凝胶过滤色谱

一、实验目的1. 了解凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography，GFC）的基本原理和操作方法。

2. 掌握凝胶过滤色谱在分离、纯化蛋白质等生物大分子中的应用。

3. 通过实验验证凝胶过滤色谱的分离效果。

二、实验原理凝胶过滤色谱是一种根据分子大小进行分离的技术，其基本原理是利用凝胶的分子筛特性。

凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶时，分子大小不同的物质会被不同程度地阻滞在凝胶孔隙中，从而实现分离。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品：牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）、酵母提取物（Yeast Extract）- 凝胶色谱柱：Sephadex G-75- 缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 标准分子量蛋白质：分子量分别为6.5×10^4、1.4×10^5、2.0×10^5、4.0×10^5、6.0×10^5的蛋白质混合物2. 实验仪器：- 凝胶色谱仪- 超速离心机- 荧光检测器- 移液器- 离心管- 吸管四、实验步骤1. 准备凝胶色谱柱：将Sephadex G-75凝胶柱安装在凝胶色谱仪上，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）平衡凝胶色谱柱，使其达到稳定状态。

2. 准备样品：将标准分子量蛋白质混合物、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白和酵母提取物分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制成蛋白质溶液。

3. 上样：将蛋白质溶液加入凝胶色谱柱，使样品在凝胶色谱柱中均匀分布。

4. 流动：打开凝胶色谱仪，以一定流速（如1 mL/min）进行洗脱，收集洗脱液。

5. 分析：将收集到的洗脱液进行检测，记录蛋白质的洗脱峰，并分析其分子量分布。

6. 离心：将洗脱液中的蛋白质进行离心，分离出蛋白质沉淀。

7. 质量分析：将蛋白质沉淀进行电泳、质谱等分析，验证其纯度和分子量。

五、实验结果与分析1. 凝胶过滤色谱洗脱曲线：通过凝胶色谱仪收集洗脱液，绘制洗脱曲线。

凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。

凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。

化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。

凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。

它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。

今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。

一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。

它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。

3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。

它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。

二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。

2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。

3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。

而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。

三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。

而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。

四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。

在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。

我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。

总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。

这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。

凝胶过滤色谱操作规程Gel Filtration Chromatography仪器型号：Lc-10ADVP仪器厂商：日本岛津公司SHIMADZU启用日期：2005.3仪器组件：泵Lc-10ADvp、示差检测器RID-10A、控制器SCL-10Avp、柱温箱CTO-10ASvp可测项目：①适合水溶性物质（如蛋白质、多肽、多糖、DNA、RNA、水溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子等）的分离和定量分析②水溶性多组份体系的分子量分布测定。

测试步骤：TSK 2500柱子，分子量测试范围3万以下。

TSK 4000柱子，分子量测试范围百万以下。

1．实验准备：换流动相瓶中水，超声10min赶走气泡，检查废液瓶等。

2．开稳压电源、电脑，打开仪器四组件的电源开关（检测器2500柱子开紫外，4000柱子开示差RID）。

3．赶气泡（一般更换流动相后需要赶气泡），打开泵的排液阀（逆时针旋转180度），（此步骤非常重要！）按LC-10AD面板上的purge键冲洗泵并赶气泡，等purge自动停止后（观察排液管中无气泡跑出），关闭排液阀（顺时针旋转180度），此过程一般需几分钟。

4．开启软件CLASS-VP，点击Instrument 1进入控制界面，在LC Setup Assistant-System页面点击组件图块，在跳出的Instrument Setup界面上编辑方法，主要是设置流动相流速、柱温箱温度和运行时间，设置完毕保存方法（一般不需修改，使用原来方法即可）。

点击快捷键Instrument on，使用该方法控制仪器。

5．示差检测器：点击快捷键RID R.flow on，等10min后再次点击RID R.flow off（即按钮弹起），再过10分钟，点击Balance RID（平衡示差检测器），注意整个流路的压力值（泵组件上的示数），与记录本上前一天的压力值对比（如压力值变化大，可能要清洗流路）；紫外检测器：没有此步骤6．等炉温升到40℃，界面“ready”后走基线。

