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培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞产生巨噬细胞集落刺激因子及其受体的表达

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生理学报,1999年4月,51(2),175～180　175　Acta Physiologica Sinica电针对用缓激肽刺激胆囊表面所诱发的心血管反应的抑制效应3晁东满　沈霖霖　曹银祥　李　鹏(上海医科大学生理教研室,上海200032)摘　要 在α2氯醛糖麻醉的猫上,结扎左心室冠状动脉前降支(LAD)一小分支,对动物胆囊浆膜面予以缓激肽(BK),可反射性地诱发血压、左心室内压升高、±dP/dt max增大、心率加快,同时用超声单晶片声纳测微系统记录局部心壁运动,发现BK可以反射性地引起LAD小分支远端所支配的心肌运动功能减弱。

电针内关穴对BK诱发的升压反应有抑制作用,并可改善局部心肌运动功能。

静脉注射纳洛酮(014mg/kg)能翻转电针效应。

结果表明,电针能够抑制BK诱发的升压反应和改善局部心肌运动功能,该效应与内源性阿片肽有关。

关键词:胆囊;缓激肽;电针;升压反应;局部心壁运动;纳洛酮学科分类号:Q463 大量证据表明,在胆囊与心血管系统之间存在相互作用。

以缓激肽(BK)刺激胆囊浆膜面,可反射性激活心血管系统,出现血压(BP)升高、心率(HR)加快、心肌收缩力增强、系统血管阻力增大,在一些个体上,还引起冠状动脉收缩[1,2]。

冠脉收缩可使冠脉血流量减少或限制冠脉血流量的正常增加,从而导致心肌氧的供需失衡,引起心肌缺血。

有报道表明,电针对急性缺血性心肌损伤和心梗的恢复具有保护和促进作用[3,4]。

对躯体神经予以针刺样刺激,能有效地抑制刺激PAG防御反应区所诱发的升压反应[5],对自发性高血压大鼠产生持久的心血管抑制效应[6]。

内源性阿片肽介导了针刺效应[7,8]。

本研究目的在于:(1)观察针刺对用缓激肽刺激胆囊浆膜面所诱发的升压反应和心肌运动功能改变是否有抑制效应;(2)如果有效应,那么,针刺效应能否为内源性阿片肽拮抗剂纳洛酮所翻转,以便作进一步机制分析。

1　材料和方法111　动物与麻醉 成年猫,体重218～414kg,雌雄兼用。

先以盐酸氯胺酮(40mg/kg, im)快速诱导麻醉,随后迅速分离右侧股静脉并插管,经股静脉插管注射α2氯醛糖(50mg/ kg),做进一步麻醉。

实验中,必要时补注射α2氯醛糖(10mg/kg,iv),使动物保持在适当的麻醉深度。

112　手术 动物仰位固定,行气管插管术。

用人工呼吸机(第二军医大学江湾Ⅰ型)进行人工呼吸,定时检测动脉血气和pH值,通过提高吸入气中O2含量和调节通气率和通 1997211226收稿 1998204220修回 3国家自然科学基金资助项目(N o139570272)671生 理 学 报 51卷气量使动脉血中P O2和P C O2保持于正常范围(P C O24～417kPa,P O2>1313kPa),动脉血液pH值保持于7132～7143之间,必要时静脉注射8%NaHC O3加以校正。

动物体温由插入直肠内的温度探头监测,并通过电热毯和加热灯使其保持在36～38℃。

行股动脉插管术,以测量动脉BP,并由血压波触发导出HR及平均动脉压(M AP)(Heart Rate C ounter,Pressure2 meter,Nihon K ohden,Japan)。

将一聚乙烯细塑料管沿左侧颈总动脉插入左心室内,以测量左心室内压(LVP),并由LVP导出±dP/dt max。

沿腹正中线切开腹壁,暴露胆囊。

手术后,用一小夹夹住腹壁切口,只有在用缓激肽刺激胆囊时才打开腹腔,以避免胆囊干燥和腹腔过分散热。

行开胸术以暴露心脏和冠状动脉。

仔细分辨左心室冠状动脉前降支(LAD)分支,在靠心底附近选一小分支,并由其下穿以细的无损伤医用缝合线备用。

用组织粘合剂(3M Animal Care Products,G ermany)将超声单晶片声纳测微系统(Ultras onic Single2Crystal S onomicrometer System,SCS1Division of Cardiovascu2 lar,University of California,US A)[9]的晶片传感器固定于所选LAD分支远端所支配的左室心肌表面,以便测量心动周期中局部心室壁厚度的变化,其中包括收缩末厚度(end2systolic di2 mensions,ES D)和舒张末厚度(end2diastolic dimensions,E DD)。

