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凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶层析的原理基于分子在固定凝胶柱上通过孔隙的能力。
凝胶是由交联的聚合物构成的，形成了许多孔隙，这些孔隙的大小和分子的大小具有相关性。
分子大小较大的物质将难以进入凝胶孔隙内，流速比较快，从而在柱体积内快速通过，出现在柱体积较大的位置；而分子大小较小的物质则能够进入凝胶孔隙内，流速比较慢，从而在柱体积内停留更长时间，出现在柱体积较小的位置。
凝胶层析的柱层结构是由一段硬基质构成，上面带有孔隙性的功能性聚合物层。
功能性聚合物的孔隙大小可以根据需要而定，常见的为分子质量在1000道尔顿到几十万道尔顿之间的分离。
当样品在凝胶柱上通过时，较小的分子能进入到凝胶层的孔隙内，流速较慢，溶液逐渐扩散。
而较大的分子无法进入到孔隙内，流速较快。
因此，凝胶层明显的区分了分子的大小。
在凝胶柱中选择的凝胶颗粒可以根据目标物质的分子量范围和理化性质进行选择。
通常使用的材料包括葡聚糖、琼脂糖、琼脂糖琼脂、琼脂糖琼脂纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料的孔隙大小和梯度能根据需要进行调整，以实现对样品分子的精确分离。
在进行凝胶层析的过程中，凝胶柱首先需要经过预处理，以去除杂质和活性剂。
样品可以直接在预处理后的缓冲液中加载到凝胶柱上，并在适当的流速下通过。
样品分子会在凝胶柱中发生分配，分子量较大的物质会穿过凝胶颗粒的外层，较小的分子则进入凝胶颗粒孔隙内。
这样，在整个流程中分子会逐渐分离并收集在柱底。
1.相对于其他层析技术，凝胶层析是一种非毒性和温和的技术，对生物大分子的分离影响较小。
2.凝胶层析具有良好的分辨率和高效率，可以实现对不同分子大小物质的分离。
3.凝胶层析可以在无需进行特殊环境条件下进行，如室温和常压。
4.凝胶层析可与其他分离技术如亲和层析、离子交换层析等相结合，实现更精确的纯化和分离过程。
总结起来，凝胶层析是一种基于分子大小的层析技术，通过凝胶柱的孔隙大小来实现分离物质的纯化。
它是一种相对简单且温和的分离方法，适用于大多数生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
进行脱盐、去热源和脱色。
原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。
之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的葡聚糖珠固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品流动相大分子分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
凝胶过滤与分配层析一、凝胶过滤凝胶过滤是一种基于分子大小不同的分离技术，通过将样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子，根据分子大小不同，样品中的组分被分离。
凝胶颗粒的孔径可以控制，从而可以选择性地保留或排除特定大小的分子。
凝胶过滤主要用于蛋白质、DNA等生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理是：样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子时，分子较大的物质由于不能进入凝胶颗粒的微孔而被排斥在外，最先流出柱子；而分子较小的物质则能进入凝胶颗粒的微孔，从而被滞留在了柱子的内部。
随着淋洗液的不断流过，小分子物质会逐渐被带出柱子，而大分子物质则被不断洗脱。
凝胶过滤的应用领域广泛，如生物制药、生物化学、分子生物学等领域。
它是一种简单、快速、有效的分离方法，尤其适用于分离大分子物质。
然而，凝胶过滤的分离效果受多种因素影响，如样品浓度、柱子的长度和直径、淋洗液的性质等。
二、分配层析分配层析是一种利用样品中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同的原理进行分离的技术。
样品溶液通过装有固定相和流动相的层析柱时，各组分在两相之间进行分配。
由于不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此它们在层析柱中的移动速度也不同，从而达到分离的目的。
分配层析的原理是：样品溶液中的各组分在固定相和流动相之间进行分配，根据其在两相之间的分配系数不同，其移动速度也不同。
固定相是层析柱中的固体部分，流动相则是通过层析柱的液体部分。
样品溶液通过层析柱时，组分会根据其分配系数在两相之间进行动态分配，从而实现分离。
分配层析的应用领域广泛，如化学、生物化学、药物化学等领域。
它具有分离效果好、分辨率高、操作简单等优点。
然而，分配层析的分离效果受固定相和流动相的性质、层析柱的长度和直径等因素影响。
三、固定相和流动相在凝胶过滤和分配层析中，固定相和流动相都是影响分离效果的重要因素。
