粪便病原菌的分离与鉴定(ppt)

粪便中病原菌的分离培养与鉴定[摘要]目的：从粪便中分离、培养和检测病原菌，对于临床治疗及预后调查有一定的价值。

粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。

此次我们主要分离培养并鉴定粪便标本中的大肠埃希菌和痢疾志贺菌[3]。

方法：本文利用伊红美蓝平板培养后的菌落特征，再提纯培养细菌进行革兰染色镜检、动力实验、生化反应。

可鉴定粪便标本中的病原菌。

[关键词]革兰染色大肠埃希菌志贺菌分离培养鉴定1.实验材料与仪器1.1标本：粪便标本1.2培养基：普通琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂斜面培养基、营养肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基1.3试剂：细菌干粉培养基革兰染色法[1]试剂【结晶紫、碘酒、95%乙醇、稀释复红】、糖发酵管【乳糖、葡萄糖】、褔氏志贺菌诊断血清。

1.4仪器：接种环、接种针、酒精灯、试管架、恒温培养箱、显微镜、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁尔灭、灭菌平皿、刻度吸管、吸水纸、橡皮筋。

2.实验过程2.1细菌的分离与培养细菌分离培养：伊红美蓝平板分区划线分离（5区）。

无菌操作取粪便标本于固体平板培养基上，采用分区画线分离法培养细菌。

于37℃培养24小时，从而分离出单个菌落。

2.2细菌群体生长特征的观察观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。

粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。

紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。

淡粉红色菌落，半透明，直径1～2mm。

2.3细菌纯培养粪便标本在伊红蓝平板上，有紫黑色，粉红色两种菌落。

分别挑选这两种菌落在斜面培养基上接种标记，在37℃培养24h。

2.3.1斜面接种法选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落在平皿底部玻璃上，画个大圈选择菌落，右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，再用灭菌的接种环套住菌落，轻刮取菌，将其伸入代接斜面试管底部，轻轻向上划线，接接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上，观察斜面培养基。

实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本：肛门拭子培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子分离培养革兰染色（血平板）革兰染色触酶实验甘露醇实验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。

重点：色素和溶血现象•2、革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。

结果观察•1、菌落观察•2、形态学观察（二）生化反应•触酶试验：(-) (+)H 2o 2H 2o o 2氧化氢酶+菌种：可疑菌落试剂：3%过氧化氢方法：见右图结果：见右图甘露醇实验•甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论：现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论：咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验荚膜染色（石炭酸复红单染）分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转，10分钟分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。

临床模拟标本细菌学检验的实验设计书1.标本分析标本中可能的正常菌群：正常情况下肠道中有多种细菌寄生，包括大量的厌氧菌、肠球菌、大肠埃希菌、肠杆菌、变形杆菌、粪产碱杆菌等。

标本中可能存在的病原菌：①细菌性：吸收不良性腹泻，包括致病性大肠埃希菌等；产毒素性腹泻，包括霍乱弧菌、肠毒素型大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、变形杆菌、气单胞菌属、蜡样芽胞杆菌等；侵袭性腹泻，包括志贺菌、肠致病型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌等；食物中毒，包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、乙型溶血链球菌和肉毒梭菌等；伪膜性肠炎，包括艰难梭菌或金黄色葡萄球菌；慢性腹泻，可能由结核杆菌引起；继发性肠道感染：铜绿假单胞菌、非结核分枝杆菌等。

②真菌性：念珠菌、毛霉菌等。

③病毒性：轮状病毒等。

2.检验思路图1-1 粪便标本细菌学检验程序3.拟采用的实验方法及预期结果（1）显微镜检查（仅在怀疑为霍乱弧菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌感染等情况下进行）①不染色标本检查：用生理盐水或卢戈氏碘液或0.1%亚甲蓝染液与等量的粪便标本混合均匀涂于载玻片上，盖上盖玻片用相差显微镜或暗视野显微镜高倍镜镜检。

A.若标本呈米泔样或洗肉水样，镜检发现逗点状或弯曲状的弧菌，呈流星样穿梭，运动活泼，提示霍乱弧菌感染。

此时加入O群或O139群霍乱弧菌多价诊断血清，显微镜下观察与不加诊断血清比较，若大于80%的细菌停止运动或运动明显减弱，判断为制动试验阳性，可初步报告为“疑似O群或O139群霍乱弧菌”。

B.若发现呈S形、螺旋形并快速、拧塞样或投镖样运动的细菌，提示为弯曲菌。

C.若高倍镜观察发现有无光亮的卵圆形孢子或假菌丝可初步报告酵母样真菌感染。

②染色检查：如细菌染色呈现下列典型形态时，对诊断具有提示作用。

A.取新鲜米泔样类便标本涂片2张，用乙醇或甲醇固定，分别进行革兰染色和1：10稀释苯酚复红染色，油镜观察呈鱼群状排列的杆状或弧形红色革兰阴性杆菌。

模拟粪便中伤寒沙门菌的分离与鉴定肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，常寄居于人及动物的肠道内，亦存在于土壤、水和腐物中[1]。

多数是非致病菌或条件致病菌，少数为致病菌。

其生物学性状相似，但生化反应，抗原构造有差异，故可据此将它们进行分类、鉴定。

粪便中肠道菌的分离与鉴定对于临床病原学诊断具有重要意义。

1.材料与方法1.1 材料1.1.1模拟粪便、普通琼脂平板培养基、SS平板培养基、葡萄糖微量发酵管、乳糖微量发酵管、尿素酶微量管、醋酸铅培养基微量管、蛋白胨水培养基、吲哚试剂、半固体培养基、伤寒诊断血清、37℃恒温培养箱等。

1.2 方法1.2.1细菌分离培养取模拟粪便标本分区划种于SS平板培养基，置37℃培养箱培养18~24h后，观察结果，并对分离所获的菌落的细菌进一步鉴定。

1.2.2 细菌的生化反应挑取可疑菌落（无色菌落）的细菌，分别接种于葡萄糖微量发酵管、乳糖微量发酵管、尿素酶微量发酵管、醋酸铅培养基微量管、蛋白胨水培养基、半固体培养基，置37℃培养箱培养18~24h后观察结果。

1.2.3 血清学鉴定取伤寒诊断血清和生理盐水滴于玻片上，再取可疑菌分别与伤寒诊断血清和生理盐水混匀，观察有无凝集现象。

2.结果2.1细菌分离培养 SS平板上分离出两种不同性状菌落，一种为圆形、凸起、湿润、边缘整齐、表面光滑的无色透明菌落，直径约1~2mm，另一种为圆形凸起、湿润、边缘整齐、表面光滑的红色菌落，直径约2~3mm。

2.2 细菌生化反应和血清学鉴定所分到的两种不同性状菌落的生化反应、动力学试验、血清学鉴定结果见表1表1可疑菌的生化反应、动力试验和血清学检查结果双糖铁葡萄糖乳糖尿素 H2S 靛基质动力血清学可疑菌—/+ H2S+ + —— + — + +3.结果分析和讨论在肠杆菌科中，志贺菌、沙门菌等致病菌不发酵乳糖，其他大部分非致病肠道杆菌可分解乳糖，故在SS平板上无色半透明小菌落为可疑致病菌落[2]。