凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量

4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠
氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。
（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 淀出现。
谢 谢 各 位 聆 听
葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。
本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
精品
【实验目的】
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯 化、浓缩等。
凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
温溶胀 24小时 以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2～3小时，可去 除颗粒内部的空 气及灭菌。

凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。

本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。

材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。

2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。

3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。

4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。

实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。

2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。

3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。

4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。

结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。

在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。

较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。

通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。

这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。

凝胶过滤层析方法具有许多优点。

首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。

其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。

此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。

然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。

首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。

其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。

结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。

C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响

凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备

样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s

选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义

凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）

生物化学习题（含答案）竞赛辅导练习生物化学习题（氨基酸和蛋白质）收集、整理：杨思想一、填空题：1、天然氨基酸中，不含不对称碳原子，故无旋光性。

2、常用于检测氨基酸的颜色反应是。

3、通常可用紫外分光光度法测定蛋白质含量，这是因为蛋白质分子中的、和（三字符表示）三种氨基酸残基有紫外吸收能力。

4、写出四种沉淀蛋白质的方法：、、和。

5、蛋白质多肽链中的肽键是通过一个氨基酸残基的和另一氨基酸的连接而形成的。

6、大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为16 %，如测得1g样品含氮量为10mg，则蛋白质含量为。

7、在20种氨基酸中，酸性氨基酸有和两种，具有羟基的氨基酸是和，能形成二硫键的氨基酸是。

8、蛋白质中的、和三种氨基酸具有紫外吸收特性，因而使蛋白质在280nm处有最大光吸收。

9、精氨酸的pI为10.76，将其溶于pH7的缓冲液，并置于电场中，则精氨酸应向电场的方向移动。

10、蛋白质的二级结构最基本的有两种类型，分别是和。

11、α-螺旋是由同一肽链的和间的键维持的，螺距为，每圈螺旋含个氨基酸残基，每个氨基酸残基沿轴上升高度为。

天然蛋白质分子中的α-螺旋大都属于手螺旋。

12、球状蛋白质分子中有侧链的氨基酸残基长位于分子表面与水结合，而又侧链的氨基酸位于分子内部。

13、蛋白质的α-螺旋结构中，在环状氨基酸和存在处局部螺旋结构中断。

14、氨基酸与茚三酮发生氧化脱羧脱氨反应生成色化合物，而与茚三酮反应生成黄色化合物。

15、维持蛋白质一级结构的化学键：肽键和二硫键；维持二级结构靠氢键；维持三、四级结构靠和，其中包括、和。

16、稳定蛋白质胶体的因素是和。

17、GSH 的中文名称是，活性基团是；生化功能是、、。

18、电泳分离蛋白质的原理，是在一定pH 条件下，不同蛋白质和不同，因而在电场中移动的和不同，从而使蛋白质得到分离。

19、加入低浓度中性盐可使蛋白质溶解度，这种现象称为，而加入高浓度中性盐达到一定的盐饱和度时，可使蛋白质的溶解度并，这种现象称为，蛋白质的这种现象常用于。

4.25，谷氨酸等电点为_ _。 13.
当DNA复制时，一条链是连续的，另一条是不连续的，称为___复制； 复制得到的子代分子，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的， 这种方式叫___复制。其中，脱氧核苷酸的连接具有严格的方向性，由 前一个核苷酸的___与下一个核苷酸的___之间形成了3′,5′磷酸二酯键。 14. 在葡萄糖分解为乳酸的过程中， 酶、 酶和 酶所催化的反应是不可逆的 15. 嘌呤核苷酸从头合成时嘌呤环上的1号、7号与9号N原子分别来自于 氨基酸____、和____、 。 16. 生物体中ATP的合成途径有三种，即___、___和___。
二. 填空题（每空 0.5分，共20 分） 1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳其蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于_ _，而聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质分子的迁移率取决于___。 2. 在有竞争性抑制剂存在时，酶催化反应的Vmax___，Km___。 3. 谷氨酸的pK1(α-COOH)=2.19，pK2(α-NH3+)=9.67，pKR(R基)= 4.25，谷氨酸等电点为_ _。 4.核酸的一级结构中，脱氧核苷酸或核苷酸的连接具有严格的方向性，由前一个核苷酸的___ 与下一个核苷酸的___之间形成了3′,5′-磷酸二酯键。 5. 生物体中ATP的合成途径有三种，即___、___和___。 6. 一分子脂肪酸活化后需____转运才能由胞液进入线粒体内氧化，氧化产物乙酰CoA需经__ __才能将其带出线粒体参与脂肪酸合成。 7. 体内的脱氧核糖核苷酸是由各自相应的核糖核苷酸在___水平上还原而成的，催化UDP转变 为dUDP的酶是___，此酶需要___和___为辅因子。此反应的最终供氢体是___。 8. 当RNA合成时，RNA聚合酶沿有意义链移动的方向是___，RNA链合成的方向是___。 9. 新合成的多肽链的加工修饰包括____、____等。 10. 1961年，Jacob和Monod提出了关于原核生物基因结构及表达调控的___学说。该结构通常 是由___、___、___三种成分组成。 11. 从A260/A280的比值可判断核酸样品的纯度，纯DNA的A260/A280应大于_ ，纯RNA的A260/A280应达到___。 12. 嘌呤核苷酸的嘌呤环上的第1位与第9位N原子分别来自于氨基酸____和____。 13. 乙醛酸循环含有___和___两个特异酶。 14. 核酸、变性核酸、水解后的核酸对260 nm的紫外吸收能力不一，其中___吸收能力最大，而___吸收能力最小，这是由于___。 15. 乳糖操纵子的诱导物是___，色氨酸操纵子的辅阻遏物是___。

凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。

凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。

在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同M r的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。

