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小鼠肝动脉重建对长时间冷保存移植肝存活率的影响

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DO I:10 3969/j iss n 1674 7445 2010 03 002基金项目:广东省科技厅社会发展计划项目(2009B030801012)作者单位:510080 广州,中山大学附属第一医院移植外科通讯作者:王国栋,E m ai:l w gdgd@163 co m 实验研究小鼠肝动脉重建对长时间冷保存移植肝存活率的影响王国栋摘要! 目的 研究小鼠肝动脉重建(hepatic a rterial reconstructi on,HAR)对长时间冷保存移植肝存活率的影响。

方法 同系雄性C57BL/6小鼠68只,分为冷保存时间(co l d prese rvation ti m e, CPT)1h组、CPT4h组、CPT8h组、CPT16h组、CPT16h+HAR组(供、受体小鼠各一半)。

小鼠供肝经门静脉灌注4∀UW液后保存。

肝脏移植采用缝合法(肝上下腔静脉)和袖套法(门静脉、肝下下腔静脉)吻合,胆管采用内支架管重建法。

小鼠HAR采用含供体肝动脉的腹主动脉与受体腹主动脉端侧吻合的方法。

观察术后5组受体小鼠移植肝的存活时间,用组织学检查肝细胞损伤情况,用免疫组织化学法观察肝细胞再生功能。

结果 CPT1h、4h、8h组受体术后12d移植物的存活率分别为7/7、10/10、9/9。

CPT16h组除1例小鼠存活外,其余均在移植术后36h内死亡,存活率为10%(1/10),CPT16h+HAR组受体90%(9/10)存活,两组存活率相比,差异有统计学意义(P <0 01)。

CPT1h、4h组的移植物组织损伤程度轻,CPT8h组的移植物组织损伤程度较前两组严重,但肝细胞再生活跃。

CRT16h组的移植肝组织表现为广泛肝细胞空泡变性、坏死,肝细胞再生不明显。

CPT16h+HAR组仅有轻度的肝窦淤血,肝细胞空泡变性、坏死改变,肝细胞再生活跃。

结论HAR可提高长时间冷保存移植肝的存活率。

关键词! 小鼠;肝脏移植;冷保存损伤;肝动脉重建;存活率E ffec t of h epatic ar ter i al reconstruc ti on i n m ice on the survival rate of li ver grafts foll ow i ng long term co l d preservation inju ry WANG Guo dong D e p ar t m ent of T ransp lan t ation Surgery,F irst A ff iliated H o s p ital of Sun Yat sen Universit y,Guangzhou510080,ChinaCorres p onding author:W AN G Guo dong,E mail:wgdgd@163 co mAbstract! O b ject i ve T o study the e ffect o f hepatic arte rial reconstruc ti on(HAR)on the surv i va l ra te of li ver g ra fts foll ow i ng l ong term co l d preservati on i n j ury M e thods Syngene ic m ale C57BL/6m i ce(n= 68)w ere d i v ided i nto5groups:CPT1,4,8,16h and CPT16h+HAR g roup L i v er perfusi on was flushed into po rtal vein w i th4∀UW soluti on and the g ra fts w ere preserv ed i n4∀UW so l ution O rt hotopic li ve r trans p l antati on(OLT)w as perfor m ed w it h a co m b i nati on of suture(suprahepatic vena cava)and cuff anasto m osis technique(i nfrahepati c vena cava and porta l ve i n) The bil e duct was reconnected t hrough the i ntra l u m i na l stent The m ethods for HAR i n m ice i nc l ude end to si de anast om osis o f abdom ina l aorta w ith hepatic arte ry from donor li ve rs t o abdo m i nal aorta in the rec i p i ent R ecipient surv i va l was foll ow ed up and hepatoce ll u lar i n j ury w as eva l uated by hist o logy H epatocyte repli cation w as exa m i ned by i m m unoh istochem i stry R esu lts Surv i va l ra te on po stopera ti ve day12i n CPT1,4,8h group w as7/7,10/10,9/9,respecti ve ly R ecipients(9of 10)in CPT16h group died w it h i n36h after transplanta ti on,w hereas on l y10%(1/10)o f m ice rema i ned ali ve on day12after transplantati on A ll an i m als but one i n CPT16h+HAR group surv i ved12d a fter arter i a l reconstructi on There was si gn ifi cant difference i n surv i v al rate bet ween the t wo g roups(P<0 01) H isto logy show ed m il d i n j ury i n grafts o f CPT1and4h g roups M ore severe i n j ury and obv i ous hepatocy te repli cation w as observed i n CPT8h g roup co m pared w it h the CPT1and4h g roups H i sto l ogy ex a m i nati on in16h CPT groupshow ed ex tens i ve hepatocyte vacuo lar degenerati on and a reas of nec rosis w ithout i ncreased hepa t o cy te replica ti on L i ve r g ra fts in CPT16h+HAR group show ed m ild sinuso i da l congesti on,vacuolar degeneration,hepato cy te necrosis and acti ve hepatocyte replica ti on Con clusi on HAR can i m prove t he surv ival rate o f li v er g ra fts w it h seve re long ter m co ld preservati on i n j uryK ey words! M ouse;L i ver transp l antati on;Co l d preservation inj ury;H epatic arte rial reconstruc ti on;Surv i va l rate虽然UW液和HTK液等保存液的应用明显延长了移植肝的冷保存时限,但供肝保存时的冷缺血损伤和复流后的再灌注损伤仍然是影响肝脏移植后功能恢复的重要因素[1]。

