改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养

酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞目的：采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞，为血管疾病，特别是为动脉粥样硬化研究提供大量的原代平滑肌细胞。

方法：无菌取老龄SD大鼠主动脉，0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离细胞，采用自然纯化、差速贴壁纯化平滑肌细胞，免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。

结果：免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。

结论：酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单，易掌握，采用本方法可稳定获得大量的平滑肌细胞供实验使用。

[Abstract] Objective: To investigate the method of culture aged Sprague-Dawley(SD) rat vascular smooth cells (VSMCs) through enzyme digestion for supplies larges amounts of primary cells for vascular diseases. Methods: VSMCs were isolated from aged SD rat thoracic aortas by enzyme digestion and cultured with the technique of differential anchoring velocity. The expression of α-SMA was dected by immunocytochemistry. Results: Immunohischemistry revealed that the purity of VSMCs exceeded 95%. Conclusion: VSMCs can be gained easily by enzyme digestion in vitro. This method can supply larges amounts of VSMCs for scientific research and experimentation.[Key words] Smooth muscle cells; Enzymatic isolation method; Immunohistochemical staining; α-actin随着对心血管疾病，特别是动脉粥样硬化研究的进一步深入，提供稳定、大量的老龄大鼠血管平滑肌细胞是进行这些研究的基本保证。

小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。

方法改良酶消化法。

结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。

结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。

吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。

体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。

1．大鼠PASMCs的提取和原代培养(1)提取：对雄性SD大鼠用5％的水合氯醛经腹腔麻醉后，浸泡在75％的乙醇中5 rain。

将麻醉后的大鼠在超净工作台中固定好，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1％青链霉素的PBS培养皿中。

转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，眼科镊仔细剥离出肺动脉(包括肺动脉主干和左右肺动脉干)。

将已分离出的肺动脉用含1％青链霉素的HBSS冲洗数次，直至液体清亮为止，以尽量减少血细胞等的混入。

眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮2～3遍，去除内膜。

再将外膜面翻转过来，同样方法刮去外膜。

将中膜转移至盛有含20％胎牛血清的DMEM／F12的培养基中，用眼科剪反复剪成1 am×l mm×1 mm 的小组织块。

用滴管将小组织块转移至25T的培养瓶中，均匀的摆放与于瓶底，间距约0．5 cm。

加入3 mL含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液，瓶底朝上，静置于37 oC、5％CO，的细胞培养箱巾孵育4～5 h。

待小组织块干涸后，轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润瓶底上的小组织块，继续静置于培养箱中培养。

(2)原代培养：3—5 d后，有少量细胞从组织块周围游离出来；8—10 d后细胞融合成片，成峰．谷状分布，用胰酶消化传代。

一般2—3 d更换培养液，提取PASMCs 时用含20％胎牛血清的DMEM／F12，培养时用含15％胎牛血清的DMEM／F12。

采用生长状态良好的3～5代细胞进行后续实验。

取材、细胞原代及传代培养SD 大鼠肌注氯胺酮（22 mg / kg）麻醉后，作下腹部横切口，切取双侧输精管。

剥去外膜组织，小圆刀片刮除内膜，4 C PBS缓冲液（含青霉素100 U/ mI、链霉素100#g / mI）反复漂洗4 ~ 6遍，然后剪碎成1 mm3 大小的组织块。

先用0.1%的"型胶原酶消化作用10 min，倒去上清液，再加0.2% 的胰蛋白酶和0.1%的"型胶原酶消化20 min，使游离成单个细胞，600 > ! 离心5 min，收集消化的细胞，接种至25 cm2 培养瓶，加含20%胎牛血清的DMEM 培养液，置37 C含5%CO2孵箱中培养。

平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。

将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。

用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。

分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。

冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。

肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。

2、 75％消毒用酒精2瓶，5%碘酒1瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，M199培养基100ml（含4mmol/L 的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。

3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，1ml 吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。

二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。

2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。

3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。

4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。

左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。

打开紫灯消毒30min。

5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。

6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。

7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。

8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。

9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS 冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞[ 11-03-31 14:28:00 ] 作者：吴海亚，戴元荣，尹娟编辑：studa20【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。

方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。

结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。

传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。

结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。

【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。

ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。

Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。

体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。

本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。

1 材料和方法1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。

饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。

1.2 主要仪器和试剂倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

分化型血管平滑肌细胞的原代培养牛建平;周志斌;史树海;彭瑞强【期刊名称】《中华老年心脑血管病杂志》【年(卷),期】2008(10)12【摘要】目的建立大鼠主动脉分化表型血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)原代培养,为研究VSMC表型转化的分子机制提供体外研究模型.方法无菌条件下分离大鼠胸主动脉中膜,组织贴壁法在Ⅳ型胶原蛋白包被培养瓶内培养大鼠胸主动脉VSMC,消化、过滤、离心,收集从组织块分离的单个细胞后,接种于含0.2%小牛血清、胰岛素样生长因子Ⅰ、DMEM培养液的层粘连蛋白包被的培养板上,培养1天后将培养液更换为不合血清及生长因子的DMEM.结果根据细胞形态观察、免疫组织化学鉴定、兴奋剂刺激引发的收缩反应、分化型VSMC 标志基因的检测,证实为分化型VSMC,分化状态可持续1周以上.结论在组织贴壁法基础上,改变培养环境,可使VSMC较长时间保持于分化状态,是研究VSMC表型转化的分子机制良好的体外研究模型.【总页数】3页(P928-930)【作者】牛建平;周志斌;史树海;彭瑞强【作者单位】361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】Q813.1【相关文献】1.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德;2.两种原代培养方法对血管平滑肌细胞收缩表型的影响 [J], 周昌钻;郭航远;孟立平;季政;3.移植物动脉硬化模型大鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定 [J], 张远标;尚敏杰;王知非;洪德飞;王伟林;郑跃英4.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德5.改良有效的培养大鼠原代血管平滑肌细胞的方法 [J], 邓惠坚;卢群;林转娣;审校因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。

以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。

2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。

3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。

4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。

5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。

6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。

7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。

8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。

9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。

10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。

需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。

同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。

SD大鼠平滑肌的分离
1、300g左右大鼠戊巴比妥钠1ml注射麻醉（用20 mg/L的戊巴比妥钠按照50 mg/kg腹腔注射麻醉）。

10分钟后固定于解剖板上，酒精消毒，剪开腹部，挑开内脏，寻找腹主动脉，用静脉留置针尽量抽血。

2、抽干血液，剪开胸腔，翻开肺脏，寻找与心腔相连的胸主动脉（连接处有3个开口），沿着脊柱一直向下延伸（注意与食道区别，食道与胃连接），钝性分离周围脂肪组织，剪断后放入生理盐水中，冲洗干净血液，用镊子夹住一段，另一镊子从上至下用力刮脱，分离掉血管周围的脂肪组织。