实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。

测定蛋白质分子量的常用方法测定蛋白质分子质量常用的方法有三种：沉降分析法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

其基本原理如下：(1)沉降分析法：又叫超速离心法。

蛋白质溶液经高速离心分离时，在离心场的作用下蛋白质分子下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。

根据沉降速度求出沉降系数(以s表示)，即单位离心场的沉降速度。

将沉降系数代入公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。

M=RTs/D(1-Vρ)式中：R——气体常数(8.314×107)；T——绝对温度；D——扩散系数；V——蛋白质分子的偏微比容(即无限大体积的溶液中加入1g蛋白质时溶液所增加的体积)；ρ——溶剂密度[20℃时每毫升的质量(g)]；s——沉降系数；M——蛋白质的相对分子质量。

(2)凝胶过滤法：又称分子筛层析法。

此法是在层析柱中装入葡聚糖(如Sephadex)凝胶，这种凝胶颗粒具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。

当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，分子量小的后下来。

将已知分子量的标准蛋白质混合物上柱，洗脱，根据洗脱峰位置量出各种蛋白质的洗脱体积，然后用分子量的对数为横坐标，以洗脱体积为纵坐标，制作标准曲线。

测定时，根据紫外检测洗脱峰位置，量出待测样品的洗脱体积，由标准曲线可查出其分子质量。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、形状和所带的电荷。

而SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同。

SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。

当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，并且使蛋白质分子形状都变成长椭圆棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有电荷和形状的差异。

这样电泳的速度只取决于蛋白质分子质量的大小。

不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。

2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

一、实验目的：了解凝胶过滤层析法和SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

二、实验原理：凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

也叫做分子排阻层析。

一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。

小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。

1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。

在条件一定时，b 和K均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

三、实验步骤：总体流程：小麦幼苗叶片PBS提取离心粗酶液35%-55%（NH4）2SO4PBS溶解1ml (NH4)2SO4样品（每组1个）Sephadex G-25 脱盐脱盐样品 SDS-PAGE染色脱色计算Rubisco的大亚基、小亚基分子量详细流程：1）平衡：20ml: 10*洗脱液. 清洗胶柱。

凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理以《凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理》为标题，写一篇3000字的中文文章凝胶过滤层析是一种常见的分子分析方法，用于测量物质分子量。

常用于检测蛋白质分子量。

凝胶过滤层析方法有助于化学和生物分子之间的相互作用以及研究分子大小的变化。

本文将阐述凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理。

凝胶过滤层析是一种基于密度的分子分析方法。

该方法将样品加入非常浓缩的凝胶层，并在低压下过滤。

较小的分子可以通过凝胶而更大的分子则被滤波。

根据滤失的部分，可以推测出样品中分子的大小。

该方法最重要的特点是它可以检测出均一分子的情况，而其他分子的尺寸分析方法则无法实现此目的。

凝胶过滤层析可以用来测量蛋白质分子量。

在该实验中，研究者使用难溶性的聚苯乙烯凝胶，在某种pH和温度的环境中，将蛋白质进行溶解和混合，然后将它们加入凝胶层，并且在低压下进行过滤。

从最终收集的滤失液中检测到溶解物的体积，然后根据滤失液的量来推算出蛋白质分子量。

凝胶过滤层析可以制备多种蛋白质，包括低分子量的蛋白质和高分子量的蛋白质。

在此方法中，凝胶的分子比例（DC）可以用来确定受试蛋白质的种类，例如低DC的混合物可能包含低分子量的蛋白质。

此外，还可以利用凝胶过滤层析方法找出蛋白质的变性情况，从而识别蛋白质间的结构变化。

凝胶过滤层析方法有许多优点。

它可以检测出多种蛋白质，是一种高灵敏度的技术。

此外，它不依赖于某个特定的化学反应，可以快速，灵敏地检测各种蛋白质的分子量。

另外，凝胶过滤层析方法也可以用来检测各种其他复杂的分子，包括糖，多肽，抗体和小分子化合物，以及多种大分子组装体。

凝胶过滤层析是一种实用的研究和应用分子大小的方法，它可以用来快速检测出蛋白质和其他分子的分子量。

该方法为研究蛋白质的种类和变性提供了一种有效手段。

本文详细论述了凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理，以及这种方法的优点和缺点。

凝胶过滤层析是一项日益重要的分析方法，可以帮助研究者更好地了解蛋白质的构造和作用，以及蛋白质分子量的变化。

蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。

一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。

通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。

该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。

粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。

二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。

分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。

通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。

凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。

三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。

凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。

三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。

使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。

待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。

3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。

打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。

5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。

并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。

6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。

五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。

接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。

原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。

凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告一、引言凝胶过滤层析是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于生物医学研究、生物制药等领域。