冷缺血时间越长,移植肝功能损伤越明显,重度损伤可使移植肝出现原发性无功能,需要紧急再次肝移植以挽救病人的生命。

研究冷保存损伤的机制是寻求减轻损伤方法的根本途径[2 4]。

近年来,利用转基因小鼠的肝移植模型研究肝脏冷保存损伤机制的报道逐渐增多[5,6]。

由于小鼠肝移植术操作有一定的难度,目前尚缺乏稳定的冷保存损伤后的小鼠肝脏移植模型。

为此,本研究观察冷保存不同时间后移植肝的存活率和小鼠肝动脉重建(hepatic arterial recon structi o n,HAR)对重度冷保存损伤移植肝存活率的影响,现将有关结果报道如下。

材料与方法一、实验动物采用健康、雄性、清洁级C57BL/6同系小鼠68只,体重23~27g。

饲养条件符合医学实验动物的保护和使用标准。

二、试剂和仪器兔抗小鼠免疫球蛋白购自美国Vector Laborato ries公司,溴脱氧尿核苷购自美国S ig m a公司,抗溴脱氧尿核苷单克隆抗体购自德国Boehri n ger M annhei m公司,辣根过氧化物酶复合物试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自美国Vector La boratories。

聚乙烯血管套管购自美国Becton D ick son公司。

Le ica GZ6E型单人双目手术显微镜(德国产),Surg i v et小动物麻醉机(美国产)。

三、分组实验动物分5组:(1)冷保存时间(cold pre ser vati o n tm i e,CPT)1h组,12只;(2)CP T4h组,12只;(3)CPT8h组,12只;(4)CP T16h组,16只;(5)CPT16h+HAR组,16只。

供受体小鼠各一半。

四、手术方法1 供体手术:术前动物不禁饮水。

采用小动物麻醉机,异氟醚持续吸入麻醉,手术在单人双目手术显微镜下进行。

皮肤消毒后横切口进腹,切断肝镰状韧带,切口上提使肝脏充分暴露。

用湿纱布将胃和小肠向左牵开,先游离肝胃韧带、粘连。

游离肝下的静脉、右肾静脉。

结扎右肾动脉,切断右肾上腺静脉。

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大鼠肝移植重建肝动脉对胆管超微结构和并发症的影响

大鼠肝移植重建肝动脉对胆管超微结构和并发症的影响

大鼠肝移植重建肝动脉对胆管超微结构和并发症的影响作者：邱明链曾永毅林科灿张国寿刘景丰【摘要】目的观察大鼠原位肝移植重建肝动脉对肝内胆管上皮细胞缺血再灌注损伤后超微结构及术后胆道并发症的影响。

