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培养细胞透射电镜超薄切片制备方法
细胞透射电镜超薄切片是一种常用的电镜技术，用于观察细胞的超微结构。
下面是一种常用的细胞透射电镜超薄切片制备方法：
1. 细胞固定：首先，将要观察的细胞固定在适当的细胞培养基或缓冲液中。
常用的细胞固定剂有戊二醛、乙醛等，用于维持细胞内各种结构和细胞间连接的完整性。
2. 细胞架构处理：固定后的细胞经过漂洗，然后进行细胞架构处理。
根据需要，可以使用内部或外部染色剂对细胞结构进行染色，以提高细胞的对比度。
3. 细胞包埋：在细胞固定和染色后，将细胞包埋在适当的树脂中。
常用的树脂包括Epon、Araldite等。
包埋过程中需要将细胞置于特殊的盒子或管中，并将树脂逐渐浸入细胞中，使细胞与树脂充分接触。
4. 刮丝切片：包埋完成后，将树脂固化并取出样品。
使用特殊的刮丝刀在树脂块上刮下薄片。
切片的厚度通常在70-90纳米之间。
5. 超薄切片收集：收集切下的超薄切片并将其放到透射电镜网格上。
通常使用特殊的刀片或刮片将切片直接转移到网格上，然后用特殊的工具将切片平整在网格上。
6. 染色：切片通常需要染色以增加对比度。
常用的电子显微镜
染色包括乌洛托品，还可以使用其他染色剂进行后续的特殊染色。
7. 观察：将染色后的超薄切片放入透射电镜中，进行观察和拍摄。
需要注意的是，在整个制备过程中，尽量减少样品的处理时间和曝光在空气中的时间，以保证细胞结构和细胞间连接的完整性。
此外，制备超薄切片需要一定的经验和技巧，因此在进行细胞透射电镜超薄切片制备之前最好接受相关的培训和指导。
超薄切片样品制备的基本步骤
一、样品固定
超薄切片样品制备的第一步是对样品进行固定。
固定是为了使组织或细胞保持在自然状态，防止其在处理过程中发生自溶和腐败。
常用的固定方法有戊二醛固定法和锇酸固定法。
在固定过程中，要确保样品充分固定，以避免后续步骤出现问题。
二、样品包埋
固定后的样品需要用适当的介质进行包埋，以便于切片的制作。
包埋剂的选择应根据样品的性质和实验要求来决定。
在包埋过程中，要保证样品平整，无气泡，以免影响切片的制作。
三、切片制作
切片制作是超薄切片样品制备的关键步骤。
一般采用超薄切片机进行切片，得到厚度在50-100nm之间的超薄切片。
切片时要保证切片平整，无裂痕，无毛刺。
切好的切片需用蒸馏水冲洗，去除多余的介质。
四、染色处理
染色处理是为了使切片中的结构能够更好地显现出来。
常用的染色方法有免疫标记染色和重金属染色。
染色时要注意控制染色时间和浓度，以免造成过度染色或染色不足。
五、观察与成像
染色后的切片需在电子显微镜下进行观察和成像。
观察时要选择合适的放大倍数和观察条件，以便更好地观察到样品的结构特征。
成像时需注意控制曝光时间和亮度，以获得高质量的图像。
以上是超薄切片样品制备的基本步骤，每个步骤都需要严格按照操作规程进行，以保证制备出的样品质量可靠，满足实验要求。
超薄切片样品的制备
超薄切片样品的制备通常需要经过以下步骤：
1. 选择样品：选择合适的材料作为样品，可以是固体（如化合物晶体、金属等）、液体或生物样本（如细胞、组织等）。
2. 固体样品的制备：对于固体样品，首先需要进行必要的前处理步骤，如抛光、研磨等，以获得平滑的表面。
同时，为了提高样品的透明度和切片的质量，可以采用酸洗、脱脂等化学处理方法。