本实验旨在通过对凝胶过滤层析的研究，探讨其原理、方法和应用。

二、凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子的大小和形状选择性地分离混合物中的组分。

凝胶材料通常是多孔的，具有不同大小的孔隙，通过调整凝胶材料的孔隙大小，可以选择性地分离分子。

三、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶材料装入柱中，并将柱与收集容器连接。

2. 样品处理：将待分离的混合物样品处理，去除杂质和大分子。

3. 样品加载：将处理后的样品加载到凝胶柱上。

4. 洗脱：用缓冲液洗脱凝胶柱上的目标分子。

5. 收集：将洗脱液收集于容器中，得到纯化后的目标分子。

四、实验结果与讨论本实验使用了凝胶过滤层析技术对蛋白质混合物进行分离和纯化。

实验结果显示，凝胶过滤层析能够有效地分离目标蛋白质，并具有较高的纯度。

在实验过程中，我们发现凝胶材料的孔隙大小对分离效果有重要影响。

较大的孔隙可以让较大分子通过，而较小的孔隙则只允许较小分子通过。

因此，在选择凝胶材料时，需要根据目标分子的大小来选择合适的凝胶。

此外，凝胶过滤层析还可以用于去除杂质和浓缩目标分子。

在洗脱过程中，通过调整洗脱缓冲液的成分和pH值，可以更好地控制目标分子的洗脱效果。

凝胶过滤层析技术的应用非常广泛。

在生物医学研究中，它常用于蛋白质纯化和分析，可以帮助研究人员获取纯度较高的蛋白质样品，从而进行后续的功能研究。

在生物制药领域，凝胶过滤层析可以用于制备药物和疫苗，提高产品纯度和质量。

然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。

例如，对于较大的分子，凝胶材料的孔隙可能不够大，导致无法通过。

此外，凝胶过滤层析的操作相对较慢，需要较长的时间来完成分离和纯化过程。

综上所述，凝胶过滤层析是一种有效的生物分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。

通过对凝胶过滤层析的实验研究，我们深入了解了其原理、方法和应用，并对其优缺点有了更清晰的认识。

实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。

（2）学习用标准蛋白质混合液制作V e，K av对1gM r的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。

二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。

凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

分离过程中的示意见图17-1。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同分子量的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t（total volume）表示。

凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：20℃实验目的：①理解凝胶过滤层析的原理。

②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。

③学会分析洗脱峰峰型。

试验方法与过程：1.装柱①固定层析柱，柱内装1/2双蒸水，双蒸水下降到1/4时，关闭出口。

②搅拌凝胶浆液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱，打开出口，让凝胶沉降。

③装至柱内有2/3凝胶，上层保留至少0.5cm的水。

2.平衡双蒸水平衡柱，管口上接恒流泵、下管接检测仪入口，控制流速。

观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min，暂停恒流泵。

3.加样吸取5%丙酮溶液500ul，沿柱壁缓慢加入，控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内，用1ml双蒸水冲洗壁上的样品，在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。

4.洗脱凝集打开恒流泵开关，监视紫外检测仪的情况，待丙酮全部流出后加入，加入蛋白质混合物，监视紫外检测仪情况，开始出现上升即开始收集流出液。

蛋白质样品全部流出后，用双蒸水冲洗凝胶。

原始数据：图一：从左到右第一个峰为丙酮，第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。

结果处理与分析：①根据图像得As略大于1，说明装柱压力不足，可能滤网内有空气进入。

②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件，所以不能分析到分配系数Kd。

③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动，可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口，导致空气进入。

④加入样品后出现两个峰，说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。

讨论：1.注意事项：一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖，不能使之暴露于空气中；保证所灌凝胶中没有气泡，当有气泡和凝胶有明显分层时3，应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。

2.经验和心得：用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时，一定要沿管壁边旋转边缓慢加入，防止加入时产生压力太大，使凝胶柱上表面不平整；用滴管比用移液枪加样品好，因为滴管产生的压力小。