方法 228只SD大鼠分为假手术组（8只）、肝移植重建肝动脉组（55对）和未重建肝动脉组（55对）。

重建肝动脉组和未重建肝动脉组分别于肝脏复流后0.5、3、6、12、24、36、48 h取材，用透射电镜观察肝内胆管上皮细胞的超微结构，通过计算机图像分析系统对线粒体形态计量分析；观察术后胆道并发症。

结果两组肝内胆管上皮细胞损伤均有加重，表现为线粒体肿胀、嵴模糊或消失、微绒毛减少等超微结构改变，至24 h达高峰，以后逐渐恢复。

术后两组线粒体平均面积和周径随时间的延长逐渐增大，线粒体数密度随时间延长而减少。

在24 h，两组缺血再灌注损伤最显著，之后均开始缓解。

在24、36、48 h，两组线粒体平均面积、平均周径比较，差异均有统计学意义（t=-3.566，-7.780，-4.730，-4.610，-2.599，-5.370，P＜0.05）；在36、48 h，两组线粒体平均数密度比较，差异有统计学意义（t=-4.619，4.000，P&lt;0.05）。

重建肝动脉组的胆道并发症发生率低于未重建肝动脉组（χ2=4.286，P＜0.05）。

结论大鼠肝移植重建肝动脉对肝内胆管上皮细胞缺血再灌注损伤后的超微结构具有保护作用，有利于术后恢复和减少胆道并发症的发生。

【关键词】肝移植；肝动脉重建；胆道并发症；大鼠；超微结构Effects of hepatic artery reconstruction in rat with orthotopic liver transplantation on ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells and biliary complications【Abstract】 Objective To observe the effects of hepatic artery reconstruction in rat with orthotopic liver transplantation （OLT）on ultrastructure changes of intrahepatic biliary epithelial cells after ischemia reperfusion injury and postoperative biliary complications. Methods Male SD rats were divided into sham operation group （SO）, OLT with hepatic artery reconstruction group （HA） and OLT without hepatic artery reconstruction group （NA）. The liver tissue samples were collected at 0.5, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours after ischemia reperfusion in both HA group and NA group. The ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells was observed by transmission electron microscope, and the morphometric analysis by the computer image analysis system. Thepostoperative biliary complications were also observed. Results In HA group and NA group, the injury of intrahepatic biliary epithelial cells aggravated gradually along with the reperfusion. The ultrastructure changes, such as enlarged mitochondria, blurred or disappeared cristae and decreased number of microvilli, were most significant at 24 hours and then recovered gradually. The mitochondrial average area and average perimeter were increased and the mitochondrial numerical density was decreased gradually along with the reperfusion. At 24, 36, 48 hours, the mitochondrial average area and average perimeter in NA group were significantly greater than those in HA group （t=-3.566, -7.780, -4.730, -4.610, -2.599, -5.730, P ＜0.05）. The average numerial density of mitochondia in NA group was significantly less than that in HA group at 36, 48 hours （t=-4.619, 4.000, P＜0.05）. The incidence rate of biliary complications in HA group is significantly lower than that in NA group （χ2=4.286, P＜0.05）. Conclusions Hepatic artery reconstruction in rat with OLT has an protective effect on the ultrastructure of intrahepatic biliary epithelial cells after ischemia reperfusion. It is beneficial to the recovery of intrahepatic bile duct epithelial cells and can reduce the incidence rate of biliary complications.。

低温保存同种主动脉和肺动脉移植物免疫排斥反应研究的开题报告

低温保存同种主动脉和肺动脉移植物免疫排斥反应研究的开题报告

低温保存同种主动脉和肺动脉移植物免疫排斥反应研究的
开题报告
一、研究背景和意义
随着器官移植技术的不断发展和完善，移植手术已经成为许多患者治疗疾病的重要手段之一，但随之而来的主要问题之一就是移植物的免疫排斥反应。

