凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量

凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。

本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。

材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。

2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。

3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。

4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。

实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。

2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。

3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。

4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。

结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。

在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。

较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。

通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。

这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。

凝胶过滤层析方法具有许多优点。

首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。

其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。

此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。

然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。

首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。

其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。

结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。

生物化学习题（含答案）竞赛辅导练习生物化学习题（氨基酸和蛋白质）收集、整理：杨思想一、填空题：1、天然氨基酸中，不含不对称碳原子，故无旋光性。

2、常用于检测氨基酸的颜色反应是。

3、通常可用紫外分光光度法测定蛋白质含量，这是因为蛋白质分子中的、和（三字符表示）三种氨基酸残基有紫外吸收能力。

4、写出四种沉淀蛋白质的方法：、、和。

5、蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸残基的和另一氨基酸的连接而形成的。

6、大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为16 %，如测得1g样品含氮量为10mg，则蛋白质含量为。

7、在20种氨基酸中，酸性氨基酸有和两种，具有羟基的氨基酸是和，能形成二硫键的氨基酸是。

8、蛋白质中的、和三种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在280nm处有最大光吸收。

9、精氨酸的pI为10.76，将其溶于pH7的缓冲液，并置于电场中，则精氨酸应向电场的方向移动。

10、蛋白质的二级结构最基本的有两种类型，分别是和。

11、α-螺旋是由同一肽链的和间的键维持的，螺距为，每圈螺旋含个氨基酸残基，每个氨基酸残基沿轴上升高度为。

天然蛋白质分子中的α-螺旋大都属于手螺旋。

12、球状蛋白质分子中有侧链的氨基酸残基长位于分子表面与水结合，而又侧链的氨基酸位于分子内部。

13、蛋白质的α-螺旋结构中，在环状氨基酸和存在处局部螺旋结构中断。

14、氨基酸与茚三酮发生氧化脱羧脱氨反应生成色化合物，而与茚三酮反应生成黄色化合物。

15、维持蛋白质一级结构的化学键：肽键和二硫键；维持二级结构靠氢键；维持三、四级结构靠和，其中包括、和。

16、稳定蛋白质胶体的因素是和。

17、GSH 的中文名称是，活性基团是；生化功能是、、。

18、电泳分离蛋白质的原理，是在一定pH 条件下，不同蛋白质和不同，因而在电场中移动的和不同，从而使蛋白质得到分离。

19、加入低浓度中性盐可使蛋白质溶解度，这种现象称为，而加入高浓度中性盐达到一定的盐饱和度时，可使蛋白质的溶解度并，这种现象称为，蛋白质的这种现象常用于。

凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。

凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。

在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同M r的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。

实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。

测定蛋白质分子量的常用方法测定蛋白质分子质量常用的方法有三种：沉降分析法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

其基本原理如下：(1)沉降分析法：又叫超速离心法。

蛋白质溶液经高速离心分离时，在离心场的作用下蛋白质分子下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。

根据沉降速度求出沉降系数(以s表示)，即单位离心场的沉降速度。

将沉降系数代入公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。

M=RTs/D(1-Vρ)式中：R——气体常数(8.314×107)；T——绝对温度；D——扩散系数；V——蛋白质分子的偏微比容(即无限大体积的溶液中加入1g蛋白质时溶液所增加的体积)；ρ——溶剂密度[20℃时每毫升的质量(g)]；s——沉降系数；M——蛋白质的相对分子质量。

(2)凝胶过滤法：又称分子筛层析法。

此法是在层析柱中装入葡聚糖(如Sephadex)凝胶，这种凝胶颗粒具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。

当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，分子量小的后下来。

将已知分子量的标准蛋白质混合物上柱，洗脱，根据洗脱峰位置量出各种蛋白质的洗脱体积，然后用分子量的对数为横坐标，以洗脱体积为纵坐标，制作标准曲线。

测定时，根据紫外检测洗脱峰位置，量出待测样品的洗脱体积，由标准曲线可查出其分子质量。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、形状和所带的电荷。

而SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同。

SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。

当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，并且使蛋白质分子形状都变成长椭圆棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有电荷和形状的差异。

这样电泳的速度只取决于蛋白质分子质量的大小。

不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。

2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

一、实验目的：了解凝胶过滤层析法和SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

二、实验原理：凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

也叫做分子排阻层析。

一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。

小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。

1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。

在条件一定时，b 和K均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

三、实验步骤：总体流程：小麦幼苗叶片PBS提取离心粗酶液35%-55%（NH4）2SO4PBS溶解1ml (NH4)2SO4样品（每组1个）Sephadex G-25 脱盐脱盐样品 SDS-PAGE染色脱色计算Rubisco的大亚基、小亚基分子量详细流程：1）平衡：20ml: 10*洗脱液. 清洗胶柱。

凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理以《凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理》为标题，写一篇3000字的中文文章凝胶过滤层析是一种常见的分子分析方法，用于测量物质分子量。

常用于检测蛋白质分子量。

凝胶过滤层析方法有助于化学和生物分子之间的相互作用以及研究分子大小的变化。

本文将阐述凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理。

凝胶过滤层析是一种基于密度的分子分析方法。

该方法将样品加入非常浓缩的凝胶层，并在低压下过滤。

较小的分子可以通过凝胶而更大的分子则被滤波。

根据滤失的部分，可以推测出样品中分子的大小。

该方法最重要的特点是它可以检测出均一分子的情况，而其他分子的尺寸分析方法则无法实现此目的。

凝胶过滤层析可以用来测量蛋白质分子量。

在该实验中，研究者使用难溶性的聚苯乙烯凝胶，在某种pH和温度的环境中，将蛋白质进行溶解和混合，然后将它们加入凝胶层，并且在低压下进行过滤。

从最终收集的滤失液中检测到溶解物的体积，然后根据滤失液的量来推算出蛋白质分子量。

凝胶过滤层析可以制备多种蛋白质，包括低分子量的蛋白质和高分子量的蛋白质。

在此方法中，凝胶的分子比例（DC）可以用来确定受试蛋白质的种类，例如低DC的混合物可能包含低分子量的蛋白质。

此外，还可以利用凝胶过滤层析方法找出蛋白质的变性情况，从而识别蛋白质间的结构变化。

凝胶过滤层析方法有许多优点。

它可以检测出多种蛋白质，是一种高灵敏度的技术。

此外，它不依赖于某个特定的化学反应，可以快速，灵敏地检测各种蛋白质的分子量。

另外，凝胶过滤层析方法也可以用来检测各种其他复杂的分子，包括糖，多肽，抗体和小分子化合物，以及多种大分子组装体。

凝胶过滤层析是一种实用的研究和应用分子大小的方法，它可以用来快速检测出蛋白质和其他分子的分子量。

该方法为研究蛋白质的种类和变性提供了一种有效手段。

本文详细论述了凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理，以及这种方法的优点和缺点。

凝胶过滤层析是一项日益重要的分析方法，可以帮助研究者更好地了解蛋白质的构造和作用，以及蛋白质分子量的变化。