3、转入超净台中，用PBS（或生理盐水）清洗，滴入少许胎牛血清至血管，在血清中剪碎血管组织，置入培养箱中2h。

4、随后加入20%胎牛血清低糖DMEM培液（最好加抗生素），继续培养。

血管平滑肌细胞分离及培养血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）是血管中膜的主要细胞成分。

具有增殖、迁移、合成并释放细胞基质的能力，在血管性疾病的发生进展中有重要作用。

目前已了解到血管平滑肌细胞的增殖和增生是动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉腔内成形术后再狭窄等的主要病理表现。

利用体外培养血管平滑肌细胞可了解其正常和病态生物学特性及机制。

体外培养血管平滑肌细胞举行药物药理学方面的讨论。

体外培养血管平滑肌细胞可取材于不同动物及人胚胎或成体的不同部位的血管，按照讨论目的举行挑选。

血管平滑肌细胞分别培养办法较多，主要有簇拥细胞培养法、植块培养法、微血管培养法。

其中植块培养法可得到数量较多的平滑肌细胞而适用于药理讨论。

还可按照讨论需要将分别得到的平滑肌细胞举行蜕变培养、克隆培养、与内皮细胞共培养等。

【材料】 1．动物或人胚胎血管。

2．试剂 0.1%、0.1％,MEM 培养基（含10％新生牛血清，4mmo1/L，10万U/L和l00mg/L）。

Hanks 液（每1000m1含NaCl 8.00g, KCl 0.40g，CaCl 0.14g，MgS04·7H20 0.20g, KH2P04 0.06g, NaHC03 0.35g，glucose 1.00g，0.02g)。

3．器皿及仪器细胞培养用器皿，手术器械，净化工作台、C02孵箱、倒置显微镜、荧光显微镜等。

【办法】 1．簇拥细胞培养法（酶消化法）无菌术取颈或股动脉，于预冷Hanks液中洗涤3次，认真剥除血管表面结缔组织。

将血管纵向剖开移入另一装有0.1％胶原酶(D-Hanks配制）消化液的平皿中。

37℃消化30分钟后，认真剥离外膜及外层中膜并用小刀片轻轻刮除内膜，Hanks液冲洗后移入另一清洁的盛有消化酶平皿中（或剪成1 mm3组织块碎块，置离心管中）37℃消化2～3小时，时常轻晃，至组织呈絮状，收集细胞悬液并与5倍量含10％新生牛血清的培养基混合，终止消化。

01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1 细胞培养1.1.1 培养液配制DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。

