病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备(1)

初级检验技师考试微生物检验考试试题及答案(5)一、名词解释1.血清学诊断2.培养基3.基础培养基4.选择培养基5.鉴别培养基6.菌落二、填空题1.实验室细菌学检查结果的准确与否和标本的选择、、有直接关系。

2.辅助诊断风湿热的抗“O”实验属于。

3.血清学试验一般需作两次.其血清分别取自疾病的和 .第二次抗体效价比第一次时方有诊断意义。

4.对流行性脑炎患者进行细菌学检查.可采集的标本有、和。

5.进行病原菌的分离培养时.从有正常菌群部位采取的标本应接种于培养基或培养基。

6.细菌感染实验室检查中.常用的血清学方法有、和三大类。

7.属于直接凝集反应的血清学试验有和。

三、单项选择题1.目前在传染病的预防接种中.使用减毒活疫苗比使用灭活疫苗普遍.关于其原因下述不正确的是A.减毒活疫苗的免疫效果优于灭活疫苗B.减毒活疫苗刺激机体产生的特异性免疫的持续时间比灭活疫苗长C.减毒活疫苗能在机体内增殖或干扰野毒株的增殖及致病作用.灭活疫苗则不能D.减毒活疫苗可诱导机体产生分泌型IgA. 故适用于免疫缺陷或低下的患者E.减毒活疫苗一般只需接种一次即能达到免疫效果.而灭活疫苗需接种多次2.白百破三联疫苗的组成是A.百日咳类毒素.白喉类毒素.破伤风类毒素B.百日咳死疫苗.白喉类毒素.破伤风类毒素C.百日咳死疫苗.白喉死疫苗.破伤风类毒素D.百日咳活疫苗.白喉活疫苗.破伤风死疫苗E.百日咳活疫苗.白喉死疫苗.破伤风死疫苗3.使用时要注意防止Ⅰ型超敏反应的免疫制剂是A.丙种球蛋白B.胎盘球蛋白C.抗毒素D.白细胞介素E.干扰素4.关于胎盘球蛋白的叙述.错误的是A.由健康产妇的胎盘和婴儿脐带中提取制备B.一般含IgMC.一般不会引起超敏反应D.主要用于麻疹.甲型肝炎和脊髓灰质炎等病毒性疾病的紧急预防E.免疫效果不如高效价的特异性免疫球蛋白5.伤寒病人发病第一周内.分离病原菌应采取的标本是A.血液B.尿液C.粪便D.呕吐物E.脑脊液6.咽喉假膜标本涂片染色后.镜检出有异染颗粒的棒状杆菌.其临床意义在于诊断A.结核病B.军团病C.白喉D.脑脊髓膜炎E.百日咳7.一般需经3~4周培养才能见到有细菌生长的细菌是A.结核分枝杆菌；B.淋病奈氏菌；C.空肠弯曲菌；D.炭疽杆菌；E.军团菌8.在标本的采集与送检中不正确的做法是A.严格无菌操作.避免杂菌污染B.采取局部病变标本时要严格消毒后采集C.标本采集后立即送检D.尽可能采集病变明显处标本E.标本容器上贴好标签9.关于血清学试验结果分析时错误的是A. 试验阳性说明机体接触过相应的病原体；B.单次试验阳性不能完全证明新近感染；C. 试验阴性不能完全排除病原体感染的可能性；D. 试验阳性即有诊断意义E.双份血清标本.后者抗体效价比前者高四倍或四倍以上时有诊断意义。

动物检验检疫学实验一动物病原细菌的分离与鉴定预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制实验一动物病原细菌的分离与鉴定一、实验目的了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法二、实验原理初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征；确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征：普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。

大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。

三、实验材料1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠2）菌株：致病性大肠杆菌菌株3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。

4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。

四、操作步骤1.分离培养第一天：1.）处死小鼠，无菌解剖2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化；3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h；4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征；第二天5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。

挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。

糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。

临床医学检验技术(师)：细菌感染的病原学诊断考试题（题库版）1、单选构成细菌毒力的是（）A.基本结构B.特殊结构C.侵袭力和毒素D.分解代谢产物E.侵入机体的途径正确答案：C2、单选适用于麦康凯琼脂培养基（江南博哥）培养的细菌是（）A.肠道菌B.鼠疫杆菌C.白喉棒状杆菌D.肺炎链球菌E.分枝杆菌正确答案：A参考解析：麦康凯培养基具中等强度选择性，用于分离培养肠道细菌。

3、单选为观察细菌的运动情况，常用下列哪种方法（）A.悬滴法B.革兰染色法C.抗酸染色法D.鞭毛染色法E.墨汁染色法正确答案：A参考解析：观察细菌的运动情况常用悬滴法。

4、单选盛装细菌学检查标本的容器（）A.用75%酒精浸泡24小时后直接应用B.用碘酒浸泡12小时后直接应用C.高压灭菌、煮沸或干燥灭菌D.用浓硫酸处理后直接应用E.用水洗后直接应用正确答案：C参考解析：盛标本的容器须先经高压灭菌、煮沸、干热等物理方法灭菌，或用一次性无菌容器，而不能用消毒剂或酸类处理。

5、单选O/F试验主要用于肠杆菌科细菌和非发酵菌的鉴别，其原因是（）A.肠杆菌科细菌和非发酵菌均为发酵型B.肠杆菌科细菌和非发酵菌均为氧化型C.肠杆菌科细菌为发酵型，而非发酵菌为氧化型或产碱型D.肠杆菌科细菌为氧化型，而非发酵菌为发酵型E.肠杆菌科细菌和非发酵菌均为产碱型正确答案：C参考解析：细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧酵解的称为发酵型，不分解葡萄糖的细菌称为产碱型，氧化发酵试验主要用于肠杆菌科细菌和非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。

6、单选检测梅毒螺旋体最常用的染色方法是（）A.革兰染色法B.抗酸染色法C.负染色法D.镀银染色法E.Giemsa染色法正确答案：D参考解析：梅毒螺旋体普通染色不易着色，常采用Fontana镀银染色法，菌体染成棕褐色且变粗，在光镜下易于查见。

7、单选氧化-发酵试验正确的是（）A.开口管变黄，闭口管不变--发酵型B.开口管变黄，闭口管变黄--发酵型C.开口管不变，闭口管不变--发酵型D.开口管不变，闭口管变黄--氧化型E.铜绿假单胞菌为发酵型正确答案：B参考解析：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。

大肠杆菌灭活苗的制备
实验原理
致病性大肠杆菌是人和多种动物（猪、鸡等）的致病菌之一。

疫苗免疫是控
后者容易吸收和释放。

实验目的
1、
2、掌握细菌性疫苗的灭活原理与方法
3、
4、掌握疫苗的乳化原理与方法
5、
6、掌握细菌性疫苗的制备方法
实验器材与试剂
匀；
（3）乳化：将油相加入烧杯中电动搅拌，缓慢加入水相(油相︰水相为2:1)，逐渐增大搅拌速度，在组织搅拌机下以10000～12000r/min搅拌3min，停2min，
重复3次，将菌苗分装。

（4）外观检测：观察疫苗的外观；
（5）稳定性检测：将疫苗置离心管中，3500r/min离心15min，观察有无分
层或破乳；
（6）剂型检测：将疫苗滴于冷水表面，不分散为油包水型，分散则为水包油型；粘度检查:用出口内径为1.2mm的1mL吸管在常温下吸满1mL疫苗后垂直
思考题
1、
2、灭活和乳化过程有哪项注意事项？
3、
4、如何评价疫苗效果？。

兽医微生物学实验复习题1、兽医微生物实验室注意事项是什么？答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。

3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂，4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。

5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。

6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜7、微生物绘图要求有哪些？答：①绘出一个视野，圆形。

②细菌大小比例合理，必须标明名称。

③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。

④绘图一律用铅笔。

8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。

9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。

注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。

植物病原细菌的分离、纯化及鉴定1实验目的及意义植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。

2实验材料及准备2.1 实验材料：新发病的植物组织2.2 培养基准备（LB培养基）：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%，pH7.0-7.2，121℃灭菌20 min，备用。