凝胶过滤色谱名词解释凝胶过滤色谱(gelselution column chromatographic technique)，是一种新型分离技术。

凝胶色谱柱以亲水性高分子凝胶为固定相，利用凝胶良好的吸附、分子筛特性及表面活性等特点将待分离组分吸附在固定相表面上。

凝胶可分为亲水性高分子凝胶与疏水性高分子凝胶，前者为大孔、多孔网状凝胶，后者为微孔、无定形网状凝胶，由于孔径不同，对流动相中不同极性物质有不同选择吸附力，可使极性或非极性物质实现分离。

当样品中混杂的组分经柱子传输至检测器时，样品中组分首先被凝胶中的疏水性成分所吸附，凝胶中的亲水性成分随后被流动相中的流动相携带通过凝胶颗粒间隙向检测器移动，并将其分离。

分析时将被测组分和内标一起加入到样品溶液中，样品中的待测组分会被凝胶中的亲水性成分所吸附，然后样品中被吸附的组分随着流动相向检测器移动，被内标识别并解吸下来，从而得到待测组分的含量。

凝胶过滤色谱的分离机理主要包括吸附和洗脱两个阶段。

吸附过程是在固定相表面发生的。

在这个过程中，柱中的溶剂可能会进入凝胶中，因此样品中的组分被吸附到凝胶颗粒的表面上。

这些固定相颗粒都有各自的孔隙结构，它们的表面积比较大，有利于吸附。

在凝胶吸附过程中，除了样品溶液本身的极性外，溶剂的极性也是吸附过程发生的必要条件。

同时，由于凝胶是高分子材料，因此在受到搅拌作用时，凝胶中会形成较大的内部和外部剪切应力场，这就有利于保证吸附过程的正常进行。

洗脱过程是当样品溶液通过凝胶柱后，由于凝胶的吸附作用，样品溶液中某些组分可能会留在凝胶上，从而影响了后续流动相的吸收，导致浓度信号减弱或消失，这就需要在适当的位置加入流动相把这些“逃逸”的组分重新吸引到柱子上来。

如果不考虑流动相的洗脱能力，则要求样品溶液中被吸附的组分具有较强的洗脱能力。

实际工作中，加入足够量的流动相将样品溶液洗脱下来，是保证仪器稳定运行的关键步骤之一。

所以，要达到好的分离效果，就要选择适合的流动相，且适宜的洗脱条件，但这还远远不够，还需要有好的柱设计，即凝胶色谱柱的理论模型。

简述凝胶过滤色谱分离蛋白质的原理
凝胶过滤色谱分离蛋白质是一种非常有效的高精度蛋白质分离方法，它是在现代生物分子技术领域中被广泛应用的工艺。

它可以有效地去除病毒、抗原和多种其他污染物，提高生物系统的纯度，可用于药物研究和药物开发等多个领域。

凝胶过滤色谱分离的原理依赖于对蛋白质的分子大小，电荷和结构的分析，同时还依赖于凝胶纤维的物理属性。

在凝胶过滤色谱分离中，首先从样品中取出溶液，然后将其稀释到分离质谱仪中，在垂直于样品流动方向的静止盒子中加入预处理凝胶，并同时在样品流动路径上安排一个保护液池，同时将流动的样品溶液在冷却管中静止，使样品溶液内的蛋白质和病毒分子在凝胶纤维中逐渐凝结，形成稳定的聚集体。