1.1.2 培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。

1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。

动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。

每次取材2~3只大鼠。

贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。

纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。

用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。

滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。

并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。

盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。

待有细胞从组织块周围游出后换液。

1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。

加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。

网络出版时间:２０２０－２－１９１２:５９㊀网络出版地址:ｈｔｔｐ://ｋｎｓ.ｃｎｋｉ.ｎｅｔ/ｋｃｍｓ/ｄｅｔａｉｌ/３４.１０６５.ｒ.２０２００２１７.１５２８.０３０.ｈｔｍｌҖ技术与方法Җ大鼠原代肺动脉平滑肌细胞的分离鉴定及低氧对其增殖的影响张凤玉１ꎬ２ꎬ姚德山１ꎬ李如君１ꎬ王㊀军１ꎬ丁昌平１２０１９－１１－２９接收基金项目:国家自然科学基金(编号:８１６００２０２)作者单位:１扬州大学附属医院中心实验室ꎬ扬州㊀２２５００１２复旦大学附属华山医院检验科ꎬ上海㊀２０００４０作者简介:张凤玉ꎬ女ꎬ博士ꎬ责任作者ꎬＥ￣ｍａｉｌ:Ｚｈａｎｇｆｅｎｇｙｕ２０１９＠１６３.ｃｏｍ摘要㊀利用改良的组织贴壁法原代分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(ＰＡＳＭＣｓ)ꎬ探讨低氧对其增殖的影响ꎮ显微操作无菌下取ＳＤ大鼠肺组织ꎬ分离肺动脉㊁剥离肺动脉中层ꎬ用组织块贴壁法培养ꎬ倒置相差显微镜观察细胞形态ꎬ细胞免疫荧光法和α￣平滑肌肌动蛋白(α￣ＳＭＡ)鉴定ＰＡＳＭＣｓ纯度ꎮ常氧和低氧下体外培养ＰＡＳＭＣｓꎬＣＣＫ￣８法测定增殖ꎮ成功培养大鼠原代ＰＡＳＭＣｓꎬ细胞生长及传代稳定ꎬ纯度高达９０％以上ꎮＰＡＳＭＣｓ在低氧下的增殖能力明显低于常氧(Ｐ<０ ０５)ꎮ可选择内径合适㊁雄性来源的ＰＡＳＭＣｓ作为体外研究对象ꎮ关键词㊀大鼠肺动脉平滑肌细胞ꎻα￣平滑肌肌动蛋白ꎻ低氧ꎻ增殖ꎻ内径中图分类号㊀Ｒ５４３.２文献标志码Ａ文章编号１０００－１４９２(２０２０)０２－０３０５－０４ｄｏｉ:１０.１９４０５/ｊ.ｃｎｋｉ.ｉｓｓｎ１０００－１４９２.２０２０.０２.０３０㊀㊀肺动脉高压(ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎꎬＰＡＨ)是由多病因所致ꎬ主要以肺动脉压力增高为特点的进行性和致命性疾病ꎬ通过血管收缩㊁肺血管重构ꎬ最终诱发右心衰竭和死亡[１]ꎮ一旦确诊ꎬ生存时间一般仅为２~８年[２]ꎮ目前ＰＡＨ的判定标准是:静息状态下平均肺动脉压力ȡ３ ３２５ｋＰａꎬ运动状态下ȡ３ ９９ｋＰａ[３]ꎮＰＡＨ主要分为动脉型㊁左心疾病型㊁呼吸系统疾病及低氧相关型等疾病类型ꎬ其中低氧性或称缺氧性ＰＡＨ最为常见[４－６]ꎮ肺动脉平滑肌细胞(ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓꎬＰＡＳＭＣｓ)作为肺血管壁的重要组成成分ꎬ其异常增殖是肺血管重构的主要原因[６]ꎮ近年来研究[７]开始以ＰＡＳＭＣｓ作为细胞模型来探讨ＰＡＨ的分子机制ꎮ该研究改进组织块贴壁法原代分离及培养大鼠原代ＰＡＳＭＣｓꎬ通过Ｎ２诱导低氧培养ꎬ拟研究低氧对于原代分离培养ＰＡＳＭＣｓ的增殖影响ꎮ为研究ＰＡＨ体外细胞水平研究提供良好的模型ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀２只８~１０周龄的清洁级Ｓｐｒａ￣ｇｕｅ￣Ｄａｗｌｅｙ雌性大鼠由扬州大学医学实验动物中心提供ꎬ体质量(１６０ʃ１０)ｇꎬ普通饲料喂养ꎬ自由采光ꎬ饮食ꎬ室温控制在２０ħ左右ꎮ１.２㊀实验仪器与试剂㊀ＹＣＰ系列三气厌氧培养箱购自长沙华曦电子公司ꎻ倒置显微镜㊁荧光显微镜购自日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司ꎻＣＯ２孵育箱购自美国Ｔｈｅｒ￣ｍｏ公司ꎮ水合氯醛购自生工生物公司ꎻ高糖ＤＭＥＭ粉末和胰酶购自美国ＧＩＢＣＯ公司ꎻ胎牛血清购自杭州四季青公司ꎻ青－链霉素购自上海碧云天生物公司ꎻ４％多聚甲醛购自北京索莱宝公司ꎻａｎｔｉ￣α￣ＳＭＡ抗体购自美国ａｂｃａｍ公司ꎬＦＩＴＣ标记的羊抗鼠二抗和ＤＡＰＩ染液购自美国ＣＳＴ公司ꎬＣＣＫ￣８试剂盒购自日本东仁化学公司ꎮ１.３㊀实验方法１.３.１㊀大鼠原代ＰＡＳＭＣｓ分离培养㊀课题组根据实际操作改进如下:水合氯醛(３００ｍｇ/ｋｇ)腹腔注射大鼠ꎬ麻醉后大鼠７５％乙醇浸泡５ｍｉｎꎬ无菌手术台上开胸取出肺组织ꎬ无菌ＰＢＳ漂洗３次ꎮ固定肺叶两端ꎬ手术显微镜下用显微弯镊顺着肺血管走向将肺动脉及三级以下分支分离出来ꎬ剥净血管周围的肺组织㊁神经及筋膜等ꎬ分离干净的肺血管转移至新１００ｍｍ平板中ꎮ显微剪纵行剪开肺血管ꎬ内膜面向上ꎬ用显微弯镊轻轻刮拭内层ꎬ去除内皮细胞层ꎮ眼科剪剪成约１ｍｍ３的小块ꎬ再接种到含１ｍｌＤＭＥＭ培养基(含２０％血清㊁１００Ｕ/ｍｌ青－链霉素)的平皿中ꎬ轻摇培养液ꎬ使每块组织块间距约为０ ８~１ ０ｃｍꎮ静置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱中２ｈꎬ等组织贴牢后ꎬ缓慢添加ＤＭＥＭ培养液(２０％血清㊁１００Ｕ/ｍｌ青－链霉素)完全覆盖住组织块ꎬ继续培养ꎮ１.３.２㊀大鼠原代ＰＡＳＭＣｓ形态及生长特点的观察㊀细胞从组织块周围爬出后ꎬ换液间歇在倒置相差５０３ 安徽医科大学学报㊀ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ㊀２０２０Ｆｅｂꎻ５５(２)显微镜下仔细观察ＰＡＳＭＣｓ形态及生长特点ꎬ拍照ꎮ１.３.３㊀细胞免疫荧光鉴定㊀ＰＡＳＭＣｓ消化后ꎬ以约５ˑ１０５个/ｍｌ的密度接种到放有盖玻片的６孔板中ꎬ待ＰＡＳＭＣｓ贴壁且密度达到３０％~５０％时ꎬ取出６孔板ꎬ弃去培养基ꎬＰＢＳ清洗２次ꎬ４％多聚甲醛室温固定１５ｍｉｎꎬ０ ３％Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ１００室温破膜１０ｍｉｎꎬ５％ＢＳＡ(０ １％Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ１００配制)室温封闭３０ｍｉｎꎬ２００μｌ一抗α￣ＳＭＡ(１ʒ４００ꎬ３％ＢＳＡ㊁０ １％Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ１００配制)滴加于盖玻片上ꎬ４ħ过夜孵育ꎮ第２天室温平衡１ｈꎬＰＢＳＴ清洗５ｍｉｎˑ３次ꎬＦＩＴＣ标记的二抗室温避光孵育１ｈꎬＰＢＳＴ清洗５ｍｉｎˑ３次ꎮＤＡＰＩ避光染色１０ｍｉｎꎬＰＢＳＴ清洗５ｍｉｎˑ３次ꎮ荧光显微镜下拍照ꎮ１.３.４㊀低氧培养ＰＡＳＭＣｓ㊀ＰＡＳＭＣｓ消化后分为低氧组和常氧组培养ꎮ低氧组持续低流量通入纯Ｎ２ꎬ通过数字监控器实时控制Ｏ２浓度为１ ０％ꎬ而常氧组为正常Ｏ２浓度培养ꎮ１.３.５㊀ＣＣＫ￣８检测ＰＡＳＭＣｓ增殖㊀９６孔板中接种ＰＡＳＭＣｓ约１０３个/孔ꎬ分为常氧组和低氧组ꎬ每组设６个复孔ꎮ分别在常氧和低氧下培养０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁２４㊁４８㊁７２ｈ后ꎬ取出培养板ꎬ每孔加入１００μｌ含有１０μｌＣＣＫ￣８溶液的ＤＭＥＭ培养基ꎬ３７ħ继续孵育２ｈꎬ检测４２５ｎｍ处的吸光度值(ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙꎬＯＤ)ꎮ１.４㊀统计学处理㊀采用Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ６ ０软件作图ꎬ并对处理的数据进行统计分析ꎬ实验数据以 ｘʃｓ表示ꎬ２组均数间比较采用ｔ检验分析ꎬ以Ｐ<０ ０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀ＰＡＳＭＣｓ形态及生长特点㊀倒置相差显微镜下观察大鼠原代ＰＡＳＭＣｓ在第５ｄ时从组织块周围爬出ꎬ第７天时细胞呈放射状排列ꎬ大小不等ꎬ形态多样主要有梭形㊁多角形㊁纤维形等(图１Ａ)ꎮ细胞传代第５天ꎬ部分融合交织成网状ꎬ多数呈长梭形ꎬ有分支状突起ꎬ细胞部分区域多层重叠生长ꎬ高低起伏ꎬ成 峰－谷 样(图１Ｂ)ꎮ反复传代３~５代均可保持良好的形态结构和功能ꎮ２.２㊀ＰＡＳＭＣｓ的α￣平滑肌肌动蛋白(α￣ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎꎬα￣ＳＭＡ)免疫荧光鉴定㊀荧光显微镜检测Ｄａｐｉ标记的所有细胞核呈椭圆形发蓝色荧光(图２Ｂ)ꎮ检测ＦＩＴＣ标记的平滑肌中α￣ＳＭＡꎬ仅平滑肌细胞呈阳性反应ꎬ发绿色荧光ꎬ在平滑肌细胞胞质中平行于细胞长轴呈细丝状表达(图２Ａ)ꎮ细胞平均纯度达９５％ꎮ２.３㊀常氧与低氧组ＰＡＳＭＣｓ形态差异㊀ＰＡＳＭＣｓ分别于常氧和低氧下培养ꎬ培养２ｄ后如图３所示ꎬ常氧下ＰＡＳＭＣｓ正常稳定生长ꎬ细胞形态呈梭形或多角形ꎬ细胞比较圆润(图３Ａ)ꎮ低氧下ＰＡＳＭＣｓ数量变少ꎬ细胞变细变长ꎬ细胞间隙增宽(图３Ｂ)ꎮ图１㊀ＰＡＳＭＣｓ在倒置显微镜下的形态学特征㊀ˑ１００㊀㊀Ａ:肺动脉组织爬块第７天ＰＡＳＭＣｓ形态ꎻＢ:传代第５天ＰＡＳＭＣｓ形态图２㊀ＰＡＳＭＣｓ的免疫荧光结果㊀ＩＦˑ２００Ａ:α￣ＳＭＡ细胞免疫荧光染色阳性ꎻＢ:α￣ＳＭＡ与Ｄａｐｉ染色后合并图图３㊀ＰＡＳＭＣｓ在常氧和低氧条件下细胞形态特征㊀ˑ１００㊀㊀Ａ:常氧组ＰＡＳＭＣｓ生长状态ꎻＢ:低氧组ＰＡＳＭＣｓ生长状态２.