第1部分蛋白质一、填空题1.除半胱氨酸和胱氨酸外,含硫的氨基酸还有________,除苏氨酸和酪氨酸外,含羟基的氨基酸还有_________,在蛋白质中常见的20种氨基酸中,_________是一种亚氨基酸,_________不含手性碳原子.2.氨基酸在等电点时,主要以__________离子形式存在,在pH＞pI的溶液中,大部分以________离子形式存在,在pH ＜pI的溶液中,大部分以________离子形式存在.3.组氨酸的pK1<α-COOH>值是1.82,pK2 <咪唑基>值是6.00, pK3<α-NH3+>值是9.17,其等电点是________.4.Asp的pK1=2.09,pK2= 3.86,pK3=9.82,其pI等于________.5.在近紫外区能吸收紫外光的氨基酸有_______、_______和_______.其中______的摩尔吸光系数最大.6 .蛋白质分子中氮的平均含量为_______,故样品中的蛋白质含量常以所测氮量乘以_______.7.蛋白质的氨基酸残基是由_______键连接成链状结构的,其氨基酸残基的______称蛋白质的一级结构.8.在α螺旋中C=O和N—H之间形成的氢键与_______基本平行,每圈螺旋包含_____个氨基酸残基,高度为_______,每个氨基酸残基使螺旋轴上升______,并沿轴旋转______度.9.β-折叠片结构的维持主要依靠两条肽键之间的肽键形成________来维持.10.用凝胶过滤法分离蛋白质,相对分子质量较小的蛋白质在柱中滞留的时间较_______,因此最先流出凝胶柱的蛋白质,其相对分子质量最_______.11.血红蛋白的辅基是________,当其中的1个亚基与氧结合后,其余亚基与氧的亲合力______,这种现象称________.当CO2或H+浓度增高时,血红蛋白与氧的亲合力_______,这种现象称_________.12.稳定蛋白质胶体溶液的因素是________和________.13 .一般说来,球状蛋白质在其分子内部含有________性氨基酸残基,而在分子外表面含________性氨基酸残基.14蛋白质变性时空间结构________,而一级结构_________.变性后,蛋白质的溶解度一般会_________,生物学功能________.15.胰蛋白酶专一性地切断________和________的羧基端肽键.二、选择题〔在备选答案中选出1个正确答案〕1.一个生物样品的含氮量为5%,它的蛋白质含量为A .12.50% B. 16.00% C. 38.00% D. 31.25%2.下列蛋白质组分中,哪一种在280nm具有最大的光吸收？A. 色氨酸的吲哚环B. 酪氨酸的酚环C. 苯丙氨酸的苯环D. 半胱氨酸的硫原子3.关于氨基酸的叙述哪一项是错误的？A. 酪氨酸和丝氨酸含羟基B.酪氨酸和苯丙氨酸含苯环C. 谷氨酸和天冬氨酸含两个氨基D.赖氨酸和精氨酸是碱性氨基酸4.在pH7时,其R基带有电荷的氨基酸是A. 缬氨酸B. 甘氨酸C. 半胱氨酸D. 赖氨酸5.用6mol/L HCl水解某种蛋白质时能检出的氨基酸种类是A. 20种B. 19种C. 18种D. 17种或更少6.每个蛋白质分子必定具有的结构是什么A. α-螺旋B. β-折叠C. 三级结构D. 四级结构7.下列哪一种氨基酸侧链基团的pKa值最接近于生理pH值？A. 半胱氨酸B. 谷氨酸C. 谷氨酰胺D. 组氨酸8. Arg的pK1=2.17,pK2=9.04, pK3=12.48 其pI等于A .5.613 B. 7.332 C. 7.903 D. 10.769.典型的α螺旋是A. 2.610B. 310C. 3.613D. 4.41610.维持蛋白质分子中的α螺旋主要靠A. 盐键B. X德华键C. 共价键D. 氢键11.维系蛋白质三级结构稳定的最重要的键或作用力是A．盐键 B.二硫键 C.氢键 D.疏水作用力12.血红蛋白质的氧合曲线是A.双曲线B.抛物线C. S形曲线D.钟罩形13.维持蛋白质二级结构的主要化学键是A.肽键B.二硫键C.氢键D.疏水键14.关于蛋白质三级结构的描述错误的是A.有三级结构的蛋白质均有酶活性B.球蛋白均有三级结构C.三级结构的稳定性由多种次级键维系D.亲水基团多分布在三级结构的表面15.某蛋白质的等电点为7.5,在pH6.0的条件下进行电泳,它的泳动方向是A.在原点不动B.向正极移动C.向负极移动D.无法预测16.用凝胶过滤层析柱分离蛋白质时,下列哪项是正确的A.分子体积最大的蛋白质最先洗脱下来B.分子体积最小的蛋白质最先洗脱下来C.不带电荷的蛋白质最先洗脱来来D.带电荷的蛋白质最先洗脱来来17.有一蛋白质水解产物在pH6用阳离子交换柱层析时,第一个被洗脱下来的氨基酸是A. Val〔pI为5.96〕B. Lys〔pI为9.74〕C. Asp〔pI为2.77〕D. Arg 〔pI为10.76〕18.为获得不变性的蛋白质,常用的方法有A.用三氯醋酸沉淀B.用苦味酸沉淀C.用重金属盐沉淀D.低温盐析19.SDS凝胶电泳分离蛋白质是根据各种蛋白质A.pI的差异B.分子大小的差异C.分子极性的差异D.溶解度的差异20.如果要测定一个小肽的氨基酸顺序,下列试剂中你认为最合适使用哪一个A .茚三酮 Br C.胰蛋白酶 D.异硫氰酸苯酯三、判断题1.当溶液的pH等于某一可解离基团的pKa时,该基团一半被解离.2.氨基酸为氨基取代的羧酸,可直接用酸碱滴定法进行定量测定.3.当溶液的pH小于某蛋白质的pI时,该蛋白质在电场中向阳极移动.4.溴化氰可以断裂甲硫氨酸的氨基参与形成的肽键.5.在α-螺旋中,每3.6个氨基酸绕一圈,并形成1个氢键.6.体内肽链合成方向是从N端向C端,而在体外固相肽的化学法合成时,通常是从C端向N端合成.7.核磁共振可以研究溶液中的蛋白质三维结构,并能提供有关的动态信息.8.在水溶液中,蛋白质折叠形成疏水核心,会使水的熵增加.9.球蛋白的三维折叠多采取亲水侧基在外,疏水侧基藏于分子内部的结构模式.10.胶原蛋白的原胶原分子是3股右手螺旋扭曲成的左手螺旋.11.血红蛋白与氧的结合能力随pH降低而增高.12.