固定相是层析柱中的固体部分，用于吸附样品中的组分；流动相则是通过层析柱的液体部分，用于将组分从固定相中洗脱出来。
凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种分离和纯化生物大分子的常用方法。
它基于生物大分子在凝胶柱中的分子大小和形状的不同而进行分离的原理。
凝胶过滤层析的原理和操作步骤将在下文中进行详细介绍。
首先，我们来了解一下凝胶过滤层析的原理。
凝胶过滤层析的分离原理是基于生物大分子在凝胶柱中的分子大小和形状的不同而进行分离的。
凝胶柱由一种多孔的凝胶材料构成，这种凝胶材料能够形成一个三维的网络结构，生物大分子可以在这个网络结构中进行筛选。
较小的生物大分子可以进入凝胶的孔隙中，而较大的生物大分子则无法进入孔隙，因此在流经凝胶柱时，较小的生物大分子会被凝胶柱滞留，而较大的生物大分子则会通过凝胶柱。
这样就实现了生物大分子的分离。
在实际操作中，我们首先需要准备一个装有凝胶柱的层析柱。
然后将待分离的生物大分子混合物加载到凝胶柱上，并通过向凝胶柱中注入缓冲液的方式进行层析。
在缓冲液的推动下，生物大分子混合物会逐渐在凝胶柱中进行分离，较小的生物大分子会被凝胶柱滞留，而较大的生物大分子则会通过凝胶柱。
最后，我们可以通过适当的方法将滞留在凝胶柱中的生物大分子进行洗脱，从而得到纯净的生物大分子。
凝胶过滤层析的原理简单而直观，操作也相对简便，因此在生物大分子的分离和纯化中得到了广泛的应用。
它不仅可以对蛋白质、核酸等生物大分子进行分离和纯化，还可以用于生物大分子的分子量测定和构象分析。
因此，凝胶过滤层析在生物科学研究和生物制药工业中具有重要的地位。
总之，凝胶过滤层析作为一种常用的生物大分子分离和纯化方法，其原理简单直观，操作也相对简便。
通过利用凝胶柱对生物大分子进行分子大小和形状的筛选，可以实现对生物大分子的分离和纯化。
因此，凝胶过滤层析在生物科学研究和生物制药工业中具有重要的应用价值。
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的技术方法，其基本原理是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子大小和电荷差异，将混合物中的目标分子从其他分子中分离出来。
在凝胶过滤层析中，常用的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
这些凝胶材料具有多孔结构，可以形成一种网络状的三维结构。
目标分子可以通过这些孔隙进入凝胶内部，而其他分子则因孔隙的大小或电荷而无法进入，从而实现目标分子的分离。
凝胶过滤层析的基本步骤包括样品加载、洗脱和分离。
首先，将混合物样品加载到凝胶柱上，样品中的分子会根据其大小和电荷的不同，以不同的速率进入凝胶内部。
然后，通过洗涤凝胶柱，将非目标分子洗脱掉，使其通过凝胶柱。
最后，目标分子可以通过改变实验条件，例如改变缓冲液pH值、离子强度等，从凝胶中洗脱出来。
凝胶过滤层析的优势在于其操作简单、成本低廉、适用范围广，可以用于分离和纯化多种生物大分子，如蛋白质、核酸等。
同时，凝胶材料的孔隙结构可调控，可以根据实验需要选择不同的凝胶材料和孔隙大小，以实现对目标分子的高效分离。
凝胶过滤层析是一种基于凝胶材料的分离技术，通过利用凝胶的孔隙结构和分子特性的差异，实现混合物中目标分子的分离和纯化。
该技术简便易行，适用范围广泛，对于生物分子的研究和应用具有
重要意义。
实验五：凝胶过滤柱层析凝胶过滤柱层析一般可用材料有聚丙烯（或其它可用塑料）、有机玻璃、玻璃等做成的柱或柱型、筒形物体；内径从2cm－10cm不等，柱高等于内径的10－2021下端不能有吸附剂或固定相、载体流出。
柱层析的基本步骤：1．装柱：可有湿法装柱和干法装柱等两种方法。
装柱时，干法装柱与湿法装柱大同小异：吸附剂均经漏斗进入；干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，干燥的吸附剂从上端缓缓进入，前者加入空柱底，后者进入了流动相（即课本中的溶剂或者洗脱剂）。
装柱要领：柱层析的装柱比较重要，装柱的效果直接影响层析分离效果。
因此，是制备性分离的一种基本操作技能。
但是，只要做到密实均匀无气泡就大功告成。
小技巧：万一装柱时带入气泡，可从上端压入大量溶剂将气泡从下端挤出。
2．加样:又称上样或样品上柱。
多将样品溶于少量的溶剂（注：柱层析所用的洗脱剂）中，小心的加入层析柱项端的平面内；也可将样品与易挥发溶剂混合后，再与吸附剂吸收、挥干挥发性溶剂后，撒布于柱的上端；有时也可用多层圆形滤纸吸收样品溶液，再平放到柱的上端。
柱层析加样的基本要求是均匀薄饼样层。
3．洗脱：柱层析所用的溶剂，习惯上称为洗脱剂。
洗脱操作的目的当然是要将加入的样品中各个组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成分。
洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收集是关键；经验：每30分钟－1小时内流出的洗脱剂体积等于所用吸附剂的重量为宜。
