凝胶过滤层析资料

凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。

该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。

凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。

1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。

这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。

2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。

凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。

聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。

3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。

通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。

4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。

加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。

5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。

较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。

洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。

6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。

7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。

凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。

但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。

另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。

一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。

2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。

3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。

二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。

层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。

当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。

因此，不同大小的蛋白质得以分离。

三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。

2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。

3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。

4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。

5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。

6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。

五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。

通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。

2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。

峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。

六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。

2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。

在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。

3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。

凝胶过滤层析基本原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的技术方法，其基本原理是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子大小和电荷差异，将混合物中的目标分子从其他分子中分离出来。

在凝胶过滤层析中，常用的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

这些凝胶材料具有多孔结构，可以形成一种网络状的三维结构。

目标分子可以通过这些孔隙进入凝胶内部，而其他分子则因孔隙的大小或电荷而无法进入，从而实现目标分子的分离。

凝胶过滤层析的基本步骤包括样品加载、洗脱和分离。

首先，将混合物样品加载到凝胶柱上，样品中的分子会根据其大小和电荷的不同，以不同的速率进入凝胶内部。

然后，通过洗涤凝胶柱，将非目标分子洗脱掉，使其通过凝胶柱。

最后，目标分子可以通过改变实验条件，例如改变缓冲液pH值、离子强度等，从凝胶中洗脱出来。

凝胶过滤层析的优势在于其操作简单、成本低廉、适用范围广，可以用于分离和纯化多种生物大分子，如蛋白质、核酸等。

同时，凝胶材料的孔隙结构可调控，可以根据实验需要选择不同的凝胶材料和孔隙大小，以实现对目标分子的高效分离。

凝胶过滤层析是一种基于凝胶材料的分离技术，通过利用凝胶的孔隙结构和分子特性的差异，实现混合物中目标分子的分离和纯化。

该技术简便易行，适用范围广泛，对于生物分子的研究和应用具有
重要意义。

凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。

原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。

因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。

最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。

中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。

材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。

1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。

1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。

因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。

如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。

1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。

即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。

这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。

1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。

1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。

通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。

它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。

凝胶过滤层析
凝胶过滤层析法是一种常用的实验室分析技术，它可以将混合溶液分离成不同的成分。

该方法主要利用一种含有疏水性的底物的结构性聚合物（凝胶）作为滤床，通过滤床上物
质的比较灵活的空间配比，利用物质的大小、形状、电荷、形态等分子特性的不同，进行
凝胶过滤层析，实现它们的分离和分离富集提纯加离。

凝胶过滤层析实验室分析中，根据物质与凝胶分子相互作用方式不同，分为离子交换
层析和非离子交换层析两种方式。

离子交换层析中，常用的凝胶有Amberlite XAD-2、Amberlite IR-120等；而非离子交换层析中，常用凝胶有Sephadex G-50、Sepharose 4B、Flysorb V、ComboGel等。

凝胶过滤层析实验属于实验离子交换，首先应正确配置实验设备，然后将原混合胶固
化成凝胶颗粒，最后将混合溶液放入过滤室中，并以规定的渗透速率和浓度进行过滤，
实现各成分的分离和分离技术的提纯。

通过此技术，不仅能有效地分离和提纯高浓度的有
用物质，而且可以获得具有不同性质的物质，获得较高纯度的有用物质。

凝胶过滤层析作为一种相对简单、快捷、可操作性强的实验方法，已广泛应用于药用
植物材料及药物分析、环境污染物实验分析、食品分析、细胞培养分析等领域，可满足实
验研究中分离富集提纯加离的需要。

【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。

本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。

（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。

（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。

（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。

可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。

多洗几次，尽量洗干净。

自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。

充分溶胀后，进行真空脱气。

（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。

（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。

（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。

（8）上样：上样量在5%~10%。

（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。

三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。

凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析是一种常用的分离和纯化蛋白质的方法。

它利用了凝胶的孔径大小，将不同分子质量的蛋白质分离开来。

工作原理如下：首先，将凝胶过滤层析柱装满含有孔径较大的凝胶颗粒的柱子。

当混合物被施加于柱子上方时，较大的分子无法通过凝胶颗粒的孔径，而较小的分子可以流过凝胶颗粒，并逐渐被洗脱出来。

这样，分子量较大的蛋白质被留在柱子中，而分子量较小的蛋白质则被洗脱出来。

通过控制凝胶孔径的大小，可以根据目标蛋白质的分子量选择合适的凝胶颗粒。

常见的凝胶颗粒包括琼脂糖、聚乙二醇、聚丙烯酰胺等。

凝胶过滤层析的原理基于凝胶的筛分作用，而凝胶颗粒的孔径大小可以调节分子质量的分离范围。

这种方法在生物化学和分子生物学中广泛应用，用于蛋白质的富集、分离和纯化，为后续的实验和分析提供了可靠的样品。