则比值ΔtR/tG可以决定等度分离是否可行。
最大允许k值范围为0.5＜k＜20，此时ΔtR/tG应小于0.40，也就是说，该样品保留值范围应小地梯度时间的40%。
（2）估计最佳等度条件如果实验表明采用等度条件较好，则等度实验的最佳%B值可由下表确定。
梯度分离中末峰的保留时间tRz可用于估计最佳%B值，该值在样品的等度分离中可使末峰的k值较理想。
由梯度洗脱中末峰保留时间tRz估计出的等度运行的%B（ACN）值tRz（min）等度运行中末峰k值对应的%B估计值k=5 k=10 k=205 6 0 —10 19 12 515 29 22 1420 37 30 2225 45 38 3030 53 46 3835 61 54 4640 69 62 5445 77 70 6250 85 78 7055 93 86 7860 100 94 8665 — 100 94（3）估计最佳梯度条件如果实验表明样品更适于梯度条件，可由下表估计分子量小于2000样品的初始和终止%B的最佳值。
基于初始梯度运行中的首峰和末峰的保留时间估计梯度洗脱的起始和终止%BtRa或tRz（min）起始%B 终止%B5 3 1410 11 2215 19 3020 27 3825 35 4630 43 5435 51 6040 59 6845 67 7650 75 8455 83 1003，梯度洗脱的原理梯度洗脱中，流动相强度（%B）在分离过程中逐渐增加。
也就是说随样品迁移过色谱柱中，以k衡量的样品各谱峰的保留值是减小的。
梯度洗脱的有效k值等于谱峰在柱上迁移至一半路程时的k值。
梯度洗脱中k的平均值定义为k*，与等度分离一样，它决定样品的分离度和峰宽。
不同峰的k*近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征。
因此，线性梯度色谱图中每一谱峰具有相似的峰宽。
3.1 梯度与等度洗脱等度分离中的每个谱峰在穿过色谱柱的过程中，被组成恒定不变的流动相（%B）所包围，由容量因子k衡量的某一谱峰的保留值在分离过程中保持不变。
但在梯度洗脱中，一谱峰在穿过色谱柱的过程中周围的流动相是改变的，该谱峰的即时k值也是在变化的。
另外，等度色谱图中被分离的谱峰通常具有不同的k值，而在梯度洗脱中不同谱峰的有效k值（k*）却几乎相同。
式中GS为梯度变化速率，%/min；F为流速，mL/min；Vm为柱死体积，mL。
若已知某一样品需用梯度洗脱，选择k*≈5进行初始试验较为合适，这样可以兼顾分离度、能方便检测的峰高和运行时间。
3.2 梯度变化速率的影响由于等度与梯度洗脱的相似性，较大k*值的影响应与较大k值一样：（1）k*增加，分离度Rs开始先增加，然后达到平衡；（2）谱峰伴随峰高相应减小而展宽；（3）运行时间延长。
%/min(梯度)的增加类似于%B(等度)的增加梯度k*的增加类似于等度k的增加梯度洗脱的方法建立几乎同等度分离一样。
首先优化保留值（k*），然后按需要改变选择性（α），最后可调节柱条件（N）以兼顾改善运行时间和分离度。
3.3 梯度范围的影响梯度范围指梯度起始和终止%B的差值。
初始的试探性实验可进行一次全范围梯度（即5→100%B）。
足够大的初始%B值主要影响色谱图中的前部谱峰，使它们的k*值降低；峰变窄；分离度降低。
如梯度过早结束（末峰离开柱之前），通常应增加运行时间，并使后面谱峰变宽（检测灵敏度下降）。
4，建立梯度分离梯度方法建立的步骤可总结为：（1）以等度分离的相同方式选择初始条件：色谱柱，流动相组成，流速，温度等；首次梯度试验却应采用较宽的梯度范围。
应先优化初次实验的k*，梯度变化速率不能太陡。
（2）再调节梯度范围以缩短运行时间，去除色谱图开始和结束时无用的空间。
（3）如出现谱峰重叠或运行时间太长，则需改变选择性（α）。
（4）优化峰间距后，改变柱条件以改善分离度和/或运行时间。
（5）制定平衡柱的最佳方法，并考察仪器差异对分离的影响。
4.1 选择梯度条件（1）梯度变化速率如已确定最终方法采用梯度洗脱，k*≈5是良好的首选。