凝胶色谱柱（水性）的保养与保存：凝胶色谱柱需要注意防止微生物的生长，被微生物污染后的色谱柱将无法重现原来的分离效果与柱效，严重会使凝胶色谱柱报废。
为了抑制微生物的生长，可以使用低温保存。
值得注意的是温度不能过低，以免冻结，为了不冻结可以提高保存时介质的离子强度。
常用的保存抑菌剂有：%叠氮钠、%洗必泰（hibitane，双氯苯双胍己烷）、%%三氯丁醇、l氢氧化钠。
也可以用一定量有机溶剂来保存，如2021醇。
值得注意的是，无论何种保护方式，都必须根据色谱柱的特点来进行。
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术（GFC，Gel filtration chromatography）是一种基于分子大小差异的分离技术。
该技术通过在一个多孔凝胶柱中进行分离，使分子根据其大小在凝胶柱中的迁移速率不同而得到分离。
本文将详细讲解凝胶过滤层析技术的原理。
凝胶过滤层析技术的原理基于分子在多孔凝胶柱中迁移的速率与其体积大小成反比的规律。
凝胶柱中的多孔凝胶由多聚物（如聚丙烯酰胺、海藻酸钠等）构成，呈现出一定的孔径分布。
分子小于凝胶孔径的分子可以进入孔道中，而大于凝胶孔径的分子则无法进入孔道，只能沿凝胶颗粒表面通过。
因此，相对较大的分子在凝胶柱中的迁移速率更快，相对较小的分子则迁移速率较慢。
具体而言，凝胶过滤层析技术分为两个主要步骤：样品加载和洗脱。
1.样品加载：首先将待分离的样品溶液加入到凝胶柱中，样品中的各种分子根据其体积大小进入到凝胶孔道或沿凝胶颗粒表面通过。
体积较大的分子无法进入孔道，因此会快速通过凝胶柱，迁移速率较快。
体积较小的分子则能够进入孔道，受到凝胶孔道的阻碍，迁移速率较慢。
这样，样品中的不同分子就会在凝胶柱中根据其体积大小而分离。
2.洗脱：在样品加载后，需要通过洗脱来收集分离的目标分子。
洗脱过程中使用一种洗脱缓冲液，缓冲液的成分和pH值可以调整以满足对目标分子的选择性洗脱。
这样，在洗脱过程中，不同体积大小的分子将以不同的速率从凝胶柱中洗出，实现对目标分子的分离纯化。
需要注意的是，凝胶过滤层析技术不仅仅能够根据分子的大小分离，还可以用于蛋白质的分离，通过调整凝胶柱中的凝胶孔径和选择合适的缓冲液来实现蛋白质的选择性分离。
总结而言，凝胶过滤层析技术通过利用多孔凝胶柱的孔径分布特性，实现对分子根据其体积大小的分离。
通过加载样品并使用合适的洗脱缓冲液，不同体积大小的分子可以在凝胶柱中分离纯化。
这种技术简单易行，广泛应用于分子生物学、生物医学等领域的分离纯化研究中。
凝胶过滤层析的原理和应用1. 原理凝胶过滤层析是一种基于凝胶作为固定相的层析技术，通过调节凝胶的孔隙结构和性质，实现对样品中不同分子的分离和纯化。
凝胶是一种交联聚合物，可以形成一种均匀的孔隙结构，在此基础上，根据溶质的分子量和形状，通过改变溶质在凝胶中的迁移速度和扩散系数，实现对不同分子的分离。
凝胶过滤层析主要包括两个步骤：装填凝胶柱和运行层析。
在装填凝胶柱过程中，首先选择合适的凝胶，根据样品的特性和分子量范围，调节凝胶的孔隙结构和粒径大小。
然后将凝胶柱填充到层析柱中，保持一定的填充密度和均匀性。
在运行层析过程中，将待分离样品加载到凝胶柱上，通过重力、气压或离心力等方式进行传质，使样品中的分子在凝胶柱中进行分离。
较小的分子可以穿过凝胶孔隙较大的深度，迁移较远；而较大的分子由于其体积较大，只能在凝胶柱的顶端停留。
2. 应用凝胶过滤层析广泛应用于生物化学、分子生物学和生物医学等领域中的分子分离和纯化过程。
以下是凝胶过滤层析的几个主要应用领域：2.1 蛋白质分离与纯化凝胶过滤层析在蛋白质分离和纯化中起到了重要作用。
由于不同蛋白质的分子量差异较大，可以通过选择合适的凝胶柱和适当的条件，实现对蛋白质的分离。
例如，在蛋白质纯化过程中，可以使用凝胶柱将杂质分离出去；在蛋白质富集过程中，可以使用凝胶柱将目标蛋白质捕获并纯化。
2.2 DNA和RNA的分子分离凝胶过滤层析还可以用于DNA和RNA的分子分离。
由于DNA和RNA的分子量较大，并且具有不同的结构和电荷特性，可以通过调节凝胶孔隙大小和性质，实现对DNA和RNA的分离。
例如，在DNA纯化过程中，可以使用凝胶柱将杂质和DNA分离，从而得到纯净的DNA样品。
2.3 多肽和寡核苷酸的纯化凝胶过滤层析也适用于多肽和寡核苷酸的纯化。
多肽和寡核苷酸一般具有较小的分子量，可以通过选择合适的凝胶柱和操作条件，实现对多肽和寡核苷酸的纯化。
例如，在多肽合成过程中，可以使用凝胶过滤层析将多肽产物从反应混合物中分离出来。
-pores filled with eluent 孔内充满洗脱液
-carefully controlled size range 孔径精密控制
-chemically /physically inert (lack of adsorptive properties)
1. Spherical particles packed into a column.
2. Sample applied.
3. Buffer (mobile phase) and sample
move through column.Molecules