４㊀常氧与低氧组ＰＡＳＭＣｓ增殖能力差异㊀ＣＣＫ￣８法检测ＰＡＳＭＣｓ生长曲线ꎮ如图４所示:不论是否缺氧ＰＡＳＭＣｓ的ＯＤ值都会随着时间增加而逐渐增高ꎮ但常氧组整体ＯＤ值(１ ３５４０ʃ０ ２２１８ꎬｎ＝８)显著高于低氧组(０ ８１４３ʃ０ ０８６５２ꎬｎ＝８)ꎬ常氧组ＰＡＳＭＣｓ生长较低氧组快ꎬ增殖速度也明显６０３ 安徽医科大学学报㊀ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ㊀２０２０Ｆｅｂꎻ５５(２)强于低氧组(ｔ＝２ ２６８ꎬＰ<００５)ꎮ图４㊀ＰＡＳＭＣｓ在常氧与低氧条件下生长曲线图与低氧组比较:∗Ｐ<０ ０５３㊀讨论㊀㊀体外原代分离培养细胞可以排除众多因素干扰ꎬ也可以模拟在体实验结果ꎬ故而大量疾病模型的体外试验开始应用体外原代分离组织细胞ꎮ本课题组为研究ＰＡＨ的致病机制ꎬ改进组织贴壁法ꎬ成功分离并原代培养出ＰＡＳＭＣｓꎬ利用α￣ＳＭＡ鉴定第３代ＰＡＳＭＣｓ的纯度高达９０％以上ꎮ㊀㊀ＰＡＨ形成主要归因于ＰＡＳＭＣｓ的异常增殖等ꎮ目前所有在体实验均证实ꎬ低氧可促进ＰＡＳＭＣｓ异常增殖ꎬ诱发ＰＡＨꎮ但体外细胞培养结果却不一致[１]ꎮ研究[８－９]显示低氧会抑制新生小牛ＰＡＳＭＣｓ增殖ꎻ有研究者认为低氧不直接诱导体外培养的ＰＡＳＭＣｓ增殖ꎬ只有预先用佛波酯激活细胞的蛋白激酶Ｃꎬ低氧培养的ＰＡＳＭＣｓ数目才会明显增加[９－１１]ꎻ徐敦全等[１２]也认为雌激素会显著降低低氧下ＰＡＳＭＣｓ的增殖ꎮ本实验显示低氧培养不同时间点ꎬＰＡＳＭＣｓ的增殖情况有较大差异ꎬ相对于常氧培养ꎬ短期低氧并不会改变ＰＡＳＭＣｓ的生长状况ꎬ而长时间低氧培养对ＰＡＳＭＣｓ的增殖并没有促进作用ꎮ众所周知ꎬ应对同样的低氧环境ꎬ肺动脉对低氧的收缩反应会因血管内径大小的不同而有差异ꎬ有研究者发现低氧下内径２００~６００μｍ的猫肺动脉收缩反应最明显ꎬ而内径>８００μｍ的猫肺动脉平滑肌细胞肌球蛋白轻链对低氧的刺激不发生磷酸化ꎬ基本无收缩反应[１０－１１]ꎮ于天正等[８]发现内径为３００~４００μｍ的ＰＡＳＭＣｓ在低氧下增殖反应最明显ꎬ５００~８００μｍ的ＰＡＳＭＣｓ次之ꎬ而内径>１０００μｍ的ＰＡＳＭＣｓ基本无增殖ꎬ提示低氧对ＰＡＳＭＣｓ的促增殖作用会因内径的不同而不同ꎮ㊀㊀本文分离的原代ＰＡＳＭＣｓ来源于雌性大鼠肺血管ꎬ研究[１２－１４]显示ꎬ雌性大鼠的肺血管对低氧表现出较轻的收缩反应ꎬ细胞水平试验亦证实ꎬ取自雌激素水平较高的动物的原代ＰＡＳＭＣｓ低氧增殖反应较低ꎬ则是因为离体的肺动脉血管与原代细胞仍表达或分泌一定水平的雌激素[１２]ꎻ膜性受体介导内源性雌激素降低低氧性肺动脉血管的收缩作用ꎮ雌激素抑制低氧反应增殖的可能机制为:①内源性雌激素在大鼠ＰＡＨ发生过程中发挥拮抗性作用ꎬ通过非基因组作用途径(ＧＰＲ３０受体途径)降低肺动脉压力和基因组途径抑制肺血管重构和ＰＡＳＭＣｓ的增殖ꎬ发挥其拮抗ＰＡＨ的作用[１２]ꎻ②雌激素刺激血管生成ＮＯꎬ通过ＰＩ３Ｋ信号途径激活ｃＡＭＰꎬ从而抑制平滑肌细胞的增殖迁移[１３]ꎻ③雌激素通过调节ｍｉＲ￣ＮＡ￣２１来调控雌激素受体对肺血管的保护作用[１４]ꎮ故而雌激素可抑制低氧诱导的肺血管增殖ꎮ参考文献[１]㊀ＰｒｉｎｓＫＷꎬＤｕｖａｌＳꎬＭａｒｋｏｗｉｔｚＪꎬｅｔａｌ.ＣｈｒｏｎｉｃｕｓｅｏｆＰＡＨ￣ｓｐｅ￣ｃｉｆｉｃｔｈｅｒａｐｙｉｎｗｏｒｌｄｈｅａｌｔｈｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｇｒｏｕｐＩＩＩｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙ￣ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ:ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ￣ａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＰｕｌｍＣｉｒｃꎬ２０１７ꎬ７(１):１４５－５５.[２]㊀ＪｉａｎｇＤＭꎬＨａｎＪꎬＺｈｕＪＨꎬｅｔａｌ.Ｐａｒａｃｒｉｎｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｏｎｅｍａｒ￣ｒｏｗ￣ｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ:ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ￣２/ｐｒｏｓｔａ￣ｃｙｃｌｉｎｐａｔｈｗａｙｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１３ꎬ８(１１):ｅ７９２１５.[３]㊀ＨｏｅｐｅｒＭＭꎬＢｏｇａａｒｄＨＪꎬＣｏｎｄｌｉｆｆｅＲꎬｅｔａｌ.Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓａｎｄｄｉ￣ａｇｎｏｓｉｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ[Ｊ].ＪＡｍＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌꎬ２０１３ꎬ６２(２５Ｓｕｐｐｌ):Ｄ４２－５０.[４]㊀ＳｏｍｍｅｒＮꎬＲｉｃｈｔｅｒＭＪꎬＴｅｌｌｏＫꎬｅｔａｌ.Ｕｐｄａｔｅｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉ￣ａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ:Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓꎬｄｉａｇｎｏｓｉｓꎬｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔ(Ｂｅｒｌ)ꎬ２０１７ꎬ５８(９):９３７－５７.[５]㊀ＳｉｍｏｎｎｅａｕＧꎬＭｏｎｔａｎｉＤꎬＣｅｌｅｒｍａｊｅｒＤＳꎬｅｔａｌ.Ｈａｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓａｎｄｕｐｄａｔｅｄｃｌｉｎｉｃａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｙｐｅｒ￣ｔｅｎｓｉｏｎ[Ｊ].ＥｕｒＲｅｓｐｉｒＪꎬ２０１９ꎬ５３(１):１８０１９１３[６]㊀ＣｒｏｓｓｗｈｉｔｅＰꎬＳｕｎＺ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ[Ｊ].ＭｏｌＭｅｄꎬ２０１４ꎬ２０:１９１－２０１. [７]㊀王㊀静ꎬ戴爱国.原代大鼠肺动脉平滑肌细胞的提取和鉴定以及缺氧对其增殖的影响[Ｊ].中国呼吸与危重监护杂志ꎬ２０１２ꎬ１１(２):１４７－５２.[８]㊀于天正ꎬ马传桃.低氧对培养的不同内径的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响[Ｊ].中国应用生理学杂志ꎬ２００１ꎬ１７(１):５８－６０.[９]㊀ＡｈｍｅｄＭꎬＭｉｌｌｅｒＥ.Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ(ＭＩＦ)ｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ[Ｊ].ＧｌｏｂＣａｒｄｉｏｌＳｃｉＰｒａｃｔꎬ２０１８ꎬ２０１８(２):１４. [１０]ＤｅｍｐｓｅｙＥＣꎬＳｔｅｎｍａｒｋＫＲꎬＭｃＭｕｒｔｒｙＩＦꎬｅｔａｌ.Ｉｎｓｕｌｉｎ￣ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＩａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｓｅｐａｒａｔｅｂｕｔｓｙｎｅｒ￣㊀㊀㊀㊀㊀(下转第３１１页)ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＣａｓｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｐｏｒｔｅｄｃａｓｅｓｏｆＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ(Ａｂ)ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎ￣ｔｏＭＤＲ￣Ａｂａｎｄｎｏｎ￣ＭＤＲ￣Ａｂｇｒｏｕｐｓｂａｓｅｄｏｎｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.ＵｎｉｖａｒｉａｔｅａｎｄＬｏｇｉｓｔｉｃｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｏｆｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＭＤＲ￣Ａｂｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.ＵｎｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅꎬＩＣＵｓｔａｙꎬｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ(ＣＳＦ)ｌｅａｋａｇｅꎬＣＳＦｄｒａｉｎａｇｅｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎꎬａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｅｂｅｆｏｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎＡｂａｎｄｈｏｒｍｏｎｅｕｓｅａｆｔｅｒｓｕｒｇｅｒｙｗｅｒｅａｌｌｒｅｌａｔｅｄｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｏｆＭＤＲ￣Ａｂｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ(Ｐ<０ ０５).ＬｏｇｉｓｔｉｃｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅꎬＩＣＵｓｔａｙꎬｉｎｐａｔｅｎｃｙｏｆＣＳＦｄｒａｉｎａｇｅａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｅｂｅｆｏｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＡｂｗｅｒｅａｌｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｉｓｋｆａｃｔｏｒｓｆｏｒＭＤＲ￣Ａｂｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ(Ｐ<０ ０５).ＦｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｏｎｇｈｏｓｐｉｔａｌｓｔａｙꎬＩＣＵｓｔａｙꎬｕｎｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄＣＳＦｄｒａｉｎａｇｅꎬａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｅｂｅｆｏｒｅＡｂｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎬｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｅａｓｙｔｏｏｃｃｕｒ.ＴｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬｔｈｅｈｏｓｐｉｔａｌｓｔａｙｓｈｏｕｌｄｂｅｓｈｏｒｔｅｎｅｄａｓｆａｒａｓｐｏｓｓｉｂｌｅａｎｄｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｓｈｏｕｌｄｂｅｍｏｖｅｄｏｕｔｏｆＩＣＵｉｎｔｉｍｅ.Ｔｈｅｄｒａｉｎａｇｅｃｈａｎｎｅｌｓｈｏｕｌｄｂｅｍａｉｎｔａｉｎｅｄｕｎｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｓｈｏｕｌｄｂｅｒｅａｓｏｎａｂｌｙａｐｐｌｉｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉꎻｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎꎻｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎻｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ(上接第３０７页)ｇｉｓｔｉｃｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９９０ꎬ１４４(１):１５９－６５. [１１]ＭａｄｄｅｎＪＡꎬＶａｄｕｌａＭＳꎬＫｕｒｕｐＶＰ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｙｐｏｘｉａａｎｄｏｔｈ￣ｅｒｖａｓｏａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓｏｎｐｕｌｍｏｎａｒｙａｎｄｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓ￣ｃｌｅｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９９２ꎬ２６３(３Ｐｔ１):Ｌ３８４－９３. [１２]徐敦全.雌激素减轻大鼠低氧性肺动脉高压的作用及机制研究[Ｄ].西安:第四军医大学ꎬ２０１４.[１３]刘㊀莉ꎬ叶㊀鹏.性别差异对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的影响[Ｊ].中华高血压杂志ꎬ２０１３ꎬ２１(７):６３７.[１４]沈丽晓ꎬ袁博云ꎬ王㊀丽ꎬ等.１７β￣雌二醇/微小核糖核酸￣２１信号通路抑制低氧性肺动脉高压肺血管重构的机制研究[Ｊ].中国循环杂志ꎬ２０１８ꎬ３３(１１):１１１８－２３.ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｒａｔＰＡＳＭＣｓａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｙｐｏｘｉａｏｎｔｈｅｉｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＺｈａｎｇＦｅｎｇｙｕ１ꎬ２ꎬＹａｏＤｅｓｈａｎ１ꎬＬｉＲｕｊｕｎ１ꎬｅｔａｌ(１ＤｅｐｔｏｆＣｅｎｔｒａｌＬａｂꎬＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｇｚｈｏｕ㊀２２５００１ꎻ２ＤｅｐｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＨｕａｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌꎬＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ㊀２０００４０)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｔｉｓｓｕｅａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｒａｔｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓ￣ｃｌｅｃｅｌｌｓ(ＰＡＳＭＣｓ)ꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｙｐｏｘｉａｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＡＳＭＣｓｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄ.ＴｈｅｌｕｎｇｓｏｆＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｃｈｅｓｔｕｎｄｅｒａｓｅｐｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎ.Ｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｔｉｓｓｕｅｗａｓｐｌａｎｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆｔｉｓｓｕｅｅｘｐｌａｎｔｓ.Ｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｉｎｖｅｒｔｅｄｐｈａｓｅｃｏｎ￣ｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｕｓｉｎｇα￣ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ(α￣ＳＭＡ).ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅｄＰＡＳＭＣｓｗｅｒｅｅｘｐｏｓｅｄｔｏｎｏｒｍｏｘｉｃａｎｄｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｔｈｅｎＣＣＫ￣８ａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＡＳＭＣｓ.ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｒａｔＰＡＳＭＣｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌ￣ｔｕｒｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙꎬｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐａｓｓａｇｅｗｅｒｅｓｔａｂｌｅ.Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆα￣ＳＭＡｗａｓｂｅｙｏｎｄ９０％.Ｔｈｅｃｅｌｌｓｇｒｅｗｓｔａｂｌｙꎬｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｐｅｒｆｏｒｍｉｎｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ.Ｉｍｍｕ￣ｎｏｌｏｇｙｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆα￣ＳＭＡｗａｓｂｅｙｏｎｄ９０％.ＣＣＫ￣８ａｓｓａｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆ￣ｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＡＳＭＣｓｅｘｐｏｓｅｔｏｈｙｐｏｘｉａｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍｏｘｉａ.ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｍｏｄｅｌｏｆｒａｔＰＡＳＭＣｓｗａｓｂｕｉｌｔｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｖｉｔｒｏ.ＰＡＳＭＣｓｗｉｔｈａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｉｎｎｅｒｄｉａｍｅｔｅｒａｎｄｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｍａｌｅｒａｔｓｗｉｌｌｂｅｓｅ￣ｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｓｔｕｄｙｏｂｊｅｃｔｉｎｖｉｔｒｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ｒａｔｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｉａｌｓｍｏｏｔｈｃｅｌｌｓꎻα￣ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎꎻｈｙｐｏｘｉａꎻｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎻｉｎｎｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ。