2.3 实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿（Φ9cm），斜面培养基，灭菌水，1% NaClO，打火机。

3 实验方法及步骤3.1 植物样品的采集选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入纸袋保存或邮寄，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d），长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。

3.2 发病组织的显微检查准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切取约2×4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜(4×，10×)检查，看到白色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的菌体，证明的确为细菌性病害。

3.3 病原物的分离和培养选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干；（以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1×4mm的大小，1%的次氯酸钠消毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min，让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB平板上划线。

28℃温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、菌落大小、颜色、形态。

3.4 病原物的纯化和保存3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。

若仍然生长不纯，则需多次纯化。

枣果霉烂病病原鉴定(一)——引起新疆枣果霉烂病的几种曲霉菌的分离鉴定沙娜瓦尔·色买提;玉山江·买买提;郭庆元;白剑宇【摘要】[目的]枣果霉烂病是枣果产后的重要病害,曲霉菌是枣果霉烂最重要的致病菌.目前,国内外对引起枣果霉烂病的病原种类报道甚少.明确新疆枣果霉烂病的病原种类及优势致病种群,有效防控该病的发生和危害.[方法]通过广泛采样、组织分离和回接证病对大量病样进行系统分离;对几种致病曲霉菌进行形态鉴定、分子验证及致病性比较.[结果l曲霉属真菌为枣果霉烂病的最主要病原;分离得到的大多数曲霉属的单孢分离菌株对枣果具有明显的致病性;致病的214个曲霉属单孢菌株分属于5个种,分别为黑曲霉、黄曲霉、赤曲霉、赭曲霉和聚多曲霉;其中黑曲霉的分离频率最高,致病性最强.[结论]引起新疆枣果霉烂病的曲霉有5种,其中黑曲霉为优势致病种.【期刊名称】《新疆农业科学》【年(卷),期】2016(053)003【总页数】8页(P502-509)【关键词】枣;果实霉烂病;曲霉;病原鉴定【作者】沙娜瓦尔·色买提;玉山江·买买提;郭庆元;白剑宇【作者单位】新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业科学院植物保护研究所,乌鲁木齐830091;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】S436.65【研究意义】我国是世界上主要的枣生产国家，有几千年的栽培历史，拥有全世界99%以上的枣种质资源[l]。

枣果因其味甜、肉质厚并且含有丰富的营养物质和具有较高的营养价值及食疗功能等优良品质而受到消费者的喜爱，是国内外市场知名的果产品[2]。

近年来，在大力发展林果业的政策带动下，新疆林果业有了突飞猛进的发展，新疆红枣目前种植面积已达35×104 hm2(525万亩)，居全国第三位，产量62×104 t[3]。

但是，目前新疆枣制干方法仍沿用自然晾干等原始方式，因此极易受污染，出现酸甜失衡、营养价值下降等问题；在枣果储运过程中很容易发生霉变引起枣果霉烂等贮藏期病害，最终导致市场价值降低[4]。

