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辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探作者：吴辉等来源：《湖北农业科学》2015年第07期摘要：采用平板稀释法和平板对峙试验，从武汉、荆州、宜昌和荆门等地的辣椒根际土壤中分离到185株细菌，筛选到1株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生防菌Bs04。
通过形态学观察、生理生化指标测定、16S rDNA序列测定及进化树构建，确定菌株Bs04为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
Bs04对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达80%，同时对烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotiana）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sb. vesinfectum）和黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）具有明显的抑制作用。
利用光学显微镜观察Bs04对辣椒疫霉菌丝形态的影响，发现菌丝分支增多、顶端畸形、原生质浓缩及生长缓慢等现象，表明Bs04具有显著的抑菌作用。
关键词：辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）；生防菌；鉴定；抑菌机理中图分类号：S436 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1596-04辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起，是重要的辣椒根茎病害之一，在中国及世界其他国家辣椒生产区发生严重，给辣椒生产造成巨大的经济损失。
对于辣椒疫病的防治大多采用化学防治，而大量使用化学药剂导致了环境的严重污染，对消费者的身体健康产生了不利影响。
目前，由于辣椒抗疫病品种较少，且多为中抗或不耐病品种，难以有效地控制辣椒疫病。
因此，寻找安全有效的防治措施成为控制辣椒疫病的一个亟待解决的问题。
植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法，具有无毒、无害、无污染和高效等优点，受到了研究者的青睐。
湖南农业大学学报(自然科学版) 2023，49(2)：201–205．DOI ：10.13331/ki.jhau.2023.02.012 Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)引用格式：高香辉，朱丽娜，谭泽宝，郑井元，严蓓，刘敏，罗坤．辣椒疫霉菌拮抗细菌的分离鉴定及防效试验[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(2)：201–205． GAO X H ，ZHU L N ，TAN Z B ，ZHENG J Y ，YAN B ，LIU M ，LUO K ．Isolation and identification of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici and its antagonistic efficacy[J]．Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)，2023，49(2)：201–205． 投稿网址：辣椒疫霉菌拮抗细菌的分离鉴定及防效试验高香辉1，朱丽娜3，谭泽宝1，郑井元2，严蓓1，刘敏1，罗坤1*(1.湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农业科学院蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；3.金华市婺城区经济特产站，浙江 金华 321000)摘 要：在辣椒疫病为害较严重田块采集健康植株，从其根际土壤中分离筛选出具有抗疫霉菌活性的细菌菌株Pa608。
通过菌落形态特征以及分子水平同源性鉴定，测定其生理生化指标和胞外产酶特性，确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )；采用平板对峙法测试其抗菌谱，盆栽试验确定防效后应用于温室辣椒田测试温室防效，发现该菌株对灰霉菌、稻梨孢菌、疫霉菌、炭疽杆菌具有较好的拮抗作用，当菌液浓度为1.0×109 cfu/mL 、盆施3 mL 对辣椒疫病的盆栽防效达88.00 %；菌液稀释10倍、株施50 mL 的温室防效达74.96%。
菌株HMQ20YJ的筛选鉴定及对辣椒疫病的抑制评价
步骤一：菌株的获取与保存
1.从辣椒根际土壤样品中分离出潜在的抑制辣椒疫病的菌株。
2.将菌株HMQ20YJ11保存在琼脂斜板中，并保存在4°C冰箱中。
