肝干细胞研究进展【摘要】肝移植是目前治疗终末期肝病的主要方法，但供肝短缺限制了其应用，导致许多患者未能获得肝移植。
近年来，肝干细胞的分离鉴定、纯化培养技术日渐成熟，在动物实验和临床研究中均取得了较大进展。
移植到受体的干细胞已被证实可以分化形成正常肝细胞，从而通过提高肝细胞数量来改善肝功能，延长了患者生存期，使其有机会获得肝移植。
同时为急慢性肝损伤、肝代谢性疾病的治疗提供了新的细胞移植疗法，成为肝病学和干细胞研究领域的热点。
【关键词】干细胞肝进展目前肝移植是各类终末期肝病的主要治疗方法。
但由于供肝的严重缺乏，大大限制了其广泛应用，很多患者因得不到供肝而死亡。
肝细胞移植在等待肝移植的过程中起到桥梁作用，为实现肝移植带来希望。
但由于可用于移植的肝细胞数量不足，加之移植后分裂次数少等原因使其纠正肝功能的作用有限，而干细胞的出现恰恰解决了这一难题。
干细胞是一类能自我复制增殖并具有分化为多种类型细胞潜能的细胞群，能根据需要通过控制条件使其分化为需要的、代替受损的或病态的细胞，较肝细胞有更小的免疫排斥反应，可更好地达到恢复器官功能、治愈疾病的目的。
对肝干细胞的研究已进入临床前期和临床试验阶段，具有重大临床意义和应用前景。
1 肝干细胞的分类1.1 胎肝细胞胎肝细胞是胚胎时期分裂形成肝脏的前体细胞，较成熟肝细胞具有更大的增殖潜能。
Dabeva等［1］对14 d大鼠胎肝的细胞类型分析发现了一类细胞同时表达肝细胞和胆管细胞标志，可以分化为肝细胞或胆管细胞，因此被认为是肝干细胞的胚胎来源。
Dan等［2］从74～108 d人胎肝中分离得到的人胎肝多潜能祖细胞，体外培养，具有强增殖力，并可分化为肝细胞、胆管上皮细胞、脂肪细胞等其他组织来源的细胞，在移植入肝病动物模型后可分化为有功能的肝细胞并长期存活。
由于胎肝细胞易于大量分离培养，因此是很好的移植细胞供体，但由于来源涉及伦理问题限制了其临床应用。
1.2 成体肝内干细胞对成体肝内干细胞的研究已取得较大进展，已成功分离、培养并移植。
其中Farber在研究动物肝癌模型时发现的肝卵圆细胞是最早发现并被认可的一类肝干细胞，其形态特征是细胞小，仅6～8 μm，核大，呈卵圆形，核/质比例大，胞质内细胞器少，含少量线粒体和粗面内质网，核内有凝聚的染色质，可同时表达肝细胞和胆管细胞的表面标志如CK-7、CK-8、CK-18和CK-19等。
Petersen等［3］发现A6阳性的肝卵圆细胞也表达Thy-1、sca-1、CD34和CD45等造血干细胞标志。
2006年Davies等［4］利用永生化卵圆细胞系PIL-2研究发现环氧合酶COX-2抑制剂SC-236可以诱导卵圆细胞数量减少。
同年Suzuki等［5］研究发现IL-15可以明显上调卵圆细胞的累积，增加肝再生能力。
最近Szabo等［6］在研究肝再生模型时发现肝卵圆细胞表达Matrilin-2，认为是一种新的卵圆细胞标志。
而 Jelnes等［7］在研究不同类型的肝再生模型时发现卵圆细胞具有明显的异质性。
除卵圆细胞外在成体肝内还发现了其他的肝干细胞。
Mitaka等［8］从成体大鼠肝内分离到与卵圆细胞类似的细胞，称为“小肝细胞”，大小是成熟肝细胞的1/3～1/2，呈单核、低分化形态，在培养中形成克隆并分化为有功能的成熟肝细胞。
Fujikawa等［9］从成体小鼠肝内分离甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP ），AFP阳性细胞具有未分化内胚层细胞的特征，体外培养可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞。
Khuu等［10］在人原代肝细胞培养时发现肝上皮细胞表达肝细胞、胆管细胞和干细胞的标志，认为是另一种人肝干细胞。
Cerec等［11］从人HepaRG细胞群中分离到了具有双向潜能的肝干细胞，体外培养可以分化为肝细胞样和胆管细胞样细胞，认为也是一种肝内干细胞。
1.3 骨髓来源的干细胞很多学者认为造血干细胞可以作为肝干细胞的肝外来源。
Avital等［12］研究证实从骨髓分离的造血干细胞移植入受体后，可整合到受体肝板，分化为成熟肝细胞并合成尿素。
Harris等［13］以绿色荧光蛋白报告基因转染干细胞并进行性别交叉移植实验，发现分化的肝细胞没有表达荧光蛋白，且仍为双倍体，进一步证实了骨髓造血干细胞可横向分化为肝细胞。
而Grompe［14］认为骨髓来源的肝细胞是通过细胞融合而不是分化为肝细胞。
而Oh 等［15］研究发现在一定生理条件下，一部分肝细胞可以来自骨髓，没有发生细胞融合。
除骨髓造血干细胞外，骨髓间充质干细胞、基质干细胞也被认为是肝干细胞的来源。
1.4 其他肝外干细胞目前从许多肝外组织中如胰腺、唾液腺、羊膜和真皮中均发现了可以分化为肝细胞的干细胞。
另外胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）由于具有多潜能，且可以分化为各种细胞，所以也被认为是肝干细胞的来源之一。
2 肝内干细胞的定位和来源2.1 定位由于缺乏特异性标志物，卵圆细胞在肝脏中的定位较为困难。
