电镜技术及超薄切片技术

3、位置选择：如果以研究支气管粘膜或研究肺动 脉为主的（这里指肺内的支气管），尽量取材于 靠近肺门部位。如果主要研究肺泡上皮细胞、终 末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构 等，建议取材于肺叶靠近胸膜一侧或者肺尖部。
肾组织取材法
１、灌注固定或浸泡固定（主要是肾穿刺活检）
２、位置选择：根据需要切取皮质或髓质进行观 察。动物肾组织取材要注意的是，一要取材位置 选择在肾的上极，二要准确判定皮质与髓质的位 置，如果是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾 最外层组织取下来即可，这里一般都会有肾小球 存在。一般要求切长条形。
透射电镜样品制备(包埋块制作）操作流程：
取材——漂洗（生理盐水）——前固定（2.5% 戊二醛，4ºC冰箱2小时以上）——漂洗（0.1M 磷酸 缓冲液，3次，45分钟）——后固定(1%锇酸1小时左 右）——漂洗（0.1M 磷酸缓冲液，3次，45分 钟）——块染（1%醋酸铀2小时）——梯度脱水 （50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟， 100% 2次，各10分钟）——浸透（丙酮：包埋液=1： 1，37 ºC烘箱2小时；丙酮：包埋液=1：4， 37ºC烘 箱过夜；纯包埋液45ºC烘箱2小时）——包埋聚合 （45ºC烘箱3小时，65ºC烘箱48小时）
辅助系统
1、真空系统：低真空 高真空
2、供电系统：1）高压电源 2）磁透镜激励磁电源 3）辅助电源
3、水冷系统 4、气动系统
透 射 与 扫 描 电 镜 原 理 图 解
扫描电子显微镜工作原理及结构
通过极细的电子束扫描射击标本表面而 激发出二次电子或产生反射电子，并通 过一定途径被接收到阴极射线管而成像。
（1000KV)的点分辨率可高达0.001nm。
电镜基本类型
一、透射式电子显微镜 二、扫描式电子显微镜 三、根据电子枪发射方式不同，
可分为热阴极电子枪和场发射电子枪。 四、其他
（冷冻或低温电子显微镜、高压或超高压电子显微镜、分析
电镜、扫描隧道显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子 显微镜、原子力显微镜、环境扫描电子显微镜等约几十种不 同类型电镜）
骨组织取材方法
• 取小块骨片（1～2mm大小），先用2.5%戊二醛固定2小 时，磷酸缓冲液漂洗2次，再将骨片浸入脱钙液进行脱钙 处理，视脱钙效果而定脱钙时间，如用EDTA脱钙液，大 约3天时间，主要视组织块是否变得柔软。软骨组织一般 直接固定，不需要脱钙处理。
皮肤组织取材方法
• 皮肤组织一般观察表皮细胞及部分固有层结 构，取材以长条形为主，长约1.5mm,横径在 0.5mm-1.0mm,包括表皮全层细胞及部分固有 层（依据上文定向取材图示处理），表皮是 复层鳞状上皮层，无血管分布。真皮部分位 于表皮深面，主要由胶原纤维和弹性纤维交 织构成，并含有从表皮陷入的毛发和腺体， 以及从深层来的血管、淋巴管、神经及其末 梢，一般不需要定向取材，但要注意位置的 准确。
瑞利准则：
光线通过二个比较 靠近的小孔时，这二个 小孔的衍射图会重叠在 一起。当一个衍射图的 中央亮斑正好落在另一 个衍射图的第一暗环中 心时，这二个点刚可以 分辩。这就是显微镜分 辩本领的 瑞利准则。
什么是电磁透镜？
由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用，因而可 以得到电子光学像。我们称这种具有轴对称弯曲磁场装 置构成的电子透镜为电磁透镜（electron magnetic lenses）。由于电磁透镜磁场非均匀分布，物、像点在 磁场之外，电子在磁场中既受到轴向分量的作用，又受 到径向分量的作用，使平行于轴进入磁场的电子束可获 得聚焦。
反差
• 人的眼睛在区分物体时，主要根据物体不同部位或物体之 间的光强度与波长的差别，这些差别构成了物体的反衬度， 又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。
• 由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同，疏密度不同， 它们散射电子的能力也各不相同，散射电子能力强的地方， 显现为暗像；相反，散射能力弱的地方，显现为亮像。因 此，在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定 反差的荧光图像。
外周神经纤维的取材方法
• 脊椎动物的外周神经系统包括由脑发出的脑神经和由脊髓 按节段性排列发出的脊神经。按所联系的器官不同，可分 为躯体和内脏两大类，每一类又可按照传导兴奋的方向不 同而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时，应先 分离掉包裹神经的神经外衣，再分离出所要研究的神经。 如果神经纤维直径在1mm以内，可直接切成1.5mm长条 形即可，如果直径较大，则一分为二，同样切成长条形。 需要注意的是，在包埋的时候必须定向包埋，纵横方向都 要包埋。
动性“的假说，并计算出电磁波长为0.005nm. 1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或
磁场中偏转聚焦的现象。
1928—1931年间，德国的Ruska成功研制了世界上第 一台真正的电子显微镜，放大倍数为1200倍。
20世纪50年代初到60年代末期，电镜分辨本领得到大 幅度提高，达到1nm左右，到80年代的点分辨率 已接近0.1nm，最新研制的超高压透射电镜