心肌厚度的变化(%WTh)表示如下:%WTh=100×[(ES D2E DD)/E DD][9].手术结束后,于胸壁切口上覆以浸有温热生理盐水的纱布,以防止心脏干燥。

113　药物 缓激肽(BK Sigma):用生理盐水配成10μg/ml,该浓度是诱发最大心血管反应的最佳浓度[10]。

将浸有BK溶液的滤纸片(1cm2)贴于胆囊浆膜面,当心血管系统出现最大反应时(一般需60～90s),将其从胆囊上移去,并用蘸有生理盐水的棉签轻洗胆囊表面数次,以除去残余BK,通常反应历时5～6min。

为了防止胆囊对BK反应脱敏,每2次给药至少相间15min。

纳洛酮(NA L Sigma)用生理盐水配成014mg/ml,备用。

114　实验程序 实验在手术结束后动物稳定1h后进行。

先观察正常状态下用BK刺激胆囊浆膜面所诱发的心血管反应,然后结扎所选LAD分支,再观察BK引起的心血管反应变化;取双侧前肢“内关穴”给予电针,观察电针对结扎LAD分支后BK所引起的心血管反应变化的影响。

电针刺激信号由恒压刺激器输出。

刺激参数:强度1～4V(以引起前肢抖动为宜),波宽015ms,频率4H z,针刺时间30min。

最后,观察针刺效应是否为静脉注射NA L(014mg/kg)所翻转。

上述各观察指标均记录于RM26000型八道生理记录仪(Nihon,K ohden)。

115　数据处理 各指标所得数据先经ANOVA进行总体检验,在此基础上,进一步进行配对t检验。

结果表示为均值±标准差(x±s),P<0105则表示有显著性差异。

2　结果211　用BK刺激胆囊浆膜面所引起的心血管反应正常静息状态下,动物的M AP、LVP、+dP/dt max和-dP/dt max分别如表1所示。

用BK刺激胆囊浆膜面,心血管系统除HR无显著变化外(由17918±914次/min增至18612±913次/min ,P >0105),其余各指标都产生较为强烈的反应(图1),与刺激前相比,有显著的统计学差异;由于ES D 的增加,%WTh 由静息时的1011±116增加至1412±210(P <0105)(表1)。

所有的反应均可在前次反应恢复15min 后再次发生,而且前后2次反应的幅度基本一致。

以生理盐水替代BK,并且以同样的方式将其给予到胆囊浆膜面时,不能诱发心血管系统反应。

图1　给予胆囊缓激肽所诱发的心血管反应Fig 11　Cardiovascular responses ev oked by applying bradykinin on the gallbladderof cats212　结扎LAD 一小分支对用BK 刺激胆囊浆膜面所诱发的心血管反应的影响结扎LAD 一小分支后,与对照静息状态时相比,有些指标数值虽略有减小,但其变化无统计学差异(P >0105)(表1)。

换言之,结扎LAD 一小分支对静息时心血管系统并无影响。

用BK 刺激胆囊浆膜面,以上各指标均发生变化(表1)。

与对照时相比,除+dP/dt max 的增幅有明显减小(P <0105)外,M AP 、LVP 、-dP/dt max 的增幅均无显著改变(P >0105),表明结扎LAD 一小分支对BK 诱发的心血管反应影响也不大。

但是,在结扎LAD 一小分支后,该分支血管远端所支配的心壁的厚度变化由静息时1113±117减小到711±019,变化幅度为-412±110,与对照时相比,差异十分显著(P <01005)。

提示在结扎LAD 一小分支后,BK 可以反射性地诱发局部心肌缺血。

213　电针对BK 所诱发的心血管反应的影响电针后,与结扎静息时相比,心血管系统无明显变化(表1)。

用BK 刺激胆囊浆膜面时,所诱发的升压反应幅度变小,与结扎时相比,M AP 、LVP 、+dP/dt max 和-dP/dt max 的增幅有显著性差异;%WTh 由810±116增至818±112,增幅为018±113,与对照时相比,无显著性差异(P >0105),但与结扎时相比,则差异明显(P <0105)。