步骤二：菌株的筛选与鉴定
1.构建筛选试验组与对照组，将菌株HMQ20YJ11接种于筛选试验组土壤中，对照组不接种。
2.在辣椒种子发芽前，接种菌株HMQ20YJ11
3.在生长期间观察辣椒苗的生长情况，比较筛选试验组与对照组的差异。
4.通过形态学、生理生化等方法对菌株HMQ20YJ11进行进一步鉴定。
步骤三：疫病的抑制效果评价
1.将菌株HMQ20YJ11接种于辣椒疫病的感染菌株上，观察其对辣椒疫病菌的抑制效果。
2.接种HMQ20YJ11的辣椒株，观察其对辣椒疫病的抑制效果。
3.比较接种HMQ20YJ11的辣椒株与未接种菌株的辣椒株，在抑病率、病情指数等方面的差异。
步骤四：抑病机制的探究
1.培养菌株HMQ20YJ11，提取其代谢产物。
2.通过物理、化学等方法对代谢产物进行分析。
3.通过炭源、氮源等对比试验，探究菌株HMQ20YJ11对辣椒疫病的抑制机理。
步骤五：应用前景探讨
1.评价菌株HMQ20YJ11对辣椒疫病的抑制效果，并与现有的农药进行比较。
2.分析菌株HMQ20YJ11抑制疫病的优势与不足。
3.探讨将菌株HMQ20YJ11应用于农业生产中的可行性和发展前景。
综上所述，通过菌株HMQ20YJ11的筛选与鉴定，以及对辣椒疫病的抑制评价，可以为寻找一种更加环保、有效的防治辣椒疫病的方法提供理论与实践基础。
辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选赵影;刘永亮;高克祥;郭君兴;丛国强;何邦令【摘要】Two endophytic bacteria strains named as LJ and XM with strong antagonism against Phytoph-thora capsici were isolated from eleven different healthy plants. Both strain LJ and XM could suppress many plant pathogenic fungi. The fermentation filtrate of LJ and XM showed strong antagonistic activities to the zoo-sporangium formation and zoospore germination of Phytophthora capsici. The hypha of Phytophthora capsici treated with fermentation filtrate of LJ and XM showed different degrees of protoplast concentration.%从健康的11种植物体内分离到对辣椒疫霉Phytophthora capsici有强拮抗作用的两个内生细菌菌株,分别命名为LJ、XM菌株.拮抗试验表明,这两株细菌对多种植物病原真菌有较强的抑制作用.LJ和XM发酵滤液对辣椒疫霉病菌游动孢子囊的形成、孢子萌发均有较强的抑制活性.经LJ、XM发酵液处理的辣椒疫霉菌丝均有不同程度的原生质体浓缩现象.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2012(044)009【总页数】3页(P90-92)【关键词】拮抗细菌;辣椒疫霉病菌;筛选【作者】赵影;刘永亮;高克祥;郭君兴;丛国强;何邦令【作者单位】山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018;山东农业大学植物保护学院,山东泰安271018【正文语种】中文【中图分类】S476+.1辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染引起的一种毁灭性土传病害，不仅能够引起叶片枯萎、茎秆坏死和果实腐烂等局部症状，还能造成整株萎蔫死亡，在高温高湿的保护地栽培条件下发病尤为严重［1］。
一株辣椒内生拮抗细菌的筛选及初步鉴定蔡长平;黄军;曾艳;毕世宇;黄彬彬;郭照辉;刘清术【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2018(000)007【摘要】从多年连作重茬的辣椒地采集健康植株,表面消毒后从根系中分离到1株内生拮抗细菌PEB-99,该菌株抗菌谱较广,对辣椒青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀枯萎病菌都有显著抑制效果,无菌发酵液亦具有抑制细菌和真菌的活性,通过16S rDNA测序对该菌株进行了鉴定,初步认为PEB-99菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),该菌能产生铁载体、吲哚-3-乙酸(IAA),还具有溶解有机磷的能力,显示了很好的抗病促生长潜力.