diffuse in and out of matrix
4. Large molecules leave the column
first followed by smaller molecules in
Molecules larger than the
pass straight through.
V = void volume V = retention volume or elution volume V = total liquid volume of the bed V = inner pore volume = V V = total geometric volume of the column V = volume of gel matrix V o
V t
V c
V R1V R2 V R3 V R4
V o
V R
volume
c o n c e n t r a t i o n
非常大的分子在外水体积洗出, V o
volume
c o n c e n t r a t i o n
V t
V c
V o
V R
V = V 0+V 柱床的几何体积K d
V t
V R
volume
c o n c e n t r a t i o n
elution volume when K = 1
elution with K Adsorption has occurred.
elution with K Serious problem!
流动相中需要加入150mM NaCl av K av versus av 1
log (M r )
Exclusion limit
All molecules bigger than this elute in the void volume.均在外水体积洗出
10
log (M r )
0.7
0.1fractionation range 填料分级范围
av av Rs Rs Rs V 2 -V 1(W 1 + W 2) / 2
=
两峰相对于其峰宽而言，分开的有多远
high efficiency low efficiency
高柱效需要良好的柱填装技术高柱效有时可弥补选择性不足
lower selectivity
high selectivity
high selectivity
low selectivity
high efficiency
low efficiency
1k 10k 100k
1000k
Sephacryl S-100
40 80 120 ml
Sephacryl S-300
Sephacryl S-200
BSA
Cyt C IgG
b-L
Cytidine
AU A gel has different
fractionation ranges for native, globular proteins and random coil.
对于形状不同的分子，某填料的分级范围不同
denatured proteins 变性蛋白
1
0.7
0.1
log (M r )
native proteins 天然蛋白
Molecules with different shapes have different selectivity curves.
对于形状不同的分子，有不同的选择性曲线。
K av 1
globular proteins 球蛋白
1
log (M r )
linear polysaccharides 线性多糖
relative viscosity: 1.0relative viscosity: 4.2relative viscosity: 11.8relative viscosity: 1.0
relative viscosity: 4.2
relative viscosity: 11.8
Principles of gel filtration Optimize : How to get the expected results Content 内容
Column:Sample:Load:Buffer:组分离: 柱高< 60cm, 进样体积较大16% -44% CV
V c
Measure elution position
计算分子量大小V
R
log (M
r
)
V
R
Log(M)
V R~ Log (M r)
Superdex™200 HR 10/30
快速脱盐，置换缓冲液，去除试剂常用于对分辨率要求比较高的精细纯化!
cross-linked agarose
dextran
cross-section from Superdex™particle
葡聚糖链Tricorn Superdex10/30GL_24ml Hiload Superdex16/26 120ml /320ml
13um 34um
Superdex 200 10/300GL
Requirement :Monomer > 95%
快速得到好的分辨率l l a
b o r a t i o n w i t h N o v a v a x I n
c .
influenza virus
裂解液
3. How much sample are they loading?
-26/60 loading capacity 13 ml。