目前，常见的移植物免疫抑制剂使用对于排斥反应的控制效果不佳，而低温保存移植物是一种新的手段，已经被证明可以有效减轻移植物免疫排斥反应，提高移植物的存活率。

二、研究内容和方法
本研究旨在探究低温保存同种主动脉和肺动脉移植物的免疫排斥反应，并研究其机制。

具体研究内容如下：
1.建立动物模型：在同种小鼠上进行主动脉和肺动脉移植手术，分为低温保存组和普通保存组，观察两组移植物的存活情况。

2.采集组织样本：在移植后1、3、7、14天分别采集移植物组织、血液样本，进行病理学、免疫学、遗传学等方面的研究。

3.数据分析：通过统计学方法对采集的样本数据进行比较分析，探究低温保存同种主动脉和肺动脉移植物的免疫排斥反应的差异和机制。

三、预期成果和意义价值
通过本研究，我们可以得到以下预期成果：
1.探究低温保存对移植物免疫排斥反应的影响：比较低温保存和普通保存后同种主动脉和肺动脉移植物的存活情况、免疫反应、病理学变化等方面的差异。

2.探究低温保存对移植物免疫排斥反应机制的影响：通过遗传学、免疫学等方面的研究，探究低温保存对移植物免疫排斥反应的机制。

3.提高同种移植物的存活率：发现低温保存可以减轻移植物免疫排斥反应，提高同种移植物的存活率，为患者提供更好的治疗效果。

综上所述，本研究的意义在于为同种移植技术的进一步发展提供理论依据和实验依据，为临床工作提供更科学、有效的治疗方案。

小鼠肝动脉重建对长时间冷保存移植肝存活率的影响

小鼠肝动脉重建对长时间冷保存移植肝存活率的影响

６ ）ｗ ｒ ｉｉｅ ｎｏ５ ｇｏ ｐ ：ＣＰ ，４，８，１ ｎ Ｐ ６ ｈ＋ＨＡＲ ｒｕ ．Ｌｖｒｐ ｒ ｓｏ ｓｆ ｓ ｅ ８ ｅｅｄｖｄ ｄ ｉｔ ｒｕ ｓ Ｔ１ ６ｈａｄＣ Ｔ １ ｇｏ ｐ ｉｅ ｅｆ ｉｎ ｗａ ｕ ｈ ｄ ｕ ｌ
ｉ ｔ ０ｔ ｌ ｅｎ ｗｉ ｎ ｏ Ｄ ｒ ｉ ｔ ４℃ Ｕ ｓ ｌ ｔ ｎ ａ ｄ ｔ ｅ ｇ ａ ｓｗ ｒ ｒ ｓ ｒ ｅ ｎ ４ ａｖ ｈ Ｗ ｏｕ ｉ ｎ ｈ ｒ ｆ ｅ ｅ ｐ ｅ ｅ ｄ ｉ ℃ Ｕ ｏ ｕ ｉｎ Ｏ ｔ ｏｏ ｉ ｌ ｅ ｒ ｎ — ｏ ｔ ｖ Ｗ ｓ ｌ ｔ ． ｒｈ ｔｐ ｃ ｉ ｒｔ ｓ ｏ ｖ ａ
鼠供 肝 经 门静 脉 灌 注 ４ ｕ 液 后 保 存 。肝 脏 移 植 采 用 缝 合 法 （ 上 下 腔 静 脉 ） 和 袖 套 法 （ ℃ ｗ 肝 门静 脉 、
肝下下腔静脉 ）吻合 ，胆管采用 内支架管重建 法。小 鼠 Ｈ Ｒ采用 含供体肝 动脉 的腹主动 脉与 受体腹 Ａ 主动脉端侧吻合 的方法 。观察 术后 ５组受 体小鼠移植 肝的存 活时 间，用 组织学 检查 肝细胞 损伤情 况 ， 用免疫组织化学法 观察 肝细胞再生功能 。结果 Ｃ Ｔ １ ４ｈ 组受体 术后 １ Ｐ ｈ、 、８ｈ ２ｄ移植物 的存活率分
植肝存活率 的影 响。方 法 同 系雄性 Ｃ ７ Ｌ ６小 鼠 ６ ５Ｂ／ ８只 ，分 为冷保 存 时 间 （ ｏ ｒｓｒａｏ ｉ ｅ ｃｌ ｐｅｅｖｔ ｎ ｔ ， ｄ ｉ ｍ ＣＴ Ｐ ）ｌｈ组 、Ｃ Ｔ４ｈ组 、Ｃ Ｔ８ｈ组 、Ｃ Ｔ１ 、Ｃ Ｔ１ Ｐ Ｐ Ｐ ６ｈ组 Ｐ ６ｈ＋Ｈ Ｒ组 （ 、受体小 鼠各一半 ） Ａ 供 。小
别为 ７ ７ ０ １ ／ 。Ｃ Ｔ １ 组 除 １例小 鼠存话 外 ，其余 均在 移植 术后 ３ ／ 、１／ ０、９ ９ Ｐ ６ｈ ６ ｈ内死亡 ，存 活 率为
单纯冷藏与低温机械灌注保存肝移植前后炎症因子和凋亡因子的变化