【总页数】4页(P1-4)【作者】蔡长平;黄军;曾艳;毕世宇;黄彬彬;郭照辉;刘清术【作者单位】湖南省微生物研究院,湖南长沙 410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙 410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙 410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙 410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙410009;湖南省微生物研究院,湖南长沙 410009【正文语种】中文【中图分类】S476【相关文献】1.一株辣椒青枯病菌拮抗内生细菌的筛选鉴定与发酵条件优化 [J], 王玲;刘二明;周鑫钰;任佐华;陈娟芳2.辣椒内生菌拮抗细菌的筛选 [J], 黎起秦;卢继英;林纬;陈永宁;卢亭君;谢义灵;韦文亮3.辣椒根腐病内生拮抗细菌筛选及菌株Hj33-7的鉴定和抗菌活性 [J], 祁之秋;李兴海;王英姿;谷祖敏;纪明山4.烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定 [J], 彭细桥;刘红艳;罗宽;邓正平5.一株辣椒内生拮抗放线菌的筛选及初步鉴定 [J], 黄军;曾艳;蔡长平;毕世宇;黄彬彬;郭照辉;刘清术因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
收稿日期：2020-08-07；修回日期：2020-09-25基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0201100）；国家大宗蔬菜产业技术体系建设专项（CARS-23-B03）作者简介：潘培培，女，在读硕士研究生，主要从事植物病害生物防治研究。
E-mail ：*****************通信作者：申顺善，女，教授，主要从事植物病害生物防治研究。
E-mail ：****************辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsi-ci ）引起的一种具有毁灭性的土传病害，在辣椒整个生育期均会发生。
此病害发病速度快，传播范围广，给辣椒生产造成非常严重的损失[1]。
近年来，不合理的轮作制度、水肥过度使用及品种抗病性差等因素，造成土壤中病原菌逐年积累，进而导致辣椒疫病的发生与流行。
虽然目前已有多种防治方法，但是都存在着各种局限和不足。
首先是现有的抗病品种单一，大多数抗病基因只能在一定的种、属之间表达，而几乎所有抗病品种都只对某一种或者少数几种致病微生物有抵抗能力；其次是土壤消毒的方法虽然简单、有效，但大多数只能局限于设施农业，在大田农业中很难实现，并且用化学药剂还会使病原菌产生抗药性，并对环境造成污染[2]。
植物根际细菌是指生长在植物根圈儿范围内所有细菌的统称，其中很多细菌能促进植物生长，防治植物病害，改善植物微生态环境，被称为植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria ，PG-PR ）。
植物根际促生细菌因其促生、防病、改善土壤微生态及对环境友好等特点，弥补了植物病害传统防治方法的缺陷与不足，在农业生产上具有十分广阔的应用前景[3]。
目前，利用植物根际促生细菌防治辣椒疫病的研究比较活跃。
如从小麦根际分离的菌株绿针假单胞菌HG28-5，不仅对辣椒疫病具有显著的防治作用，还能够促进辣椒生长[4]；枯草芽孢杆菌IBFCBF-4对辣椒疫病的防效高达64.28%，辣椒疫霉菌拮抗细菌L14-3的生防潜力及其鉴定潘培培1，刘东平1，谢太震1，张忠良1，杜南山2，朴凤植2，申顺善1（1.新型农药创制与应用河南省重点实验室·河南农业大学植物保护学院郑州450002；2.河南农业大学园艺学院郑州450002）摘要：为探讨L14-3菌株对辣椒疫病的生防潜力，采用皿内对峙试验和孢子萌发试验，测定其对辣椒疫霉菌的抑制活性，通过盆栽试验验证其对辣椒疫病的防治效果，并根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA 序列同源性分析对其进行鉴定。
46卷 4期2006年8月4日微生物学报Acta Microbio logica Sinica 46(4):516~5214August 2006基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目(3_3_1)*通讯作者。
Tel:86_21_34204854;Fax:86_21_34204051;E_mail:xuehzhang@sj 作者简介:何延静(1982-),女,河南南阳人,硕士研究生,主要从事微生物系统分类学研究。
E_mail:yanjinghe106@ 其他作者:蒋海霞收稿日期:2005_10_08;接受日期:2006_02_07;修回日期:2005_12_21一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定何延静,刘海明,胡洪波,许煜泉,张雪洪*(上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢教育部重点实验室 上海 200240)摘 要:从甜椒根际土壤中分离到一株对辣椒疫霉(Phytop hthora capsici )具有强拮抗作用的假单胞属(Pseudomonas spp.)菌株GP72,研究其拮抗性表明,对多种植物病原真菌均有很强的抑制作用。