病虫害防治中的病原菌分离与鉴定技术随着农业的发展和气候变化的影响，病虫害对作物的危害日益突出，给农民朋友们带来了巨大的损失。

为了高效地防治病虫害，病原菌的分离与鉴定技术在农业生产中变得至关重要。

本文将介绍病虫害防治中的病原菌分离与鉴定技术及其应用。

1. 病原菌分离技术病原菌分离技术是研究病原菌特性和分类的重要手段，其过程包括取样、分离纯种和培养等步骤。

首先，我们需要在病害的田间表现明显的部位进行采样。

采样时我们要选择健康的、有一定病害程度的植株，避免受到其他病原菌的干扰。

在采样完成后，我们需要将样品送至实验室进行分离纯种。

分离纯种的过程主要包括从样品中挑选病原菌进行单菌落培养、培养基的制备和菌落转接等步骤。

这些步骤旨在确保分离到的病原菌是单一的纯种，以便进行后续的鉴定工作。

2. 病原菌鉴定技术病原菌鉴定技术是通过对分离纯种进行一系列的实验和分析，确定病原菌的分类、形态特征、生理特性和分子标记等信息。

常用的鉴定方法包括形态学观察、生理生化试验和分子生物学技术。

在形态学观察中，我们可以通过放大镜或显微镜观察病原菌的菌落形态、菌丝特征和孢子形态等，从而对其进行初步的分类。

生理生化试验可以通过菌落特征、生长速度、营养需求和代谢产物等进行分析，以进一步确定病原菌的种属归属。

分子生物学技术在病原菌鉴定中得到了广泛应用。

其中，PCR (聚合酶链式反应) 和DNA测序是常用的方法。

通过PCR技术，我们可以扩增特定的基因片段，从而得到病原菌的特异性DNA序列。

而DNA 测序则可以对PCR扩增产物进行测序分析，从而确定病原菌的属种和亲缘关系。

3. 病原菌分离与鉴定技术的应用病原菌分离与鉴定技术广泛应用于病虫害防治领域。

通过对病害样品进行病原菌分离与鉴定，可以及时准确地判断病害的病原菌，并针对性地制定防治策略。

除了在农作物病虫害的防治中应用，病原菌分离与鉴定技术还可以用于果树、蔬菜和花卉等园艺作物的病害防治。

此外，病原菌分离与鉴定技术还在新品种选育、抗病育种和病原菌演化等方面发挥着重要作用。

细菌的人工培养人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖。

细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的。

一、培养基的制备原则：1、必须有充足的营养。

2、合适的酸碱度。

3、绝对无菌。

二、培养基的制备培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料。

常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。

按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类。

以下介绍常用基础培养基的制备。

（一）肉汤培养基：制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解。

按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟。

冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用。

制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2肉汤培养基常用于增菌培养。

（二）肉汤琼脂固体培养基：在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。

经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板。

制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml。

普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种。

（琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固。

琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂。

琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右。

）（三）肉汤琼脂半固体培养基：在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成。

猪大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的肠道传染病，主要表现为仔猪黄白痢和水肿病。

随着养猪业规模化发展，该病呈上升趋势，致使仔猪成活率和断乳窝重降低，严重影响了养猪业的发展。

由于致病性大肠杆菌存在广泛的耐药性，而且血清型多，抗原复杂，给防治带来了极大的困难。

针对某猪场提供的腹泻严重的仔猪黄白痢病料，我们进行了细菌分离鉴定和药敏试验，以期为仔猪大肠杆菌病的有效防治提供一些技术参考资料。

1、具体方法（1）病原菌的分离培养：无菌采集具有黄痢、白痢症状的仔猪粪便，接种于麦康凯培养基上，37℃温箱中培养24 小时。

挑取红色中等大小光滑菌落，接种于普通肉汤增菌，置37℃温箱培养16～18小时，然后将培养物分别划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板进行细菌培养，24 小时后挑取平板上可疑菌落抹片染色镜检，后将疑似菌落少许再接种于普通肉汤，供以后试验用。

（2）生化试验：糖发酵、M．R、硫化氢、V-P、吲哚试验等。

③药敏试验：利用庆大霉素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟、链霉素、环丙沙星、恩若沙星、红霉素等8种药物按常规纸片法进行。

2、观察结果（1）病原菌的形态：观察到6个疑似菌株在麦康凯琼脂培养16 小时后均为红色菌落，在伊红美蓝琼脂上培养16小时后均为紫黑色带金属光泽的中等大小圆形菌落，革兰氏染色镜检均为革兰氏阴性中等大小杆菌。

（2）生化鉴定：分离的6株细菌都能发酵葡萄糖、麦芽糖和乳糖，并产酸产气；部分菌株不分解蔗糖，不产生硫化氢，吲哚和甲基红试验(M．R)均为阳性，V-P试验为阴性，由此可判定分离菌株为大肠杆菌。

（3）药敏试验：所有分离菌均对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。

3、结论分析从猪场分离的6株细菌，经培养特性、形态及生化试验试验鉴定，表明均为致病性大肠杆菌。

药敏试验结果表明6株大肠杆菌对丁胺卡那霉素、头孢噻肟、恩若沙星敏感，而对其他药物产生了不同程度的耐药性。

竭诚为您提供优质文档/双击可除病原菌的分离鉴定篇一：常见病原菌采样分离过程金黄色葡萄球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）奶样的采集：采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。