单纯冷藏与低温机械灌注保存肝移植前后炎症因子和凋亡因子的变化

单纯冷藏与低温机械灌注保存肝移植前后炎症因子和凋亡因子的变化赵德芳;陈立坤【摘要】BACKGROUND:Static cold storage is the main storage method of liver transplantation in the past 40 years. There are success cases in foreign countries about the use of mechanical reperfusion in liver transplantation, but there is no large-scale development in China. OBJECTIVE:To investigate and compare the inflammatory cytokines and apoptotic factors in isolated liver between static cold storage and hypothermic machine perfusion before and after liver transplantation. METHODS:There were donor group, static cold storage group and hypothermic machine perfusion group in the study, and 30 dogs were in each group. Liver specimens from donor dogs were subjected to static cold storage and then transplanted into dogs in the static cold storage group. Liver specimens from dogs in the static cold storage group were subjected to hypothermic machine perfusion and then transplanted into dogs in the hypothermic machine perfusion group. Liver specimens from dogs in the hypothermic machine perfusion were used in other experiments. Dogs in the donor group were euthanatized. After liver transplantation, 20 dogs from static cold storage group and hypothermic machine perfusion group were selected respectively for further study. RESULTS AND CONCLUSION: When the liver was separated from the dogs, inflammatory cytokines and apoptosis factors had no significant difference in the static cold storage group and hypothermic machine&nbsp;perfusiongroup (P > 0.05). P53 expression in these two groups had no significant difference before and after transplantation (P > 0.05). Interleukin-1βand interleukin-8 in these two groups had no significant difference before transplantation (P > 0.05). Compared with the static cold storage group, expressions of tumor necrosis factor-α, macrophage inflammatory protein-1α, macrophage inflammatory protein-1β, CC chemokine ligand 20 and FASR were significantly lower in the hypothermic machine perfusion group before transplantation (P< 0.01). Compared with the static cold storage, interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, interleukin-8, macrophage inflammatory protein-1α, macrophage inflammatory protein-1β, CC chemokine ligand 20, FASR and nuclear factor-κB were reduced significantly in the hypothermic machine perfusion group at 60 minutes after transplantation (P < 0.01). Taken together, hypothermic machine perfusion can significantly reduce inflammatory cytokines and apoptosis factor, which is conducive for liver transplantation.%背景：单纯冷藏是自肝移植开展40年来临床采用的主要保存方法，虽然采用机械灌注行肝移植在国外有成功案例，在国内并没有规模性开展。