对该菌株进行形态特征、生理生化、Biolog GN 、(G+C)mol%含量测定及16S rDNA 序列分析,鉴定为绿针假单胞菌(Pseu domonas chlorora p his )。
特征为单细胞,极生单个鞭毛,不能利用聚B -羟基丁酸盐,能够较强地利用Biolog 系统95种碳源中的45种作为底物生长,较弱利用其中的6种底物,与绿针假单胞菌(Pseudomonas chlorora phis )的相似性达到98%,相似指数为0172。
用热解链方法测得基因组DNA 的(G+C)mol %含量为6511mol%。
以16S rDNA 序列为基础构建了包括13株邻近种属细菌在内的系统发育树,其中与模式致金色假单胞菌的同源性最近。
关键词:绿针假单胞菌;GP72;鉴定;Biolog GN;16S rDNA中图分类号:Q939 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2006)04-0516-06伴随着现代农业的飞速发展,大面积作物病虫害的防治越来越依赖于化学杀虫剂的应用,但随之而来的环境污染和病虫害抗药性的产生使得人们对现代农业的可持续性发展提出了新的要求。
近年来生物防治的观点得到了世界各国的广泛关注,寻找有效的生防菌以及研究它们相关的防治机制也就成为了当今人们关注的热点。
假单胞菌(Pseudomonas spp.)是活跃在植物根际的一类微生物。
许多菌株有抑制植物病害、促进植株生长的作用,属植物促生菌(Plant Growth_Promoting Rhizobacteria,PGPR)类。
大量研究[1~5]表明,这些具有生防作用的菌株尤以荧光性假单胞菌(Fluorescent Pseudomonads spp.)为主,包括铜绿假单胞菌[6,7](Pseudomonas aeruginosa )、致金色假单胞菌[8,9](Pseudomonas aureo faciens )、绿针假单胞菌[10,11](Pseudomonas chlororaphis )、荧光假单胞菌[12,13](Pseudomonas fluorescens )等。
有的已成为商业用生防产品,如瑞士BioAgri AB 公司研制的基于绿针假单胞菌的生防药剂Cedomon,用于大麦和燕麦种期处理可防治苗期病害[4]。
其它绿针假单胞菌如SPR044[10],MA 342[11],SPB1217[14]都经初步试验证明可作为有效的生防菌株。
我国华东地区经济作物甜椒的种植比较广泛,并且较易受到一些植物病原菌的侵害,特别是一些真菌如辣椒疫霉、终极腐霉、瓜果腐霉等的,因而从甜椒的根际土壤中筛选新的具有潜在生防效果的生防细菌具有非常重要的意义。
本文报道从甜椒根际土中分离筛选到一株对植物病原菌有拮抗作用的假单胞菌属菌株GP72,并对其进行了形态特征、生理生化鉴定、Biolog GN 、(G +C)mol%含量测定和16S rDNA 序列分析,鉴定为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis )。
1 材料和方法111 材料11111 菌种来源:假单胞属菌株(Pseudomonas spp.)GP72系土壤中分离得到。
假单胞菌(Pseudomonas spp.)M18及供试植物病原菌株系本实验室所保存菌株。
甜椒疫霉(Phytophthora capsici )由上海交通大学农学院提供。
致金色假单胞菌(P .aureo faciens )30_84,荧光假单胞菌(P .fluorescens )Q2_87,铜绿假单胞菌(P .aeruginosa )PAO1由美国农业部Linda S Thomashow 教授赠送。
11112 培养基:King .s B 培养基(KMB):蛋白胨20g,甘油15g,K 2PO 401392g,无水MgSO 401732g;琼脂16g ,pH715,定容至1L 。
1P 3KMB:配方与KMB 相同,但最后定容至3L(无琼脂)。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,定容至1L 。
11113 主要试剂和仪器:用于PCR 扩增的全套试剂及扩增引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司,其他试剂均为A.R.级;MODELU_200UV P VIS 紫外分光光度计及恒温摇床(Series 25)购自Edison 公司,H_600透射电镜购自日立公司,Biolog 细菌自动分析鉴定仪购自Biolog 公司,DHG -9123A 型电热恒温水槽购自上海精宏试验设备有限公司,PC T -100型PCR 仪购自Perkin_Elmer 公司。
112 菌株的分离筛选从江苏淮阴地区采集不同甜椒根际土样若干,称取1g 甜椒根须和1g 附着于根须的土壤样品溶于50mL 1P 3KMB 液体培养基中,并添加抗生素:氨苄青霉素(40L g P mL)、氯霉素(13L g P mL)、放线菌酮(100L g P mL),28e 下230r P min 摇床振荡1h,6个重复混和,从中取200L L 涂布于含同样剂量抗生素的KMB 琼脂平板上。