提示针刺可改善BK 诱发的局部心壁运动功能降低(表1)。

7712期 晁东满等:电针对用缓激肽刺激胆囊表面所诱发的心血管反应的抑制效应871生 理 学 报 51卷表1　用BK刺激胆囊浆膜面所诱发的心血管反应T able1　Cardiovascular responses ev oked by applying BK on the serosal surface of the gall2 bladder of cats(n=9)　M AP　LVP+dP/dt max-dP/dt max　%WThC ontrol R1413±0182012±11152617±571842516±34171011±116B2010±115332615±1143372012±87143354512±561531412±2103Δ517±110613±11219316±381013413±3211　411±111Ischemia R1411±0182011±11149417±471639111±33141113±117 B1816±112332417±1123362619±6819351812±52163　711±0193Δ414±018417±11013211±2915‹12711±2910-412±110‹E A R1411±0192012±11152510±491940310±3612　810±116B1614±110332310±111360413±6517346811±38133　818±112Δ213±013›219±017›7913±2111›6317±2017#　018±113#Nalox one R1418±0182016±11153513±471142819±3518　815±118 B1915±11132514±1103366417±7213353116±52133　711±019Δ416±016512±11013011±291210217±3218-114±111R:resting state;B:bradykinin;E A:electroacupuncture13P<0105,33P<01001compared with R;‹P<0105compared with control;›P<0105compared with ischemia and nalox one groups;#P<0105com2pared with ischemia group.The unit of M AP,LVP and±dP/dt max is kPa and kPa/s respectively.All datawere obtained from9cases except that of%WTh with6.214　静脉注射NA L对电针效应的影响静脉注射NA L(014mg/kg)后,静息时除HR有轻微变慢(由17312±913减至17118±819)外,其余各指标数值均略有增加,但与前面各静息时相比,均无统计学差异(P>0105) (表1)。

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近年来，有关血管平滑肌细胞(VSMC)在动脉粥样硬化中作用的研究逐渐深入。

VSMC分为收缩型和合成型，当血管遭受机械或化学物质刺激时，VSMC转变为收缩型，做出收缩反应，而合成型VSMC主要分泌细胞外基质以及血管活性物质。

VSMC在正常的血管壁上表现为收缩型，标志性蛋白为α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)和调宁蛋白，合成型VSMC标志性蛋白为骨桥蛋白和糖基质蛋白[2]。

收缩型VSMC由血管中膜迁移进入血管内膜，转化为合成型VSMC并大量增殖，导致内膜变厚、脂质沉积，最终导致动脉粥样硬化形成。

外泌体是直径为40～100 nm的脂质包裹体，内含多种活性物质或蛋白，经细胞分泌后在血液、体液中传播，最后可被其他细胞吞噬，介导细胞间信息传递。

Perrottap等[3]通过电镜发现，正常主动脉的内皮细胞不含外泌体，位于中膜的平滑肌细胞中存在少量清晰标记的外泌体；但在病变血管中，两种细胞内均存在大量外泌体。

该研究发现，平滑肌细胞的外泌体有两种类型，一种具有双层膜结构，直径40～100 nm，起源于多泡体的外膜内陷并且内含多泡体；另一种类似在人和小鼠心肌终隔细胞中广泛存在的外泌体，其体积各异，由磷脂双分子层包裹。

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天津医药2020年7月第48卷第7期巨噬细胞极化对心肌成纤维细胞活化的影响吴惠娟1，张盛昔1，杨潇2，胡因铭1，王乐旬1△，郭姣1摘要：目的观察巨噬细胞极化上清对心肌成纤维细胞活化的影响。

方法提取SD 大鼠的骨髓细胞和心肌成纤维细胞。

利用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF ）处理骨髓细胞后，加入刺激因子：M0（无刺激因子）、M1（100μg/L 脂多糖+10μg/L 干扰素-γ）、M2（20μg/L 白细胞介素-4）诱导巨噬细胞极化。

将极化后的不同型别巨噬细胞及其培养上清分别与心肌成纤维细胞共培养，分别设空白对照组、M0组、M1组和M2组，通过细胞免疫荧光检测心肌成纤维细胞中纤维化蛋白的表达水平；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测巨噬细胞和成纤维细胞特征分子的表达；Western blot 检测纤维化相关蛋白及转化生长因子β受体（TGFβR ）、血小板衍生生长因子受体（PDGFRs ）信号通路活化情况。