胎儿血红蛋白与2,3-二磷酸甘油〔2,3—DPG〕的结合力较弱.13.测定别构酶的相对分子质量可以用SDS-PAGE.14.用凝胶过滤分离蛋白质,小分子蛋白由于所受的阻力小首先被洗脱出来.15.若蛋白质与阴离子交换剂结合较牢,可用增加NaCI浓度或降低pH的方法将其从层析柱洗脱出来.四、名词解释1.兼性离子〔zwitterion〕；2.等电点〔isoelectric point,pI〕；3.构象<conformation〕；4.盐溶与盐析<salting in and salting out〕；5.Edman 降解法；6.超二级结构<super-secondary structure〕；7.结构域〔domain〕；8.蛋白质的三级结构；9.Bohr 效应〔Bohr effect〕； 10.蛋白质的变性作用五、分析和计算题1.试述蛋白质二级结构的三种基本类型.2.在下述pH条件下,下列蛋白质在电场中向哪个方向移动？人血清蛋白〔pI=4.64〕：pH5.5,pH3.5；血红蛋白〔pI=7.07〕：pH7.07,pH9.0.3.简述蛋白质溶液的稳定因素以与实验室沉淀蛋白质的常用方法.4.已知牛血清白蛋白含色氨酸0.58%〔按质量计〕,色氨酸相对分子质量为204.〔1〕计算牛血清白蛋白的最低相对分子质量〔2〕用凝胶过滤测得牛血清白蛋白相对分子质量大约为7万,问牛血清白蛋白分子中含几个色氨酸残基？5.简要叙述蛋白质形成寡聚体的生物学意义.6.蛋白质变性后,其性质有哪些变化？7.在体外,用下列方法处理,对血红蛋白与氧的亲和力有何影响？〔1〕pH值从7.0增加到7.4；<2> CO2分压从1000 Pa增加到4 000 Pa；<3> O2分压从6000 Pa下降到2000 Pa； <4>2,3-二磷酸甘油酸的浓度从8×10-4mol/L下降到2×10-4mol/L；〔5〕α2β2解聚成单个亚基.8.胎儿血红蛋白〔Hb F〕在相当于成年人血红蛋白〔Hb A〕β链143残基位置含有Ser,而成年人β链的这个位置是具阳离子的His残基.残基143面向β亚基之间的中央空隙.〔1〕为什么2,3-二磷酸甘油酸〔2,3-BPG〕同脱氧Hb A的结合比同脱氧Hb F更牢固？〔2〕Hb F对2,3-BPG低亲和力如何影响到Hb F对氧的亲和力？这种差别对于氧从母体血液向胎儿血液的运输有何意义.9.凝胶过滤和SDS-PAGE均是利用凝胶,按照分子大小分离蛋白质的,为什么凝胶过滤时,蛋白质分子越小,洗脱速度越慢,而在SDS-PAGE中,蛋白质分子越小,迁移速度越快？参考答案一、填空题1. 甲硫氨酸,丝氨酸,脯氨酸,甘氨酸2. 两性,负,正3. 7.594. 2.975. 苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,色氨酸6. 16%,6.257. 肽,排列顺序8. 螺旋轴,3.6,0.54,0.15,1009. 氢键10. 长,大11. 血红素,增加,正协同效应,下降,Bohr效应12.水化层,双电层13. 疏水,亲水14. 破坏,不变,下降,丧失15. 赖氨酸,精氨酸二、选择题1. <D>2.〔A〕3.〔C〕4.〔D〕5. <D>6.〔C〕7.〔D〕8.〔D〕9.〔C〕 10.〔D〕11.〔D〕 12.〔C〕 13.〔C〕 14.〔A〕 15.〔C〕16.〔A〕 17.〔C> 18.〔D〕 19.〔B〕 20. <D>三、判断题1.对.2.错.不能用酸碱滴定法直接进行滴定,只能用甲醛滴定法滴定氨基.3.错.当溶液的pH小于某蛋白质的pI时,该蛋白质带净正电荷,向阴极移动.4.错.溴化氰断裂甲硫氨酸的羧基参与形成的肽键.5.错.α-螺旋每3.6个氨基酸绕一圈,但螺旋一端的4个-NH和另一端的4个-C=0不参与形成氢键.6.对.7.对.8.对.9.对.10.错.原胶原分子是由3股左手螺旋扭曲成的右手螺旋.11.错.随着pH的降低,血红蛋白与氧的结合力降低,这有利于血红蛋白在CO2含量较高的组织释放氧.12.对.13.错.别构酶一般由多个亚基构成,SDS-PAGE只能测定亚基的相对分子质量.14.错.用凝胶过滤法分离蛋白质时,相对分子质量大的蛋白质先流出层析柱.15.对.四、名词解释1．氨基酸、蛋白质等分子在某一pH水溶液中,酸性基团脱去质子带负电荷,碱性基团结合质子带正电荷,这种既带负电荷,又带正电荷的离子称兼性离子或两性离子.2.调节两性离子溶液的pH,使该两性离子所带的净电荷为零,在电场中既不向正极、也不向负极移动,此时,溶液的pH称该两性离子的等电点〔pI〕.不同结构的两性离子有不同的pI值.3.具有相同构型的分子在空间里可能的多种形态,构象形态间的改变不涉与共价键的破裂.一个给定的蛋白质理论上可采取多种构象,但在生理条件下,只有一种或很少几种在能量上是有利的.4.低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度,这种现象称为盐溶.盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,因而溶解度增高.当离子强度增加到足够高时,蛋白质从溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析.盐析作用是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的结合水.5.为肽链氨基酸测序的方法.苯异硫氰酸酯与肽段N-末端的游离α-氨基作用,生成苯异硫氰酸酯衍生物,并从肽链上脱落下来,用层析的方法可鉴定为何种氨基酸衍生物.残留的肽链可继续与苯异硫氰酸酯作用,逐个鉴定出氨基酸的排列顺序.6.在蛋白质中,若干相邻的二级结构单元组合在一起,形成有规则、在空间上能辩认的二级结构组合体,充当三级结构的构件,称为超二级结构.常见的超二级结构有αα,βαβ,β-发夹,β-曲折等.7.在二级或超二级结构基础上进一步盘旋、折叠,形成较为紧密的球状实体,称为结构域.8.