《凝胶过滤色谱填料》PPT课件

溶质只依据其分子体积（流体力学体积） 的大小而分离。
与其他色谱相比较的优点：
①出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi 和V0之间，且不需要梯度淋洗。
②溶质与固定相（填料）和流动相之间没 有相互作用。 ③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上， 故柱寿命长。
与其他色谱相比较的优点：
④可用于测定生物大分子的分子量 ⑤生物相容性好，有很高的活性回收 率 ⑥负载量较大，利于制备分离。
凝胶过滤色谱的渗透极限：
指的是可用于分离的样品的最大分子量。 一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二 醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意 的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形， 而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此工 作曲线会带来很大的误差。故最好以蛋白 质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作曲 线。
凝胶过滤色谱填料的种类和性能
用于凝胶色谱的填料主要是 用天然的多糖类原料制成的， 早 它们的机械强度低，粒径较 期 大而不均匀，很难在高流速 下流，费时、费力且分辨 率也很低。
理想的高效凝胶色谱填料应具备以下性能： 6.具有较高的孔径， 1.机械强度高，能耐受 以利于得到高分容量。 几兆帕的操作压力。 较高的化学稳定性， 2.7. 球形颗粒，粒子直径 控制在 3~10um，且粒 有较宽的适用 PH值 径分布窄，达到高柱效。 范围. 3.具有亲水性表面，以 8.有较好的生物相容 利降低疏水性效应。 4.性，不会引起生物活 非离子性，表面没有 性物质的失活和降解。 离子交换基团。 5.9. 孔径约为 5~100nm之 容易处理和充填。 间，以适应不同分子量 10.价格合理。 范围物质的分离只需。
凝胶过滤色谱填料
第三组
目录
凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 的 种 类 和 性 能 常 见 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料
概 述
凝 胶 过 滤 色 谱 分 离 原 理
凝 胶 色 谱 填 料 的 制 备
凝 胶 过 滤 色 谱 的 应 用
概述
体积排除色谱（SEC） 凝胶过滤色谱是体积排除色谱（ ）的一种。
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由工作曲线可确定该凝胶过滤色 谱柱的分离范围，指的是工作曲 线线性部分所对应的分子量区间。
凝胶色谱填料的制备
• 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直 接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚 糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销 售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是 以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带 上亲水性基团。 • 制备方法如下：见书246 • 即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，以高孔隙度硅 胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型 化学键合硅胶。
凝胶过滤色谱的应用
• 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基 酸锌螯合物螯合率的差异性
采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两 种氨基酸锌螯合物的螯合率，发现该法测定结果与其他测 定方法分析结果一致，表明此法适用于测定蛋氨酸锌的螯 合率
但测定苏氨酸锌螯合物的螯合率时，测定结果与其他测定 方法分析结果不一致，结合葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定 过程，表明此法不适用于测定苏氨酸锌的螯合率。
凝胶过滤色谱的应用
• 例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase 的凝胶过 滤色谱复性
方法: 使用透析和凝胶色谱对Fibrolase 复性进行 研究, 比较2 种复性方法的相对复性率及蛋白质 回收率。结果: 2 种复性方法的复性率分别为 20%、25%, 蛋白质回收率分别为16%、5%。
结论:凝胶过滤色谱复性优于透析法复性, 凝胶过 滤色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行, 简 化了操作程序, 提高了产品回收率。
主要缺点：
分辨率及峰 容量均相对 较低。
凝胶过滤色谱的分离原理
◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱 如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁 中进。 流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的 ◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。 孔体积。这样，分子体积不同的混合物一起进 ①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中， 入柱端时，经过淋洗、扩散，总是体积大的分 即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。 子先流出柱子，小分子量即体积小的分子印刻 ②分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的 进入凝胶的孔中，使其行程延长而滞后流出， 差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔； 从而使分子体积不同的分子得以分离。
世 纪 年 代 中 期
以可控孔径玻璃（CPG）、 硅胶为基质的无机基质高效 凝胶色谱填料和以合成高分 子或高交联天然高分子为基 质的有机高效凝胶色谱填料 相继问世，他们均基本上可 以满足上述要求。
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粒度及粒度分布
孔径或孔径分布 孔容
关系到凝胶色谱柱 因此，用作凝胶 的分离容量。根据 粒径及粒径分影响 分离介质的硅胶， 凝胶色谱柱的一般 其柱效 理论，孔容愈大， 必须具有较高的 所填装的柱子的分 例如，通常所使用 孔度。对于多空 辨率和柱子的容量 的直径 5um的软 硅胶而言， Ψ一 就愈高。因此，用 般在0.6~0.7， 胶，能达到理论塔 作凝胶分离介质的 故Vi/V 0值应在 板数 1500/m 左右 硅胶，必须具有较 1.05~1.23之间 的柱效 高的孔容。
常见凝胶过滤色谱填料
• 表11-8列出了常见的无机型亲水凝 胶，尽管牌号各异，但其化学本质 几乎均是二醇型化学键合硅胶。
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见书本247页
凝胶过滤色谱的应用
• 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性
利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解 液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量 分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离 组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定 法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属 铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化 能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC 分离和氨基酸组成分析