结果经M-CSF 及相应刺激因子诱导，成功获得M1和M2型巨噬细胞。

细胞共培养结果显示，与M0组相比，M1组上清培养的心肌成纤维细胞中胶原蛋白1（Col1a1）和Col3a1的mRNA 水平以及平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）表达水平显著降低（P ＜0.05），而M2组上清培养的心肌成纤维细胞中Col1a1和Col3a1的mRNA 水平以及α-SMA 、结缔组织生长因子（CCN2）表达水平显著升高（P ＜0.05）。

M1组上清培养的心肌成纤维细胞中PDGFRβ蛋白磷酸化水平显著低于M0组（P ＜0.01），而M2组上清培养的心肌成纤维细胞中PDGFRβ蛋白磷酸化水平显著高于M0组（P ＜0.05）。

结论M1型巨噬细胞上清能够抑制心肌成纤维细胞活化，而M2型巨噬细胞上清能够激活心肌成纤维细胞。

M1型巨噬细胞抑制纤维化的作用可能与抑制PDGFRβ通路的活化有关。

关键词：纤维化；心脏；成纤维细胞；巨噬细胞；受体，血小板源生长因子β中图分类号：R392.12文献标志码：ADOI ：10.11958/20200169Effects of macrophage polarization on the activation of cardiac fibroblastWU Hui-juan 1,ZHANG Sheng-xi 1,YANG Xiao 2,HU Yin-ming 1,WANG Le-xun 1△,GUO Jiao 11Guangdong Metabolic Disease Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine,Guangdong Key Laboratory of Metabolic Disease Prevention and Treatment of Traditional Chinese Medicine,Joint Laboratory of Guangdong,Hong Kong and Macao on Glycolipid Metabolic Diseases,Institute of Chinese Medicine Sciences,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2Department of Clinical Laboratory,Guangzhou First People's Hospital△Corresponding Author E-mail:*********************Abstract:ObjectiveTo observe the effects of macrophage polarization supernatant on the activation of cardiacfibroblasts.MethodsBone marrow cells and cardiac fibroblasts of SD rats were extracted.Bone marrow cells were inducedto M1and M2by treating with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF),and cells were divided into M0group (no stimulating factor),M1group (100μg/L LPS+10μg/L INF-γ)and M2group (20μg/L IL-4).Different macrophages were co-cultured with cardiac fibroblasts,and different macrophage supernatants were collected to culture with cardiac fibroblasts.Immunofluorescence was performed to examine the fibrotic protein expression in cardiac fibroblasts.The mRNA levels of macrophage-specific molecules,fibrosis-related genes and signaling pathways were tested by real-time PCR.The fibrosis-related proteins and the activation of TGFβR and PDGFRs signal pathways were detected by Western blot assay.Results After treatment with M-CSF and stimulating factors,M1macrophages and M2macrophages were pared with the M0group,the mRNA levels of Col1a1and Col3a1and the protein level of α-SMA were significantly decreased in the cardiac fibroblasts treated by the supernatant of M1macrophage group (P ＜0.05),while the mRNA levels of Col1a1and基金项目：广东省自然科学基金博士启动纵向协同项目（2018A030310403）；广东省自然科学基金（2018A0303130168）；广东省医学科学技术研究基金（A2018068）；广东省基础与应用基础研究基金项目（2020A1515010155）作者单位：1广东省代谢病中西医结合研究中心，广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，粤港澳联合代谢病重点实验室，广东药科大学中医药研究院（邮编510006）；2广州市第一人民医院检验科作者简介：吴惠娟（1995），女，硕士在读，主要从事中医药防治糖脂代谢病方面研究△通信作者E-mail ：*********************细胞与分子生物学611Tianjin Med J,July2020,Vol.48No.7《中国心血管病报告2018》显示我国心血管病现患人数约为2.9亿，其中90%以上与心脏有关［1］。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子实验动物研究进展

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潘伯荣;梁国栋
【期刊名称】《浙江医学情报》
【年(卷),期】1995(000)004
【摘要】粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granul—ouyte—macrophage colony—stimulatingfactor,GM—CSF)已通过基因重组,制得纯化的 rhGM—CSF,并显示出良好的应用前景。

大量实验研究表明,rhGM—CSF 是所有粒细胞的全刺激物(pan—stimulator),有多种刺激造血。

【总页数】5页(P9-12,8)
【作者】潘伯荣;梁国栋
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
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