改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞 [ 10-02-04 15:33:00 ] 编辑：studa20 作者：李成武，李应续，朱从丽，宋健

【摘要】 目的 探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）的方法，为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。 方法 提取大鼠的胸主动脉，采用混合酶消化后，采用含10%FCS RPMI1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖，倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状，免疫组织化学进行细胞鉴定。结果 消化肌平滑肌细胞24h后贴壁，平均贴壁率为76%，第5 d后细胞数迅速增加，至第11 d形成单层时，光镜下出现“峰谷”样生长；传代后，细胞的生长特性无改变，αSMA免疫组化染色检测，证实细胞是VSMC。结论 改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。

【关键词】 酶消化法;平滑肌细胞;胸主动脉;SD大鼠 ABSTRACT:Objective To explore the cultivation of rat vascular smooth muscle cells (VSMC) by enzymatic dispersion which helps to provide ideals for the prevention and treatment of angiosclerotic diseases. Methods The thoracic artery was immediately removed and cut into fine tissue pieces, then was incubated in a mixed medium.After digestion,the cells were cultured in RPMI1640 with 20% FCS and then plated onto plastic tissue culture dishes.The proliferation of cell was assayed by cell counting,the feature of vascular smooth muscle cells was observed with inverted phase contrast microscope,and immunohistochemical method was used to indentify cells.Results After 24h of incubation,VSMCs began to stick to the wall of the incubation dishes,and the adherent rate was 76% .After 5th day,the cell number was increased rapidly,and they form monolayer on 11th day.A "the peak valley" type of growth could be observed by light microscope.After passages, the growth characteristics of cells did not changed,and the confirmation cell was VSMC by αSMA immunohistochemical testing.Conclusion The improved enzymatic dispersion method for VSMC can increase the cell stability of biological characteristics with shorttime.