在二级结构、超二级结构或结构域〔对分子较大,由多个结构域的蛋白质而言〕基础上形成的完整空间结构,一个三级结构单位通常由一条肽链组成,但也有一些三级结构单位是由二硫键连接的多条肽链组成的,如胰岛素就是由两条肽链折叠成的1个三级结构单位.9.H+和CO2浓度增加,会降低氧和血红蛋白的亲和力,使得血红蛋白的氧合曲线向右移动,提高了O2从血红蛋白的释放量,这种作用称作Bohy效应.10.天然蛋白质因受物理或化学因素影响,其空间结构发生变化,致使蛋白质的理化性质和生物学性质都有所改变,但并不导致蛋白质一级结构的破坏,这种现象称变性作用.五、分析、计算题1.〔1〕α-螺旋：多肽主链围绕一中心轴形成的右手螺旋, 3.6个氨基酸残基上升一圈,螺距0.54nm；一个氨基酸残基的羰基氧与其后第四个氨基酸残基的亚氨基形成氢键,氢键与螺旋轴基本平行,氢键封闭的原子为13个,称作3.613.〔2〕β-折叠：两条或以上几乎完全伸展的多肽链平行或反平行排列而成,各肽键平面之间折叠成锯齿状,侧链R基团交错位于锯齿状结构的上下方；靠肽键羰基氧和亚氨基氢形成氢键维系.<3〕β-转角：在球状蛋白质分子中,多肽主链常常会出现180º回折,回折部分成为β转角,在β转角中第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键,使β转角成为比较稳定的结构.2.人血清蛋白的pI=4.64,在pH5.5的电场中带负电荷,向阳极移动；在pH3.5的电场中带正电荷,向负极移动.血红蛋白的pI=7.07,在pH7.07不带净电荷,在电场中不移动；在pH9.0时带负电荷,向阳极移动.3.维持蛋白质溶液稳定的因素有两个：〔1〕水化膜：蛋白质颗粒表面的亲水基团吸引水分子,使表面形成水化膜,从而阻断蛋白质颗粒的聚集,防止蛋白质沉淀.〔2〕同种电荷：在pH≠pI的溶液中,蛋白质带有同种电荷.同种电荷相互排斥,阻止蛋白质颗粒相互聚集而发生沉淀.常用的沉淀蛋白质方法有：〔1〕盐析法：在蛋白质溶液中加入大量的硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐,去除蛋白质的水化膜,中和蛋白质表面的电荷,使蛋白质颗粒相互聚集,发生沉淀.用不同浓度的盐可以沉淀不同的蛋白质,称分段盐析.〔2〕有机溶剂沉淀法：使用丙酮沉淀时,必须在0～4℃低温下进行,丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液的体积,蛋白质被丙酮沉淀时,应立即分离,否则蛋白质会变性.除了丙酮以外,也可用乙醇沉淀.此外,还可用重金属盐、某些有机酸等方法将样品中的蛋白质变性沉淀.4.〔1〕设最低相对分子质量为X,根据题意可列出：或〔2〕用凝胶过滤测得牛血清白蛋白相对分子质量大约为SDS-PAGE 的两倍,说明该蛋白质含有2个色氨酸残基,若色氨酸百分含量的测定值准确,则牛血清蛋白较准确的相对分子质量为3517×2＝703445.〔1〕能提高蛋白质的稳定性.亚基结合可以减少蛋白质的表面积/体积比,使蛋白质的稳定性增高.〔2〕提高遗传物质的经济性和有效性.编码一个能装配成同聚体的单位所需的基因长度比编码一个与同聚体相同相对分子质量的超长肽链所需的基因长度要小得多.〔3〕形成功能部位.不少寡聚蛋白的单体相互聚集可以形成新的功能部位.〔4〕形成协同效应.寡聚蛋白与配体相互作用时,有可能形成类似血红蛋白或别构酶那样的协同效应,使其功能更加完善.有些寡聚蛋白的不同亚基可以执行不同的功能,如一些酶的亚基可分为催化亚基和调节亚基.6.蛋白质变性后,氢键等次级键被破坏,蛋白质分子就从原来有秩序的紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构.即二、三级以上的高级结构发生改变或破坏,但一级结构没有破坏.变性后,蛋白质的溶解度降低,是由于高级结构受到破坏,使分子表面结构发生变化,亲水基团相对减少,容易引起分子间相互碰撞发生聚集沉淀,蛋白质的生物学功能丧失,由于一些化学键的外露,使蛋白质的分解更加容易.7.〔1〕pH 值增加,Hb 与氧的亲和力增加.〔2〕CO 2分压增加,Hb 与氧的亲和力下降.〔3〕O 2分压下降,Hb 与氧的亲和力下降.〔4〕2,3-BPG 浓度下降,Hb 与氧的亲和力增加.〔5〕α2β2解聚成单个亚基,Hb 与氧的亲和力增加.8.〔1〕由于2,3-BPG 是与脱氧Hb A 中心空隙带正电荷的侧链结合,而脱氧Hb F 缺少带正电荷的侧链〔β链143位的His 残基〕,因此2,3-BPG 同脱氧Hb A 的结合比同脱氧Hb F 的结合更紧.〔2〕2,3-BPG 稳定血红蛋白的脱氧形式,降低血红蛋白的氧饱和度.由于Hb F 与 2,3-BPG 亲和力比Hb A 低,HbF 受血液中2,3-BPG 影响小,因此Hb F 在任何氧分压下对氧的亲和力都比Hb A 大.亲和力的这种差别允许氧从母亲血向胎儿有效转移.9.凝胶过滤时,凝胶颗粒排阻Mr 较大的蛋白质,仅允许Mr 较小的蛋白质进入颗粒内部,所以Mr 较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过,可以先从层析柱中洗脱出来,而Mr 小的蛋白质后从层析柱中洗脱出来.SDS- PAGE 分离蛋白质时,所有的蛋白质均要从凝胶的网孔中穿过,蛋白质的相对分子质量越小,受到的阻力也越小,移动速度就越快. 第2部分 酶和辅酶一、填空题1.酶催化反应的实质在于降低反应的______,使底物分子在较低的能量状态下达到______态,从而使反应速度______.2.对于符合米氏方程的酶,v-[S]曲线的双倒数作图得到的直线,在横轴的截距为___________,纵轴上的截距为____________.3.若同一种酶有n 个底物就有________个K m 值,其中K m 值最________的底物,一般为该酶的最适底物.4.当底物浓度等于0.25K m 时,反应速率与最大反应速率的比值是_________.5.别构酶除活性中心外还有___________.