在28e 培养16~18h 待长出单菌落后用异步培养法[15]进行辣椒疫霉抑菌性试验,从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株。
113 拮抗性检测用异步培养法[15]测定菌株GP72对油菜菌核病、黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、西瓜炭疽病、棉花立枯病、水稻纹枯病、终极腐霉的拮抗作用。
大肠杆菌(Escherichia coli )DH 5A 为阴性对照菌株,Pseudomonas sp.M18为阳性对照菌株[16]。
114 形态特征革兰氏法染色,光学显微镜下观察菌体形态、大小;磷钨酸钠染色,透射电子显微镜下观察鞭毛;KMB 固体培养基,28e 培养,观察24h 菌龄的菌落形态。
115 生理生化特征参照文献[17][18]对GP72进行生理生化鉴定。
116 Biolog GN 分析在Biolog GN 96孔平板上,除对照孔不含碳源外,每孔都含有四唑紫(tetrazolium violet)缓冲营养培养基和不同碳源,被鉴定的菌细胞悬浮于微孔中,培养24h 后用Biolog 细菌自动鉴定仪检测供试菌株GP72的代谢指数。
117 基因组DNA 的(G+C)mol%含量测定基因组DNA 的提取参照文献[19]的方法并稍做改进,即在最后用70%乙醇洗涤干燥后,加1P 10体积的RNase,37e 温浴30min 备用。
将制备好的DNA 溶于1@SSC 中,采用热变性温度法(T m 值法)来测定DNA (G+C)mol%含量[18],按照经验公式1@SSC (G+C)mol%=2144@(T m -6913)计算。
对照菌株为大肠杆菌E .coli DH 5A 。
118 16S rDNA 的序列分析采用通用27F P 1492R 引物(正向引物:5c _AGAGTTTGATCATGGC TCAG_3c ;反向引物:5c _TACGGTTACC TTGTTACGAC TT_3c )进行16S rDNA 的PCR 扩增[20]。
PCR 扩增条件:94e 5min,80e 1min (hot_start);94e 1min,55e 1min,72e 2min,30个循环;72e 5min 。
扩增产物经纯化后,送上海英骏生物技术有限公司测序。
所测序列用BLAST 软件与GenBank 和RDP 数据库进行相似性分析,并与GenBank 中的相近序列在Clustal X(118)程序包中进行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析,最后形成一个多重序列匹配排列阵,其中形成的缺口用横杠/-0填补,用ME GA(311)程序包中的Neighbor_Joining 法[21]构建系统进化树。
使用Kimura 2_parameter 法,系统树各分枝的置信度经重抽样法(Bootstrap)1000次重复检测,DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
2 结果211 拮抗菌的分离筛选土壤样品匀浆后涂布于含抗生素的KMB 平板,通过异步培养法对平板上的单菌落进行筛选,得到了对辣椒疫霉产生抑菌性最强的菌株GP72(图1)。
进一步研究其拮抗性表明,GP72对多种植物病原真菌均有很强的抑制作用(表1)。
图1 GP72对辣椒疫霉产生的抑菌作用Fig.1 The i nhibi ti on of GP72agai nst Phyto phthora capsici .517何延静等:一株拮抗辣椒疫霉的假单胞菌的分离与鉴定.P 微生物学报(2006)46(4)表1 GP72与对照处理接真菌菌丝体的生长情况对比Table 1 Mycelial growth and comparison of 8funguses by GP72in asynchronous culture assayStrainDegrees of mycelial growthCK E .coli GP72M18Phytophthora capsici ++++++00Rhizoc tonia solani++++++00Fusarium oxysporum f.sp.nive um ++++++00Pythium ult imum +++++++0Sc lerotinia Sclerot io rum++++++00Fusarium oxysporum f.sp.cucume rinum +++++++++Co rticium sasakii ++++++00Colle tot richum lagenarium+++++++++0:no mycelial growth;+:1~10mm wide zone;++:11~20mm wide z one;+++:more than 21mm wide zone.212 形态特征菌株GP72为杆状(图2),013L m ~018L m @110L m ~111L m,革兰氏染色阴性,无芽孢,单极生鞭毛,能运动。