经过特殊分离处理，污染物聚集体从凝胶中移出，而相应的蛋白质分子保留在凝胶内。

经过特定条件的改变，聚集体不断游离，并以不同的速度由凝胶移出，形成一条梯度图，不断改变分离系统的压力和温度，可以有效地改变梯度图的形状，以实现最佳的分离效果。

最终的分离结果可以非常清晰地显示出蛋白质的迁移路径。

分离结果可以用于分析蛋白质的数量和结构，也可以用于药物的研发和临床应用的评估。

因此，凝胶过滤色谱分离法是一种高精度、有效的蛋白质分离方法，可用于从样品中有效地提取蛋白质，具有很强的应用价值。

它不仅可以有效地滤除污染物，提高蛋白质质量，而且能够有效掌握蛋白
质的结构和组成，为药物研究和药物开发提供了灵活的分析工具，为科学家和医学界提供帮助。

总之，凝胶过滤色谱分离蛋白质可以有效提取高纯度的蛋白质，且具有高精度的分离能力，是现代生物分子技术研究中不可缺少的生物分子分离手段。

活性蛋白整体方案凝胶过滤色谱摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。

基本原理凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。

其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。

当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。

凝胶过滤色谱原理通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。

常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。

高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。

选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。

实验方案设计1.凝胶介质的选择凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。

比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果活性蛋白整体方案是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。

具体凝胶过滤色谱介质应用如下：常用凝胶过滤色谱介质的分离范围凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose6B Sepharose4B1~51.5~304~1505~60010~400060~20000Sepharose2BBio-Gel P-4Bio-Gel P-10Bio-Gel P-60Bio-Gel P-150Bio-Gel P-30070~400000.5~45~1730~7050~150100~4002.凝胶介质的预处理凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。

不同多肽分子量占比测定方法凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography）是一种常用的分
子量分析方法，可以用于测定不同多肽分子量的占比。

具体操作如下：
1. 准备凝胶柱：选择合适的凝胶颗粒，如琼脂糖（sephadex）等，根据待测样品的分子量范围选择合适的孔径大小的凝胶柱。

2. 将凝胶柱装置到色谱仪中，并进行平衡：用合适的缓冲液对凝胶柱进行平衡，使凝胶颗粒充分膨胀。

3. 样品加载：将待测多肽样品溶解在适当的样品溶液中，并将其加载到凝胶柱上。

4. 进行洗脱：通过缓冲液缓慢地通过凝胶柱，大分子会在凝胶中占据较大空间，通过速度较快；而小分子则可以渗透凝胶，速度较慢。

5. 捕集洗脱的组分：在洗脱过程中，收集不同组分随时间洗脱下来的分画，并进行进一步分析。

6. 分析各分画：可以通过比色法、荧光法、质谱等方法对分画进行分析，确定不同多肽组分的分子量占比。

需要注意的是，凝胶过滤色谱仅能提供相对分子量的信息，不
能确定具体的分子量数值。

为了准确测定不同多肽分子量的占比，还需要结合其他实验技术进行分析。

凝胶过滤色谱原理
凝胶过滤色谱是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。

它基于样品分子在凝胶基质中的大小排列来实现分离。

在凝胶过滤色谱中，通常使用多孔度不同的凝胶基质，如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

这些凝胶基质具有规则的孔隙结构，可以限制分子在凝胶中的自由扩散。

较大的分子将被阻挡在孔隙之外，而较小的分子则能够进入凝胶内部。

样品通常在一定浓度的缓冲液中进行注入，缓冲液的选择要使得待分离的分子稳定、水溶性好。

样品溶液在凝胶表面形成一个样本区，然后逐渐渗入凝胶内部。

在样本渗入过程中，凝胶基质将限制大分子的运动，使其停留在凝胶表面或孔隙之外，而较小的分子能够进入凝胶内部，逐渐向凝胶深处扩散。

最终，分子根据其大小在凝胶中被分离成不同的区带。

较大的分子留在凝胶的近表面区域，而较小的分子则可以进入凝胶离凝胶表面较远的区域。

因此，在从凝胶中洗脱样品时，先洗脱出较小的分子，然后依次洗脱出较大的分子。

凝胶过滤色谱广泛应用于生物大分子的纯化和分析。

它可以用于分离蛋白质、核酸、多肽等生物大分子，并且对样品的体积要求较小。

同时，凝胶过滤色谱的操作相对简单，且不需要高压。

因此，它成为了生物化学和生物制药领域中不可或缺的技术之一。