当以v 对[S]作图时,它表现出______型曲线,而不是典型的米氏酶所具有的_______曲线.6.蛋白质磷酸化时,需要__________酶,而蛋白质去磷酸化需要____________酶.7.___________抑制剂不改变酶促反应V max ,___________抑制剂不改变酶促反应K m .8.含有腺苷酸的辅酶主要有、和.9.维生素A 缺乏可引起症；儿童缺乏维生素D 引起；成人缺乏维生素D 引起；维生素C 缺乏引起；维生素PP 缺乏引起；脚气病是由于缺乏引起的；口角炎是由于缺乏引起的；维生素B 12缺乏引起；叶酸缺乏引起.10.维生素B 1的活性形式是,维生素B 2的活性形式是和.维生素PP 可形成和两种辅酶.维生素B 6是以和形式作为转氨酶的辅酶.叶酸的活性形式是.生物素在体内是的辅酶.泛酸的活性形式有和.二、选择题〔在备选答案中选出1个正确答案〕1.酶催化作用对能量的影响在于=58.0100204X 3517258.0204100≈⨯=XA．增加产物能量水平 B．降低活化能 C．降低反应物能量水平 D．降低反应的自由能2.米氏方程在推导过程中引入了哪项假设A. 酶浓度为底物浓度一半B. 由于酶浓度很大,所以[E]基本不变C. 由于P→0,所以不考虑反应E+P→ES的存在D. 忽略反应ES→E+S的存在3.酶原激活的实质是A. 激活剂与酶结合使酶激活B. 酶蛋白的变构效应C. 酶原分子一级结构发生改变从而形成或暴露出酶的活性中心D. 酶原分子的空间构象发生了变化而一级结构不变4.乳酸脱氢酶是一个由两种不同的亚基组成的四聚体.假定这些亚基随机结合成四聚体,这种酶有多少种同工酶？A. 六种B. 三种C. 四种D. 五种5.同工酶的特点是A. 催化相同的反应,但分子结构和理化性质不同的一类酶B. 催化相同反应,分子组成相同,但辅酶不同的一类酶C. 催化同一底物起不同反应的酶的总称D. 催化作用,分子组成与理化性质相同,但组织分布不同的酶6.酶的比活力是指A. 以某种酶的活力作为1来表示其他酶的相对活力B. 每毫克蛋白的酶活力单位数C. 任何纯酶的活力与其粗酶的活力比D. 一种酶与另一种酶的活力比7.下列哪一项叙述是正确的?A.所有的辅酶都是维生素B.所有的水溶性维生素都可作为辅酶或辅酶的前体C.所有的辅酶都含有维生素D.前列腺素是由脂溶性维生素衍生而来三、判断题1.当[S]>>K m时,v趋向于V max,此时只有通过增加[E]来增加v.2.酶的最适温度与酶的作用时间有关,作用时间愈长,则最适温度愈高.3.在酶的催化反应中,组氨酸残基的咪唑基既可以起碱化作用,也可以起酸化作用.4.别构酶的速度-底物关系曲线均呈S形曲线.5.测定酶活力时,底物浓度不必大于酶浓度.6.酶的过渡态底物类似物与底物类似物相比较,是更有效的竞争性抑制剂.7.维生素对人体有益,所以摄入的越多越好.8.摄入的维生素C越多,在体内储存的维生素C就越多.9.能催化蛋白质磷酸化反应的酶,称为磷酸化酶.四、名词解释1．米氏常数； 2．活性中心〔active center〕；3. 酶活力〔enzyme activity〕； 4．别构酶〔allosteric enzyme〕；5. 酶原的激活； 6．同工酶〔isozyme〕；7. 抗体酶〔abzyme〕； 8. 不可逆抑制作用〔irreversible inhibition〕；9. 可逆抑制作用； 10.竞争性抑制作用〔competitive inhibition〕；11. 反竞争性抑制作用； 12. 共价修饰调节〔covalent modification regulation〕五、分析和计算题1.何谓酶的专一性？酶的专一性有哪几类？如何解释酶作用的专一性？2.影响酶反应效率的因素有哪些?它们是如何起作用的?3.试述研究酶活性中心的方法.4.称取25mg蛋白酶配成25mL溶液,取2mL溶液测得含蛋白氮0.2mg,另取0.1mL溶液测酶活力,结果每小时可以水解酪蛋白产生1500μg酪氨酸,假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1μg酪氨酸的酶量,请计算：〔1〕酶溶液的蛋白浓度与比活.〔2〕每克纯酶制剂的总蛋白含量与总活力.5.哪些因素影响酶的活性？酶制剂宜如何保存？参考答案一、填空题1. 活化能, 活化, 加快2. -1/K m, 1/V max3. n, 小4. 1:55.别构中心, S, 直角双6. 蛋白激；蛋白磷酸酯7. 竞争性, 非竞争性8. FAD, NAD+, NADP+9. 夜盲,佝偻病,软骨病,坏血病,糙皮病,维生素B1,维生素B2,恶性贫血,巨幼红细胞性贫血10. TPP,FMN,FAD,NAD+,NADP+,磷酸吡哆醛,磷酸吡哆胺,四氢叶酸,羧化酶的辅酶,ACP,CoA二、选择题1.〔B〕2.〔C〕3.〔C〕4.〔D〕5.〔A〕6.〔B〕7.〔B〕三、判断题1.对.2.错.酶最适温度与酶的作用时间有关,作用时间越长,则最适温度低.3.对.4.错.别构酶的速度-底物关系曲线不一定均呈S形曲线,负协同效应为平坦的双曲线形式.5.错.底物应该过量才能更准确的测定酶的活力.6.对.7.错.8.错.9.错.能催化蛋白质磷酸化反应的酶称为蛋白激酶.四、名词解释1.米氏常数〔K m值〕：是米氏酶的一个重要参数.Ｋm值是酶反应速率〔v〕达到最大反应速率〔V max〕一半时底物的浓度.米氏常数是酶的特征常数,只与酶的性质有关,不受底物浓度和酶浓度的影响.2.活性中心：酶分子中由若干个在一级结构上相距很远,但在空间上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成的区域,可直接与底物结合,并催化底物发生反应.对于结合酶来说,辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分.3.酶活力：酶催化一定化学反应的能力,可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速率表示.单位：浓度/单位时间.4.