选择15×0.46cm、5μmC8或C18柱、流速2ml/min较好。
通常，初次分离宜用全范围梯度：5→100%B（△%B=95）。
梯度时间tG。
（2）梯度范围如初始梯度实验条件进行（60min梯度，5→100%B；15×0.46cm柱；2ml/min；k*≈17），起始%B与终止%B的最佳值可由前表估计出。
然后进一步优化梯度范围。
初始运行之前已确定需用梯度洗脱，小分子（＜2000）最好先采用20min梯度试验。
4.2 改变峰间距在梯度洗脱中改变选择性与峰间距可通过与等度分离相同的方式实现［即通过改变k和k*（等度洗脱的%B、梯度洗脱的梯度变化速率），溶剂类型，色谱柱型，pH，HPLC方法，温度等］。
反相分离中性样品时，用于改变选择性的变量的优先次序排列为：首先是流动相强度（k*），其次是溶剂类型（乙腈＞甲醇＞THF），柱型（C8或C18＞氰基＞苯基），最后是温度。
对于离子样品，pH和温度是控制选择性的重要因素。
（1）梯度变化速率在等度分离中改变%B可使k和α发生变化；在梯度洗脱中，可通过改变梯度变化速率Gs达到相当的效果。
在梯度洗脱中改变梯度变化速率或（k*）导致α和峰间距的改变可能要比在等度分离中改变%B （k）大得多。
因此，通过改变k或k*来控制峰间距在梯度洗脱是比在等度分离中有效得多。
（2）溶剂类型改变有机溶剂为等度分离中改变选择性的一种常用手段，尤其对于中性样品。
在梯度洗脱中改换有机溶剂也可获得类似效果。
（3）其它条件梯度洗脱选择性的改变与其它条件有关（主要针对离子样品）：pH，离子对试剂浓度，温度。
4.3 调整色谱柱条件当针对参数k*和α优化了保留值以后，再改变柱长、固定柱颗粒大小和流速等柱条件，还可进一步改善分离。
等度分离中，改变柱条件对k无影响，但梯度分离k*依赖于柱尺寸和流速。
k*的恒定需保持Gs=（Vm/F）（△%B/tG）不变。
如仅改变微粒大小则不需要改变梯度时间以保持k*恒定。
5，实验问题5.1 设备对分离的影响：系统的滞留体积（1）设备差异用于梯度洗脱的仪器有两种：高压混合系统和低压混合系统。
高压混合系统在泵后（高压状态下）立刻混合A溶剂与B溶剂，而低压混合系统在泵前混合溶剂。
梯度设备的设计对分离的主要影响在于“滞留”体积（VD）。
其它条件相同时，低压混合（LPM）系统的VD值较大。
包括自动进样器在内，VD值范围一般为2~8ml，但管路安装不好的设备滞留体积值会超过10ml。
（2）不同HPLC分离效果的差异不同设备滞留体积对梯度分离时的主要影响是使样品保留时间发生变化。
增加的滞留体积相当于在梯度开始时增加的等度延迟。
由于不同HPLC系统的滞留体积不同，流动相问题可通过延长柱平衡时间加以避免。
所需的延长时间等于增加的滞留时间。
（3）减小设备滞留体积的影响因为滞留体积的差异是梯度方法在不同系统之间不能很好移置的主要原因，在方法建立步骤中有必要阐明原系统的滞留体积。
减小不同滞留体积对分离效果影响的办法有三种：第一（最好的），某些系统控制器可以在梯度开始后的精确时间进样。
如延迟进样时间tD，梯度和样品可同时到达柱进口。
第二，如梯度过程开始可插入一段等度过程，用VD值较大的系统时则可以缩短这一过程；而用VD值较小的系统时则可延长这一过程。
以此方式，样品和梯度则会同时达到柱进口。
第三，以一较陡梯度从5%B至初始%B开始。
5.2 可重现的分离（1）柱再生在梯度洗脱末尾时保持100%B或快速将梯度改变至100%B一段时间（如2~5倍体积），以便采用强溶剂来清洗柱子。
（2）柱平衡梯度洗脱中，的早期谱峰的保留值和分离效果会发生改变。
柱平衡一般需要5~10倍柱体积的初始流动相。
最好在进样和下一次梯度开始之前，用初始流动相彻底平衡色谱柱。
如不能彻底平衡柱子，色谱图中为达到柱平衡，还可以使梯度反向运行。
（3）不准确的梯度分离重现性较差也会由梯度的不准确引起。
梯度不准确更易导致不同梯度系统之间的分离产生差异，当怀疑保留时间发生变化是由梯度混合不准确所致的%B随机波动而引起时，通过避免使用储液器中的纯溶剂A和B，可降低此问题的发生。