3. 液体样品的固化：对于液体样品，需要将其固化为固体状态，便于切片。
常用的方法包括凝胶固化、树脂浸渍、冷冻等。
4. 切片：将固体样品或固化后的液体样品切割成超薄切片。
常用的切片工具有超薄切片机、旋转切片机、电子显微镜切片机等。
5. 收集和处理切片：将切片收集并放置在载玻片或格兰一片上，进行必要的后处理步骤，如染色、封片、脱蜡等，以便于观察和分析。
简述超薄切片样品制备过程超薄切片样品制备是一种常见的实验技术，用于观察和分析生物组织的结构和组成。
下面将全面介绍超薄切片样品制备的过程。
首先，准备样品。
样品可以是动物组织、植物组织或细胞培养物等。
样品应选择新鲜、健康和具有代表性的组织。
如果是动物或植物组织，可以通过离心、选择性切割或者冰冻保存来获取。
如果是细胞培养物，应选择密集和健康的细胞。
接下来，进行固定处理。
固定处理是为了保持样品的形态结构，防止组织脱落和破坏。
通常，选择合适的固定剂，如福尔马林或戊醛，将样品浸泡在固定液中，时间一般为数小时到数天。
固定液中的一般浓度为4%到10%。
然后，进行脱水处理。
脱水处理是为了将固定后的样品从水中转移到透明质量可嵌入剂（如蜡）中。
首先，用浓度递增的酒精溶液（例如30%、50%、70%、90%、100%酒精）依次处理样品。
每一步的时间可以根据样品大小和性质来确定，一般为10到30分钟。
最后，用纯醇或乙醚等溶液进行最后一步脱水处理。
进行渗透处理。
渗透处理是将样品从脱水剂中转移到蜡中。
首先，使用浓度递增的蜡溶液（如蜡-醇混合液）进行处理。
每个浓度的时间也可以根据样品大小和性质来调整，一般为30分钟到数小时。
最后，将样品转移到纯蜡中，进行长时间浸泡以保证充分的渗透。
接下来，进行包埋处理。
将样品放入包埋盒中，加入熔化的蜡，使样品完全包裹其中。
然后，用冷却水或冷却平台使蜡固化，通常需要数小时到数天时间。
最后，将固化的蜡块从包埋盒中取出。
最后，进行切片处理。
先用蜡切片机将蜡块切割成适当大小的切片。
然后，将切片浸泡在加热的水中，蜡会溶解，使切片从蜡中解脱出来。
最后，将解脱后的切片转移到玻璃载玻片上，并用热盖玻片使其固定。
通过以上步骤，就可以得到超薄切片样品。
这些样品可以用于光学显微镜、电子显微镜等技术的观察和分析。
制备超薄切片样品的过程繁琐，需要耐心和细心操作，但是它对于研究生物组织结构和功能具有重要的指导意义。
1 玻璃刀(glass knife) 與刀口水槽(trough) 製作玻璃刀需於切片當天製作，請於切片當天預留0.5-1 h。
方法步驟：1)首先取一乾淨的玻璃條，粗造面朝下(由玻璃條側面觀之)。
利用製刀機將玻璃條(glass strip) 切割成一英吋大小的正方形，再由對角線(約略偏斜) 切割一裂痕，自兩側及底部加壓使玻璃斷裂為二即成。
理想的刀口應呈現平整均勻，在解剖顯微鏡下無鋸齒狀缺刻(圖1.5.1)。
施加壓力於經鑽石刀劃過的玻璃條時，需慢慢的添加壓力。
當切口出現一半月型的陰影或白影(視觀察角度而定)時，即停止繼續增加壓力，使切口自行持續擴大至斷裂。
經此過程做出的玻璃刀有較佳的品質。
圖1.5.1 玻璃刀的製作(A) LKB700製刀機。
(B) 利用製刀機上的鑽石刀在玻璃條上略做切割。
(C) 旋轉製刀機右側旋鈕，自玻璃條兩側及下方均勻施加壓力，使其斷裂。
(D) 及(E) 每一正方形玻璃條可製作2把玻璃刀，每把刀各自有刀鋒及刀座。
第一把刀的刀鋒恰好緊鄰第二把刀的刀座。