改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞李成武;李应续;朱从丽;宋健【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2008(022)005【摘要】目的探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)的方法,为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助.方法提取大鼠的胸主动脉,采用混合酶消化后,采用含10%FCS RPMI1640培养基培养.通过细胞计数观察细胞增殖,倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状,免疫组织化学进行细胞鉴定.结果消化肌平滑肌细胞24h后贴壁,平均贴壁率为76%,第5 d后细胞数迅速增加,至第11 d形成单层时,光镜下出现"峰-谷"样生长;传代后,细胞的生长特性无改变,α-SMA免疫组化染色检测,证实细胞是VSMC.结论改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC.【总页数】4页(P369-372)【作者】李成武;李应续;朱从丽;宋健【作者单位】武汉大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系,湖北,武汉,430071;咸宁学院基础医学院人体解剖学教研室;咸宁学院基础医学院人体解剖学教研室;武汉大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系,湖北,武汉,430071;武汉大学基础医学院医学研究中心;武汉大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系,湖北,武汉,430071;武汉大学基础医学院医学研究中心【正文语种】中文【中图分类】R329-33【相关文献】1.改良植块贴壁法建立大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型 [J], 林京;张子力2.改良组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定 [J], 王倩;舒茂琴;江明宏;李建涛;康振峻3.改良的两步复合酶消化法制备大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 [J], 周玥华;刘星;张艳军;汪辛;陈渝萍4.胰酶消化法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞 [J], 毛昱嘉;王文杰5.酶消化法分离培养大鼠血管平滑肌细胞方法的改良 [J], 李宪伟;姜维良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2018.05.008作者单位:050000石家庄,河北医科大学第三医院呼吸二科(张鑫红㊁田凤军㊁陈海利㊁徐迎春),重症医学科(王智勇);050000石家庄,河北医科大学病理生理教研室(黄新莉)通信作者:田凤军,E m a i l :185********@163.c o m改良大鼠肺微血管内皮细胞原代培养技术及鉴定张鑫红 田凤军 陈海利 徐迎春 王智勇 黄新莉ʌ摘要ɔ 目的 改良大鼠肺微血管内皮细胞(P MV E C s)原代培养方法,并对所培养的P MV E C s 进行鉴定㊂方法 组织贴块法培养P MV E C s ,从动物的选取㊁肺灌注㊁细胞漂洗次数及试剂温度等方面进行了改良㊂免疫组织化学鉴定P MV E C s ㊂结果 原代培养的P MV E C s 呈典型的铺路石样生长㊂免疫组织化学显示Ⅷ因子及血管性血友病因子表达阳性㊂结论 经改良后培养P MV E C s ,细胞培养的重复性高且生长状态好㊂ʌ关键词ɔ 肺微血管内皮细胞;原代培养;细胞培养I m p r o v e m e n t o fm e t h o d p r i m a r y c u l t u r e a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r a t p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s Z h a n g X i n h o n g *,T i a nF e n g j u n ,C h e n H a i l i ,X uY i n g c h u n ,W a n g Z h i y o n g ,H u a n g Xi n l i .*T h e S e c o n d D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,S h i j i a z h u a n g 050000,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r :T i a nF e n g ju n ,E m a i l :185********@163.c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o i m p r o v e t h e m e t h o d of p r i m a r y c u l t i v a t i o n o f r a t p u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s (P MV E C s ),a n di d e n t i f y t h e p r i m a r y cu l t i v a t e d P MV E C s .M e t h o d s T i s s u eb l o c ka d h e r i n g w a l l m e t h o d w a su s e dt oc u l t i v a t e P MV E C s .P r i m a r y cu l t i v a t i o n m e t h o d w a s i m p r o v e d f r o mt h e p r o c e d u r e so fa n i m a l s e l e c t i o n ,p u l m o n a r yp e r f u s i o n ,t h en u m b e ro fc e l l sr i n s e sa n d t e m p e r a t u r e o f r e a g e n t sa n ds oo n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a l o b s e r b a t i o nP MV E C s .R e s u l t s T h eP MV E C s w e r ee x h i b i t e d a s p o l y g o n .I mm u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g r e v e a l e d t h a t e x pr e s s i o n o f Ⅷa n d v o n w i l l e b r a n d f a c t o rw a s p o s i t i v e .C o n c l u s i o n s A f t e r t h e i m p r o v e d m e t h o do fP MV E C s ,t h e r e p r o d u c i b i l i t yo f c e l l c u l t u r e i sh i gha n d t h e g r o w t hs t a t u s i s g o o d .