（2）乳房皮肤拭子用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。

拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。

（3）鼻腔拭子用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。

菌种的初步分离首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。

需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。

2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。

3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。

肠球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。

（2）泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。

猪链球菌病及其自家灭活疫苗的制备作者：刘晨晨来源：《西部论丛》2018年第09期摘要：猪链球菌病是由多种致病性猪链球菌感染引起的一种人畜共患病，该病临床上常表现为败血症、脑膜炎、淋巴脓肿、关节炎等症状。

由于链球菌血清型较多，较有效的预防方法是分离本场猪链球菌，制备成自家灭活苗进行免疫。

关键词：猪链球菌病疫苗制备自家灭活苗一、猪链球菌病的特点（一）病原特点猪链球菌是一种革兰氏阳性球菌，呈链状排列，无鞭毛，不运动，不形成芽胞，但有荚膜。

为兼性厌氧菌，但在无氧时溶血明显，培养最适温度为37℃。

菌落细小，直径1～2mm，透明、发亮、光滑、圆形、边缘整齐，在液体培养基中呈链状。

到目前为止，共有35个血清型（1～34，1/2型），最常见的致病血清型为2型。

（二）致病性猪链球菌的主要毒力因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子以及溶血素等。

我国科研工作者研究比较多的是溶菌酶释放蛋白（MRP）和细胞外蛋白因子（EF），二者均为阳性的菌株，一般具有较高的毒力，它们是评价猪链球菌2型毒力的重要指标。

CPS是抵抗巨噬细胞吞噬的重要物质，是猪链球菌进行分型的标志，是目前唯一被确认的毒力因子。

（三）流行特点1 病原广泛存在猪链球菌常污染环境，可在粪、灰尘及水中存活较长时间。

该病四季均可发生，但在炎热，潮湿季节多发。

猪链球菌经呼吸道、消化道、伤口及黏膜感染，也可垂直传播，昆虫媒介在该病的传播中也起着重要作用。

猪的链球菌是条件性致病菌，只有在它适宜的环境中，猪只抵抗力低下的情况下才能发病，多呈散发和地方性流行，偶有暴发。

新疫区可呈暴发流行，发病率和死亡率较高。

各种品种，各种年龄的猪均易感染。

2 仔猪发病死亡率高仔猪多发生于1，2月龄，此时的母源抗体水平相对较低，本身抵抗力差，在应激，其他病原的侵袭等诱因下多发生；同时可通过小猪咬架的伤口，带菌者的唾液及血液传播，因此仔猪的发病率和死亡率较其他生长阶段要高。

临床上仔猪多见于败血型和脑膜脑炎型。

实验名称：病原微生物的分离与鉴定实验日期：2023年4月10日实验目的：1. 掌握病原微生物的分离纯化技术。

2. 学习病原微生物的鉴定方法。

3. 培养实验操作技能，提高对病原微生物的认识。

实验原理：病原微生物是引起人类和动物疾病的微生物。

通过分离纯化病原微生物，可以对其进行鉴定，为疾病的诊断和治疗提供依据。

本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化病原微生物，并通过显微镜观察、生化试验等方法进行鉴定。

实验材料：1. 病原微生物样本：疑似肠道致病菌样本。

2. 培养基：营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂等。

3. 实验仪器：恒温培养箱、显微镜、无菌操作台、接种环、酒精灯等。

4. 实验试剂：无菌生理盐水、无菌甘油、革兰氏染色液、生化试剂等。

实验方法：1. 分离纯化：（1）将疑似肠道致病菌样本接种于营养肉汤中，37℃恒温培养24小时。

（2）取培养后的肉汤，用无菌生理盐水进行10倍稀释，取适量稀释液接种于营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板上。