标本取材方向及大小示意图
双刀切割法
• 常见脏器的取材简介
睾丸组织取材方法
１、灌注固定
2、注射固定
3、浸泡固定
4、位置选择：要观察生精细胞或支持细胞， 取材于睾丸的睾丸网部位，大鼠与小鼠的睾丸 网比较表浅，就在白膜下附近。如果要观察成 熟精子，最好取材于附睾的尾部，此处精子已 基本成熟，而且精子密度最高。
电镜室现有设备
1、H-7500型透射电镜，购于2004年，最大点分辨 率为0.24nm,有效放大倍数达60万倍。 2、S-3000N型扫描电镜，购于2004年，有效放大 倍数达30万倍。 3、辅助设备：Tome-Power XL超薄切片机，零界 点干燥仪，离子溅射仪等。
1924年，法国Broglie提出了“电磁波与光一样，具有 波
D=
当光的波长为 λ= 500nm = 0.5μm 介质折射率 （油） = 1.5 物体与物镜所形成夹角的半数 α<90º
央亮斑的半径 D = 200nm = 0.2μm
1、人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两 点。
油镜最小能分辨0.2 μm的两点。 则油镜理论最大放大能力为：
0.2mm / 0.2 μm = 1000（倍） 2、假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,则其理论 放大倍数为：0.2mm / 0.1nm = 2x106 3、H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm,则 其理论放大倍数为：0.2mm / 0.24nm = 0.83x106。而其有效放大倍数为 0.6x106
透射电子显微镜
光源 聚光镜 样品 物镜 投影镜 最终象
光学显微镜
透射电子显微镜的原理和结构
• 光的衍射现象： 由于光具有波动 性，当光线通过小孔 或小孔光源经光学系 统成象会产生衍射。 其图案是:中央部分一 个亮斑，在其周围有 明暗交替的圆环。
2D
显微镜的分辨本领
显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮 斑半径 D（分辨能力）大小来决定的即
３、定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组 织的矢状面）作为切面方向，这样可以很好地观 察神经元细胞核、轴突以及树突结构的变化，突 触以及毛细血管的结构也比较容易见到。
肺组织取材法
１、灌注固定 2 、浸泡固定：
载玻片挤压法：将组织放在载玻片上，并将 固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上 面并轻轻挤压。
扫描电镜由两个主要部分组成： 探查系统和显示系统
一、探查系统：由电子枪、电磁透镜组成。
二、显示系统：电子检测器，闪烁器， 光电倍增器以及显示屏组成。
二、 透射电子显微镜样品制备
(1) 超薄切片技术
电子束的穿透能力一般较弱，大多数 标本无法直接在电镜下观察，必须把样品 切成厚度为 10—1000nm 的薄片。我们把切 片厚度小于100nm的薄片称为超薄切片，是 电镜观察生物样品常用方法之一，常用厚 度为50-100nm。
• ②像散：由于透镜的磁场强度在纵向或横 向上不同，以致纵向与横向上的射线聚焦 于光轴的位置也有上有下，两者共同形成 一个最小模糊像。
• ③色差：由于电磁波长随加速电压而变化， 当加速电压不稳定时，电子束波长就可变 异，因而发生类似的像差。
• ④畸变：由于离轴较远处的径向磁场的作用力强， 使放大倍数随物点离轴的距离而变化，进而使图 象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、 桶形畸变和S形畸变等，如图所示：
胃肠道取材法
剖开胃肠道腔，暴露出粘膜面，用PBS或生 理盐水浸洗内腔，尽量清洗干净，但注意保护好 粘膜面以免损伤，然后剪一段组织进行修块。 具体做法如下：沿着胃肠道纵轴和横轴各切几条 长约2毫米，宽约1毫米的长条形组织，尽量包括 粘膜全层结构，以直接浸泡固定方法为宜，注意 保护粘膜层细胞免受人为损伤。各实验组选取部 位尽量在法
• 胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。胰 腺一般观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管 细胞，胰岛主要分布在胰尾部位，胰体部 位较少，腺泡及导管基本存在于胰体内， 容易观察。组织可以直接浸入固定液内固 定。值得注意的是，由于胰腺腺泡内酶原 颗粒较丰富，容易引起细胞自溶，取材时 要尽量快速取材以免细胞自溶影响结果。
肌肉的取材方法
• 每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官，有丰富 的血管、淋巴管分布，在躯体神经支配下收缩或舒张，进 行随意运动。肌肉具有一定的弹性，当外界刺激较激烈的 情况下，肌肉往往出现痉挛现象，因此，切取肌肉组织后 应先浸泡在生理盐水或磷酸缓冲液中，等肌肉恢复自然常 态后再取材，纵横方向都要取，以长条形为主，大小约 1*1*1立方毫米，然后浸入固定液内进行固定，需要注意 的是，在取心肌的时候应取在心尖部位，在包埋的时候必 须定向包埋。
肝组织取材法
1、灌注固定法 2、浸泡固定法
动物经麻醉后打开腹腔，暴露出肝脏，选取一 片肝小叶（如左小叶），先用细线扎紧小叶间 连接部位防止出血，接着用手术剪剪下这片小 叶组织放在滴有固定液的蜡板上进行修块，切 成1立方毫米大小即可。