ʌK e y wo r d s ɔ P u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ;P r i m a r y c u l t u r e ;C e l l s c u l t u r e 肺微血管内皮细胞(p u l m o n a r y mi c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s ,P MV E C s )在A R D S 等多种肺部疾病中是最早激活的效应细胞[1]㊂因此,体外培养P MV E C s 构建实验模型,对深入研究肺部不同疾病的发病机制具有重要意义㊂虽然国内外已有许多研究报道P MV E C s 原代培养和鉴定方法[2-3],但P MV E C s 的原代培养成功率仍然低,重复性差㊂本研究尝试对P MV E C s 培养过程中技术细节部分的改良,探索简单易行的实验方法,改善P MV E C s 原代培养的重复性及细胞的稳定性㊂1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 S D 幼年大鼠,雌雄均可,体质量40~50g ,购自河北医科大学动物实验中心㊂实验过程中对动物的处理符合‘关于善待实验动物的指导意见“等相关要求㊂1.1.2 主要试剂 D M E M /F -12培养液㊁双抗液㊁牛血清白蛋白㊁P B S 缓冲液及2.5g /L 胰蛋白酶-E D T A 均购自美国G i b c o 公司,胎牛血清购自P A N 公司,4%多聚甲醛及聚乙二醇辛基苯基醚(T r i t o n X -100)购自索莱宝公司,兔抗大鼠Ⅷ因子相关多克隆抗体及兔抗大鼠血管性血友病因子(v o nw i l l e b r a n d f a c t o r,VW F )相关多克隆抗体购自武汉博士德公司,免疫组织化学二抗试剂盒购自北京中杉金桥公司,底面积25c m 2细胞培养瓶㊁35mm 细胞培养皿购自美国C o r n i n g 公司㊂1.1.3 主要设备 倒置荧光显微镜㊁含体积分数5%C O2细胞培养箱㊁超净台㊁低温离心机均购自美国T h e r m o公司㊂1.2细胞培养1.2.1原代培养大鼠2只,肝素钠㊁水合氯醛腹腔注射给药㊂麻醉成功后大鼠消毒3次,固定于超净台内㊂暴露心㊁肺,灌洗肺叶至发白㊂剪取肺组织,置于4ħP B S中漂洗㊂4ħ培养基中剪取边缘肺组织,约为(1mmˑ1mmˑ1mm)大小㊂将组织块均匀接种到细胞培养瓶中,吸去瓶中的全部培养基,并置于细胞培养箱中㊂组织块贴壁后,加37ħ完全培养基继续培养㊂约48h后组织块开始迁出P MV E C s,60h左右将组织块取出㊂之后隔天换液1次㊂1.2.2传代培养培养7~10d后,待细胞约为瓶底80%~90%,即可进行传代㊂弃去原培养液,漂洗后消化,待细胞收缩变圆㊁脱落,终止消化并离心㊂将离心后的细胞悬液,按1ʒ1比例传代㊂根据生长情况每1~2d换液1次㊂1.3细胞鉴定1.3.1细胞形态学观察显微镜下观察原代及传代细胞形态㊂1.3.2 Ⅷ因子鉴定取传代细胞,至六孔板内的盖玻片上㊂待细胞爬满玻片后,漂洗后加入4%多聚甲醛固定,0.3%T r i t o n X-100室温破膜,牛血清白蛋白温箱封闭㊂Ⅷ因子4ħ过夜后,加荧光二抗温箱避光孵育,漂洗后观察并记录㊂P B S替代一抗作为阴性对照㊂1.3.3 VW F鉴定按上述方法固定细胞后,依据免疫组织化学二抗试剂盒步骤鉴定VW F㊂P B S 替代一抗作为阴性对照㊂2结果2.1形态学结果显微镜下观察,原代细胞以铺路石样排列生长㊂而传代细胞呈长梭状㊂见图1㊁2㊂2.2 Ⅷ因子鉴定结果免疫荧光显示,细胞胞浆呈现绿色荧光,Ⅷ相关抗原表达阳性㊂见图3㊂2.3VW F鉴定结果免疫组织化学显示, P MV E C s内呈棕褐色,VW F相关抗原表达阳性㊂见图4㊂3讨论研究表明[4-5],肺脏组织大血管与微血管的内皮细胞之间存在着结构与功能的差异㊂在血管生成㊁血管通透性及其他相关研究中,P MV E C s更适合建立研究模型㊂这是因为P MV E C s较大血管有更强的适应环境的特性㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图1组织块植入48h后P MV E C s开始从组织块中迁出ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图2原代培养P MV E C s至72h,细胞约为瓶底80%~ 90% ˑ20目前用于原代培养P MV E C s方法主要有组织贴块法㊁免疫磁珠分离法㊁酶消化法等[6-9]㊂后两种方法步骤复杂,对技术及实验环境要求高,存在消化酶浓度把握不准的困难㊂而组织贴块法方法简单,易于操作,原代细胞培养成功率高㊂为提高组织贴块法原代培养P MV E C s的成功率,本实验尝试从以下几个方面进行了改良:①合适的动物选取是原代培养成功的第1步㊂在前期动物选取时,部分学者选择体质量150~250g的成年大鼠[2,10-11]㊂而在本研究的预实验中发现,成年大鼠的肺组织P MV E C s爬出困难,后期细胞生长缓慢㊂经过多次重复选择,最终选用体质量40~50g的幼年大鼠,其新陈代谢快,后期细胞状态好,传代能力强㊂②在灌洗肺循环环节,有的研究为了减少操作时间,摒弃此环节[6]㊂但在刘勇军等[2]的研究中得出,未灌洗的肺组织中存留大量红细胞及红细胞裂解物,影响迁出的P MV E C s的生长活力㊂因此,灌洗肺组织仍是必要的㊂与此同时,我们还发现,选择合适的灌注速度,尽量避免损伤肺微血管,对提高细胞培养的成功率有着至关重要的作用㊂本研究采用1m l注射器针头配10m l 针管从右心室进针缓慢灌洗肺组织至发白,不但可以控制灌注速度,又可清除大量红细胞,降低了裂解物对P MV E C s的毒性作用㊂③如何保证肺组织的活性是实验成功与否的关键㊂在本实验开始阶段,取材时选用未预冷的P B S及完全培养基, P MV E C s迁出率低㊂而将P B S及完全培养基改良为4ħ预冷,后期P MV E C s迁出率增高,生长状态好㊂④组织块是否贴壁是P MV E C s迁出的关键㊂根据以往的研究[12],组织块置于培养瓶后,仍有少量的培养基㊂然而我们经过多次尝试发现,即使少量的培养基,仍可引起组织块漂浮以至于无法贴壁㊂故采用无菌吸管吸去培养瓶中的全部培养基,湿润的瓶底可助于组织块牢固的贴壁,大大提高了P MV E C s迁出率㊂⑤以往的研究发现,即使增大灌注量也无法将肺组织中的红细胞完全清除[2]㊂因此,肺组织块植入后,应隔天换液至组织块取出㊂在本研究中,前期更换细胞培养基时,采用未经预热的P B S及完全培养基,结果发现大片细胞损伤甚至凋亡㊂对于更换培养基引起的凋亡,可能与温度骤然下降有关㊂故我们改良此步骤为,P B S及完全培养基经37ħ预热后再更换细胞培养基㊂而后发现P MV E C s的损伤减轻,改善了细胞生长状态㊂⑥理论上,每次换液时应将血细胞及其裂解产物漂洗干净㊂但在本实验的预实验阶段发现,过度漂洗并不能将裂解产物全部漂洗干净,还可能使组织块漂浮㊂在二者中经过多次权衡,最终采用每次换液前P B S漂洗2次,既可清除大部分裂解产物又可避免组织块漂浮㊂⑦在细胞传代阶段,以往研究多采用0.25%胰蛋白酶[12]㊂然而,0.25%胰酶消化后细胞不易脱落,需反复吹打下来,机械损伤严重㊂而我们将0.25%胰酶提前37ħ预热,胰酶的活性增高,传代后只需轻轻敲打瓶底数下即可,细胞损伤较机械损伤轻㊂⑧在本研究中,细胞固定前P B S漂洗需经37ħ预热,否则后期鉴定细胞时,易出现细胞脱落的现象,影响后期鉴定结果㊂经上述原代培养技术细节的改进,培养成功率大幅提高,且操作可重复性好㊂注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞图3 P MV E C s中Ⅷ因子的表达结果免疫荧光 ˑ2注:P MV E C s为肺微血管内皮细胞;VW F为血管性血友病因子图4 P MV E C s中VW F的表达结果免疫组织化学ˑ10本研究显示,原代P MV E C s大多数以团簇状生长,呈典型的铺路石样㊂传代P MV E C s细胞形态与原代细胞形态略不同,呈长梭状,这与贾建桃等[6]的研究是一致的㊂总之,本研究采用了组织贴块法的方法培养P MV E C s,重点是对动物的选取㊁肺灌注的速度㊁漂洗次数及试剂温度等方面的优化㊂改良后的细胞培养重复性高且生长状态好,可在以后的相关研究工作中推广应用㊂参考文献[1]S a k a oS,T a r a s e v i c i e n e-S t e w a r t L,W o o dK,e t a l.A p o p t o s i s o fp u l m o n a r y m i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a 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n.2095-140X.2013.01.003.(收稿日期:2017-11-07﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏﹏)㊃简讯㊃‘肺脏介入医学“已出版由科学出版社最新出版的中文版‘肺脏介入医学“,是由北京协和医院组织相关专家翻译㊂该书系统的介绍了介入技术在治疗肺部良性与恶性疾病方面的最新内容和方法㊂三位主编:J o h nF.B e a m i s,J rP r a v e e nN.M a t h u rA t u l C.M e h t a均是肺脏介入医学领域的专家;美国支气管病学会的创始人㊂作为当今介入领域知名专家的智慧结晶,这一综合性专著为呼吸科医生及其他专科医师提供了全面的有关介入技术在诊断和治疗领域的应用技术包括硬质支气管术㊁激光治疗㊁冷冻治疗㊁电手术治疗㊁荧光支气管镜术㊁内科胸腔镜以及经支气管壁和经胸壁针吸术等㊂对于异物取出㊁肺胸膜病变以及早期肺癌等处理过程中的困境及具体情况,本书详细阐述了其操作流程㊂该书是呼吸科医生的必备参考书之一㊂定价149.00元㊂邮购电话:010-********传真:010-********地址:100717北京市东黄城根北街16号科学出版社温晓萍(请在汇款附言注明您购书的书名㊁册数㊁联系电话㊁是否要发票等)。