（3）将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。

2. 鉴定：（1）挑取典型菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态和染色结果。

（2）将纯化后的菌株接种于生化试验培养基中，观察细菌的生化反应。

实验结果：1. 分离纯化：（1）在营养琼脂平板和麦康凯琼脂平板上均观察到典型的菌落生长，菌落呈圆形、光滑、湿润、边缘整齐，且在麦康凯琼脂平板上呈现红色。

（2）挑取典型菌落进行革兰氏染色，结果显示细菌为革兰氏阴性杆菌。

2. 鉴定：（1）革兰氏染色结果显示，细菌为革兰氏阴性杆菌。

（2）生化试验结果显示，该菌株能够分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖，不分解蔗糖；产生硫化氢，不产生吲哚和甲基红；氧化酶试验阳性。

结论：根据实验结果，疑似肠道致病菌样本中的病原微生物为革兰氏阴性杆菌，可能为肠道致病菌。

为进一步确定病原菌的种类，建议进行进一步的鉴定实验。

实验讨论：1. 本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化病原微生物，操作简便，结果可靠。

Ａ型产气荚膜梭菌的分离及鉴定高文伟１，郭宏伟１，任家琰１，蒋玉文２，杨茂荣３，赵玉臣３，柴奎强３，周县利３（１山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１；２中国兽药监察所，北京１０００８１；３山西省药物培植场，降县０４３６００）摘要：从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料３９例，通过病原微生物分离培养，形态学观察和血清型鉴定，初步表明分离到的产气荚膜梭菌主要是Ａ型，对ＰＣＲ产物的序列分析表明经过ＰＣＲ得到了特异性的α毒素基因片段，因而Ａ型产气荚膜梭菌是引起山西鹿场发生鹿出血性肠炎的主要致病菌。

为该疾病的防治和疫苗研制提供依据。

关键词：山西鹿场；Ａ型产气荚膜梭菌；分离；鉴定中图分类号：Ｓ８５２．６文献标识码：ＡＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＧａｏＷｅｎｗｅｉ１，ＧｕｏＨｏｎｇｗｅｉ１，ＲｅｎＪｉａｙａｎ１，ＪｉａｎｇＹｕｗｅｎ２，ＹａｎｇＭａｏｒｏｎｇ３，ＺｈａｏＹｕｃｈｅｎ３，ＣａｉＫｕｉｑｉａｎｇ３，ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１；２ＴｈｅＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎＡｃａｄｅｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１；３ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＦｉｅｌｄ，Ｊｉａｎｇｘｉａｎ０４３６００）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ３９ｃａｓｅｓｏｆｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅｍａｊｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘａｍｉｎｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｅｒｕｍｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｉｔｉｓｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｏｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｍａｄｅｔｈａｔｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｔｈａｔｃａｕｓｉｎｇｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｆｏｒｅｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｈａｎｘｉｃｅｒｖｕｓｆａｒｍ，ｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ基金项目：山西省攻关项目“鹿出血性肠炎多价疫苗的研制”（０１２０２９）。

第四章植物病原菌分离与纯化植物病原菌一、植物病原菌分离流程二、分离的准备❿分离的准备工作➢无菌室操作前保持清洁无菌➢接种工作准备➢培养基的准备❿分离材料选择➢以收获的材料从病健交界处采样➢果实腐烂从开始腐烂处分离➢根腐和枯萎层可能从离土较远处分离➢有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等➢有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等发病后分离❿组织表面消毒➢⑴升汞：1‰◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl能增强杀菌能力。

◆处理时间：30’S-30min不等，常3－5min；所需时间因材料不同而异，消毒后灭菌水3－5次➢附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒效果，除气泡抽气、70％酒精浸2－3秒➢⑵漂白粉◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消毒，也可处理种子◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使用。

◆最好现配现用，放久失效，有效成分CaClO次氯酸钙◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯气有强烈臭味。

◆一般3－5min，时间长短因材料不同而不同。

处理种子5－10min，长的可达20－30min。

➢优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。

➢（3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。

◆较大的材料在酒精中浸或棉花擦，然后在火焰烧去。

◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒时可能会同时杀死其中的病原真菌，消毒时间应尽量缩短。

比较安全的方法是不用药剂消毒，而以灭菌水换洗八九次。

❿培养基的准备●分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。

➢寄生性细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。

➢一种适宜于纯培养的培养基不一定适宜于分离（杂菌太多）●有时分离失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度不适当或存放的时间太长。