(F) 製作完成的玻璃刀可以在顯微鏡下檢查刀鋒部分，理想的刀鋒應為平滑無缺刻。
整把刀最適合切片的部分為Z區，約佔1/3；S區不用於切片；而E區的使用需視刀鋒的品質而定。
(圖片A-C, E取自生物電子顯微鏡學, 圖片D, F取自Methods of Preparation for ElectronMicroscopy, An Introduction for the Biomedical Sciences)2)將銀膠帶的一端貼於刀口下方並與底部平行後，另一端圍繞成一平滑的弧形貼於另一側，圈出一船型水槽。
過程中勿用手接觸用以形成水槽，帶有黏性的膠帶面，以免將手上的油脂黏於其上(圖1.5.2 A-B)。
3)以刀片沿玻璃將多餘的膠帶切除，然後於水槽下緣與玻璃刀接觸面以蠟或指甲油封合，避免水滲漏(圖1.5.2 C)，待乾燥後即可使用。
圖1.5.2 刀口水槽的製(圖片取自生物電子顯微鏡學)2、樣品塊修整(trimming)包埋完成後的樣品塊須先經過修整，將樣品塊尖端修整成適當的大小及形狀,並將要觀察的部份露出。
简述电镜超薄切片制作技术及其在植物细胞生物学中的应用举例。
摘要：一、电镜超薄切片制作技术简介1.超薄切片的定义与制作过程2.微型振荡器在超薄切片样品制备中的应用二、电镜超薄切片在植物细胞生物学中的应用举例1.观察细胞结构与组成2.研究细胞分裂与生长3.分析细胞功能与生物学意义正文：一、电镜超薄切片制作技术简介电镜超薄切片制作技术是一种将生物组织或材料制成厚度在几十纳米到几百纳米之间的薄片，以便于在电子显微镜下进行观察和分析的方法。
超薄切片的制备过程主要包括固定、脱水、透明、浸透和切片等步骤。
在制备过程中，微型振荡器发挥了重要作用，可以实现样品的精细切割和均匀分布，从而提高切片质量。
1.超薄切片的定义与制作过程超薄切片是指厚度在几十纳米到几百纳米之间的切片。
制作过程通常包括以下几个步骤：（1）固定：将生物组织或材料固定在载网上，以便于后续处理。
（2）脱水：通过逐渐升高温度，将组织中的水分挥发掉，以利于透明处理。
（3）透明：采用透明剂使组织变得透明，以便于在电子显微镜下观察。
（4）浸透：将组织浸入树脂或其他包埋材料中，使其充分渗透，增加切片的稳定性。
（5）切片：采用微型振荡器或超声波切割器将组织切成均匀的薄片。
2.微型振荡器在超薄切片样品制备中的应用微型振荡器在超薄切片样品制备过程中发挥了重要作用。
首先，微型振荡器可以实现样品的精细切割，提高切片的质量和均匀性。
其次，微型振荡器可以实现样品的均匀分布，确保制备过程中各个切片的一致性。
最后，微型振荡器可以减少人工操作的误差，提高切片制备的效率。
二、电镜超薄切片在植物细胞生物学中的应用举例电镜超薄切片技术在植物细胞生物学中有广泛应用，主要包括以下几个方面：1.观察细胞结构与组成通过电镜超薄切片技术，可以清晰地观察到植物细胞的细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质等结构，以及各种细胞器和细胞内组织的组成。
这有助于研究植物细胞的形态、结构和功能。
2.研究细胞分裂与生长通过观察超薄切片中的细胞分裂过程，可以了解植物细胞在分裂和生长过程中的形态变化和细胞器重塑等现象。
制备肾脏扫描电镜超薄切片
内蒙古医科大学病理学与病理生理学孙微2013110051
制备肾脏扫描电镜超薄切片的步骤如下：
1、取材
材料：动物，雄性SD大鼠1只，大鼠体质量在300g左右。