别构酶：或称变别构酶,一般具有多个亚基,除具有活性中心外,还具有可结合调节物的别构中心,活性中心负责酶对底物的结合与催化,别构中心负责调节酶反应速率.5.酶原的激活：有些酶在细胞内合成和初分泌时,并不表现出催化活性,这种无活性的酶的前身物称为酶原.在一定条件下,酶原分子的结构发生改变,无活性的酶原转化成有活性的酶称为酶原的激活.6.同工酶：催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构、组成与理化性质却不同的一组酶.7.抗体酶：也叫催化性抗体,是抗体的高度选择性和酶的催化能力相结合的产物,本质上是一类具有催化能力的免疫球蛋白,在其可变区赋予了酶的属性.8.不可逆抑制作用：某些抑制剂以共价键与酶蛋白中的必需基团结合从而使酶失活,且不能用透析、超滤等物理方法除去,由这种不可逆抑制剂引起的抑制作用称不可逆抑制作用.9.可逆抑制作用：抑制剂以非共价键与酶蛋白中的必需基团结合,可用透析等物理方法除去抑制剂而使酶重新恢复活性.10.竞争性抑制作用：竞争性抑制剂具有与底物相似的结构,通常与正常的底物或配体竞争酶的结合部位.这种抑制使K m增大,而V max不变.通过增加底物浓度可逆转竞争性抑制.11.反竞争性抑制作用：抑制剂与酶-底物复合物结合,而不与游离酶结合的一种抑制作用.这种抑制作用使得V max和K m都变小,但V max/K m比值不变.12.共价修饰调节：可在其他酶的作用下对某种酶的结构通过共价修饰〔如磷酸化、腺苷酰化〕,使该酶在活性形式与非活性形式之间相互转变,这种调节称为共价修饰调节.五、分析和计算题1.酶的专一性是指酶选择性地催化一种或一类物质发生某种类型的化学反应.根据对底物的选择性,酶的专一性可以分为结构专一性和立体异构专一性.结构专一性指酶对底物的化学键或功能团等有选择,例如肽酶只能水解肽键, 酯酶只作用酯键.立体异构专一性指酶对底物的构型有选择.例如只作用于L构型或只作用于顺式构型.根据过渡态互补假说,酶的专一性实质上是酶与底物分子在结构上互补.2. 影响酶催化效率的有关因素包括：〔1〕邻近效应与定向效应.邻近效应是指酶与底物结合后,使底物和底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近而使有效浓度得以升高,从而使反应速率加快的一种效应；定向效应是指反应物的反应基团之间、酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向产生的效应.〔2〕底物形变和诱导契合.当酶遇到底物时,可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低,产生"电子X力〞,使底物分子发生形变比较接近它的过渡态,降低了反应活化能,使反应易于发生.〔3〕酸碱催化.酸碱催化是通过瞬时向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态,加速反应的一类催化机制.〔4〕共价催化.在催化时,亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或接受电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心,迅速形成不稳定的共价中间复合物,降低反应活化能,使反应加速.〔5〕微环境的作用.酶的活性部位形成的微环境通常是疏水的,由于介电常数较低,可以加强有关基团之间的静电相互作用,加快酶促反应的速率.在同一个酶促反应中,通常会有上述的3个左右的因素同时起作用,称作多元催化.3.酶的活力中心通常包括两部分：与底物结合的部位称为结合中心,决定酶的专一性；促进底物发生化学反应的部位称为催化中心,它决定酶所催化反应的性质以与催化的效率.有些酶的结合中心与催化中心是同一部分.对ES和EI的X-射线晶体分析、NMR分析、对特定基团的化学修饰、使用特异性的抑制剂和对酶作用的动力学研究等方法可用于研究酶的活性中心.4.〔1〕蛋白浓度=0.2×6.25mg/2mL=0.625mg/mL；〔2〕比活力=〔1500/60×1ml/0.1mL〕÷0.625mg/mL=400U/mg；〔3〕总蛋白=0.625mg/mL×1000mL=625mg；〔4〕总活力=625mg×400U/mg=2.5×105U.5.底物浓度、酶含量、温度、pH、产物等均影响酶的活性,激活剂或抑制剂也会强烈影响酶的活性.酶在细胞或组织中是受到细胞调控的.细胞对酶活性的控制主要是通过代谢反馈、可逆的共价修饰、细胞区室化和酶原激活等控制.制备酶制剂时,要尽量避免高温、极端pH、抑制剂等的影响,酶制剂应尽可能制成固体,并在低温下保存.无法制成固体的酶,可在液态低温保存,但要注意某些液态酶在冰冻时会失去活性.第3部分核酸一、填空题1．核酸完全的水解产物是________、_________和含氮碱.其中含氮碱又可分为________碱和__________碱. 2．mRNA在细胞内的种类多,但只占RNA总量的____,它是以_____为模板合成的,又是_______合成的模板.3．嘌呤环上的第________位氮原子与戊糖的第________位碳原子相连形成________键,通过这种键相连而成的化合物叫_________.4．体内两种主要的环核苷酸是_________和_________.5．写出下列核苷酸符号的中文名称：ATP__________,dCDP________.6．核酸的基本结构单位是_____.7．tRNA的三叶草型结构中有________环,________环,________环与________环,还有________.8．tRNA的三叶草型结构中,其中氨基酸臂的功能是_________,反密码环的功能是___________.9．真核细胞的mRNA帽子由___组成,其尾部由___组成,他们的功能分别是______,_______.10．DNA热变性之后,如果将溶液迅速冷却,则DNA保持____状态；若使溶液缓慢冷却,则DNA重新形成___.11．脱氧核糖核酸在糖环______位置不带羟基.。