高分子材料的冷冻超薄切片技术

冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片原理和使用冷冻超薄切片技术是一种为了研究更接近于生物生活状态结构和功能而发展起来的电镜样品制备技术。

它是把样品进行冷冻固定后，进行超薄切片，省去了经典超薄切片法的长时间的固定、脱水和也埋等处理。

样励在切片前后，不经过强烈的化学处理，约胞结构能得到很好的保存；尤其是可溶性成分小会被抽提，使得电镜图像更接近于生物的生活状态。

可用于细胞免疫化学、可溶性成分自显影、尤其在X射线微区成分分析等研究中。

冷冻超薄切片机操作：在超薄切片机上加上高压冷冻仪冷冻附件就可进行。

冷冻超薄切片的制备程序可为两类：1.无溶液制备法：包括取材、快速冷踪、冷冻替代、切片、干燥、染色或不染色、镜检等几个步骤。

主要用于可溶性物质的放射白显影和X射线微区分析。

2.固定样品制备法：包括取材、醛类阑定、样品包埋或不包埋、冷冻保护处IR、快速冷冻切片、染包及镜检等步骤。

适用于进行形态学、细胞化学和免疫细胞化学研究。

用户经培训后取得资格可自行使用超薄切片机，使用步骤如下：1）开机2）检查是否处于切片模式，检查顶光底光是否亮度正常；3）将包埋块放入适当夹头并用六角扳手旋紧，以固定包埋块；（然后将夹头安装在修快台进行修快）；4）将夹头放入机械臂，并用手旋好螺丝上紧夹头（不可用六角扳手）；5）将玻璃刀/钻石刀安装在刀台上，用手旋好螺丝以固定刀，并注意检查刀台是否固定于底座上；6）检查刀间隙角，调整刀台角，选择适当的夹头角度等；7）设定切片窗口（上下范围）；8）对刀；9）选择所用切片速度和厚度；10）在刀槽内注水，注意水面平整；11）切片、捞片；12）关机、清理切片机，拿走个人物品，保持切片台面整洁；13）登记使用记录。

TEM,SEM,冷冻，金相四大电镜制样方法有哪些？利用电子显微镜的高分辨本领、高放大倍率等特点来分析研究物体的组织形貌、结构特征的一种近代材料物理试验方法。

但是样品制作的好坏直接关系到结果的准确，因而制作出符合要求的样品成为整个实验的关键。

TEM,SEM,冷冻，金相四大电镜制样方法有哪些？接下来，就带你了解一下吧！透射电镜（TEM）TEM放大倍数可达近百万，可以看到在光学显微镜下无法看清的0.1～0.2nm的细微结构。

其样品制备工作量很大，占整个测试工作的一半以上，甚至超过90％，十分关键。

图透射电镜样品台常用样品台分为两种：顶入式样品台和侧插式样品台顶入式样品台要求样品室空间大，一次可放入多个（常见为6个）样品网，样品网盛载杯呈环状排列，使用时可以依靠机械手装置进行依次交换。

优点：每观察完多个样品后，才在更换样品时破坏一次样品室的真空，比较方便、省时间。

缺点：但所需空间太大，致使样品距下面物镜的距离较远，不适于缩短物镜焦距，会影响电镜分辨力的提高。

侧插式样品台样品台制成杆状，样品网载放在前端，只能盛放1～2个铜网。

优点：样品台的体积小，所占空间也小，可以设置在物镜内部的上半端，有利于电镜分辨率的提高。

缺点：不能同时放入多个样品网，每次更换样品必须破坏一次样品室的真空，略嫌不便。

支撑网的选择：支撑网有多种材质如Cu、Ni、Be、尼龙等，选择时要与待分析样品的成分分开。

制备过程：制备支持膜：在铜网上覆盖一层有机膜后喷碳选择分散剂：根据样品性质选择，常用无水乙醇分散：使用超声波或搅拌将粉末分散成悬浮液液滴上支持膜（两种方法）：（a）滴样：用镊子夹持覆有支持膜的铜网，用滴管滴几滴悬浮液在支持膜上，保持夹持状态至干燥（推荐）（b）捞取：用镊子夹持载网浸入溶液捞取液滴（缺点：双面挂样制备关键和注意事项：样品粉末能否在支持膜上均匀分布确保实验过程中未带入污染物2.复型法基本原理：用对电子束透明的薄膜（碳、塑料、氧化物薄膜）把材料表面或断口的形貌复制下来的一种间接样品制备方法。

冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。

冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。

一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。

组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。

目前恒冷箱切片机的品种较多。

此种切片适用于科研和教学上的连续切片。

要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。

2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。

3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。

打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。

若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。

硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。

4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。

⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。

⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。

⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。

切片可保存于10%甲醛液中。

⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。

超薄切片机操作指南超薄切片为透射电子显微镜观察提供超薄高分子和生物材料样品的专门技术。

针对高分子和生物材料，由于电子束穿透能力的限制，必须把样品切成厚度小于100 nm，即采用超薄切片机进行切片。

一、切片类型材料的超薄切片分为两大类，一类是常温超薄切片：主要应用于一般的高分子材料；另一类是冷冻超薄切片（Cro-Ultramicrotomy）：主要应用于软材料如软塑胶和橡胶等，在低于其玻璃转变温度时进行切片（温度越低、块越硬）。

二、切片原理采用机械推进式。

即刀固定，样品每上下运动一次时向前推进一小段距离，进行切片。

特点：在设定的切削行程区间，样品以可控速度切片。

三、衡量超薄切片的质量3.1样品结构保存良好；3.2切片厚度为70nm左右；3.3切片均匀，无污染，表面无褶皱，无刀痕、无震颤及染色沉淀等现象；3.4样品支持膜耐受电子束轰击，观察时无膜的漂移和破裂现象。

四、常温切片的一般操作流程：1、包埋2、修样3、制刀槽4、装样品5、装刀6、注水7、定位8、设定参数，切片9、捞取样品10、复位11、关机4.1 包埋包埋的目的：用包埋剂支持整个样品结构，并形成特定的机械性能,以便于切片。

4.1.1 一般选用Spurr树脂环氧树脂进行包埋标准硬度的配方（试剂可以按比例增减）DMAE 聚合时间0.480.480.480.481.030.216* ERL-4221：二氧化乙烯基环，分子小，粘度低，聚合块硬度大。

*DER－736：聚丙二醇二缩水甘油醚，增韧剂，分子小，有低粘度性质，可调节包埋块硬度。

*NSA：壬烯基琥珀酸酐，一种特殊硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。

*DMAE：二甲基氨基乙醇(DMAE)，固化加速剂，使树脂混合物的使用期限延长。

调整DMAE 的量，可调整固化时间。

·Spurr树脂最终硬度可用DER－736量调节；调整固化时间，可调整DMAE的量。

4.1.2 包埋方法：前三种试剂依次称量，均匀混合后加入加速剂DMAE，再搅拌均匀，保证没有气泡。