方法：10%水合氯醛（0.5ml/100g）腹腔注射麻醉成年大鼠；取右侧卧位，腹膜后暴露分离出肾脏组织；用预冷的双面刀片从肾脏皮质部位切取
2mm×2mm×1mm的组织块。
2、固定
固定剂：2.5%戊二醛、2%四氧化锇水溶液
方法：将切取下来的组织块放于盛有2.5%戊二醛溶液的带盖小玻璃瓶中；
然后将该小瓶使用振荡器持续震荡4h；
再将组织块放于盛有2%四氧化锇溶液的带盖小瓶中，继续用振荡器震
荡1.5h。
注意：由于四氧化锇易使组织变脆，故组织块固定时间不宜太长。
3、脱水
脱水剂：乙醇
方法：将固定好的组织块依次放入分别盛有浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100% (2次) 酒精的带盖小瓶子中，并使用振荡器震荡，每步脱
水时间为15 min。
注意：换液时，动作应迅速，切勿使样品暴露于空气中过久，以免自
然干燥,使组织收缩、脆裂。
4、透明
透明剂：二甲苯
方法：将组织块完全浸没于盛二甲苯的袋盖小瓶中，1:1浸透，使用振荡器震荡。
冬季置37℃温箱，夏季室温即可，浸透应振摇，目的是使透明剂
能完全地置换出残余的脱水。
5、浸蜡
试剂：环氧树脂Epon812
方法：将透明好的组织块放入盛有环氧树脂Epon812的容器中，20min。
6、包埋
包埋剂：环氧树脂Epon812
方法：将浸蜡好的组织块放于盛有环氧树脂Epon812的包埋器中，注意不要盖住标记；再注入包埋剂，将组织块完全浸没。
再将包埋器置于37℃温箱，24h。
7、切片
制备玻璃刀。
用单面刀片去除多余的树脂,将样品团块暴露出来，修成合适的形状和大小；
将修好的组织块装在LKB 超薄切片机上，注意方向；
换上新制的玻璃刀，加双蒸水于刀槽内，吸出弃去；
注入双蒸水，调出最大亮区，自动切超薄片约60nm。
注意：国产制刀机制作的玻璃刀，中部刀刃锐利,切片一般无刀口。
此过程虽
因换刀、洗水槽稍花费时间,但由于新刀的刀锋未损伤,所以能一次切出完好、无刀口、非常洁净的大超薄片,可提供较大的观察范围。
由于超薄切片平铺于铜网上的面积大，并能耐受电子束轰击,因此铜网就无需制备Formvar 膜来承载切片。
此法既省去了制膜这一程序，又消除了膜过薄、过厚或产生气泡、皱折、本底污染等因素，使样品的超微结构在电镜观察下更清晰。
8、染色
配制Reynolds 铅染液。
柠檬酸钠与硝酸铅充分反应，经过持续振摇片刻后, 放入超声波仪中助溶, 并分3～4次加入新配1 mol/L 的NaOH液, 边加液边调pH为12。
关键在超声波中助溶的实际作用时间不超过1min, 以免瓶内空气中的二氧化碳与铅离子在超声波作用下快速形成碳酸铅沉淀而使染液变浑浊。
配好的铅染液, 再用孔经2.2µm微孔滤膜快速过滤，表面加少许液体石蜡隔绝空气。
另外, 要用分析纯NaOH, 以减少其碳酸根离子含量。
9、透射电镜观察
①图系在低倍镜下观察，示肾小球、肾小囊和泌尿小管。
②图系高倍镜下观察，示足细胞胞体。
③图系高倍镜观察，足细胞胞体及其伸出的各级突起。
（图片来源：崔芳，乔君，王一，王丽.制备肾脏扫描电镜样品的技术方法改良[J].
河北医科大学学报：技术方法，2012,33（3）：357-359）
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7.应国华主编.电镜技术与细胞超微结构.香港：香港现代出版社,1993.30,50。