干细胞主要位于汇管区、纤维隔和终末胆管树即赫氏管周围。
肝脏祖细胞位于门脉周围及整个肝小叶。
Burke等［16］认为卵圆细胞存在于门周区和肝实质内。
2.2 来源肝干细胞与胚胎时期的原始肝内胆管一样均表达肝细胞和胆管细胞的表面标志，因此原始肝内胆管细胞可能是成体肝卵圆细胞的祖细胞。
Avital等［12］证实灵长类动物胎肝中存在具有双重表现型的原始肝脏上皮细胞，在体外表达白蛋白、AFP的肝细胞和表达CK-7、CK-19的胆管细胞，因此认为成体肝脏内干细胞是胚胎时期胎肝中的干细胞的遗留。
也有许多学者认为骨髓是肝内干细胞的来源之一，并且在一定条件下如肝损伤时可向肝内运输补充干细胞池，参与肝损伤的修复［17］。
3 临床前期研究3.1 肝干细胞的分离纯化培养因为干细胞数量较少，想分离肝干细胞，首先要使其大量增生，需要建立肝干细胞增殖模型。
最早是1977年Solt D和Farber E建立的Solt-Farber模型。
1983年Solt等［18］对此模型进行了改良，即目前最常用的肝卵圆增殖模型。
另外用乙硫氨酸、N-乙酰对氨基酚、倒千里光碱、Dipin和D-半乳糖胺等均建立了肝卵圆细胞增殖模型。
Ise 等［19］结扎大鼠的70%的门静脉也获得了肝干细胞增殖模型。
Gordon等［20］利用两步胶原酶法从大鼠分离得到小肝细胞。
Nakauchi ［21］采用FACS法从13.5 d小鼠胎肝内分离得到表达C-MetCD49fc-kitcd45Ter119的肝干细胞。
2005年Stamp等［22］使用免疫磁珠分离法和单克隆抗体GCTM-5从人胎肝中分离到人肝胚细胞和肝胆上皮细胞亚群。
荧光活化细胞法和免疫磁珠法均需要特异性抗原和抗体，由于目前还未发现肝卵圆细胞的确切表面标志，此类方法仍需改进。
肝干细胞的体外培养较困难，因为在体外干细胞很容易自身分化为肝细胞而失去增殖能力，目前的研究发现生长因子、细胞外基质和饲养层有利于干细胞的体外培养。
Suzuki等［5］利用层黏连蛋白包被培养板并加入肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF，50 ng/mL）获得了干细胞体外培养细胞克隆。
Monga等［23］在培养液中加入HGF、SCF、Flt-3后培养发现肝干细胞可大量增殖，而He等［24］在培养板中加入PREF即成纤维细胞饲养层，结果有饲养层的培养板中肝干细胞增殖明显并保持未分化状态3个月，而无饲养层的培养板中肝干细胞很快分化。
3.2 肝干细胞移植肝干细胞移植借鉴了肝细胞移植的方法。
Kusano等［25］认为在肝脏未发生较大结构破坏时是最佳移植部位，而当肝脏严重受损时不利于干细胞的成活，需要异位移植。
而在所有肝外器官中脾脏是肝细胞的最佳部位。
移植方式以经门静脉注入干细胞和脾内注射两种方法最为常用。
Avital等［12］用骨髓干细胞悬液经近侧门静脉注入，发现干细胞在肝脏内增殖状况良好。
Matsusaka等［26］采用夹闭脾门处静脉将干细胞悬液注入脾内，然后结扎门静脉左支的方法增加细胞在脾内着床的机会。
Fang等［27］在将干细胞移植入肝硬化小鼠的肝脏内发现肝损伤程度减轻，并且移植的干细胞分化为肝细胞并表达白蛋白。
Kashofer等［28］将纯化的造血干细胞移植入I型酪氨酸血症模型大鼠体内，重建了肝脏的生化功能，缓解了病情。
最近，Yu等［29］报道将表达HGF的间充质干细胞植入大鼠肝移植模型后发现植入的干细胞与受体肝融合并分泌白蛋白，表明干细胞移植可以改善肝再生。
4 临床研究目前研究最多的是骨髓造血干细胞和外周血干细胞自体移植。
2002年Kumar等［30］报道，对1例原发性淀粉样变患者肝移植术后淀粉样变复发实施自体骨髓干细胞移植，28个月后发现其症状体征明显改善。
2006年Arai等［31］报道，对43例暴发性肝衰竭（fulminant hepatic failure，FHF）患者和45例急性自限性肝炎（acute self-limited hepatitis，AH）患者进行血OPN （osteopontin）检测比较，发现FHF平均血OPN水平高于AH患者（P=0.003），而且OPN高的患者预后较差。
同年Tsamandas等［32］对77例丙型肝炎的肝活组织检查标本分析发现肝祖细胞（hepatic progenitor cell，HPC）的表达与疾病的严重程度呈正相关，并由此提出HPC的生长和增殖可以作为预后的一项重要指标。
Katoonizadeh等［33］对74例急性亚急性重症肝损伤患者的肝活组织检查进行分析发现，组织中增生肝细胞和HPC的比例与临床肝损伤程度呈正相关，肝细胞损失和HPC活化较少，而成熟肝细胞大量增生的活组织检查标本的患者生存率较高。
Gupta等［34］报道，对12例先天性肝硬变患儿行自体干细胞移植，5例因肝硬变进展死亡，7例存活，其中4例胆管炎消失，5例有黄便，3例肝硬变硬度减轻，6例肝功能改善，6例食欲提高，肝胆管扫描4例胆汁排泄改善，病理学组织检查示3例肝硬变改善，再次证实了干细胞移植治疗肝硬变的临床效果。
5 前景与展望肝干细胞的研究已经在动物模型和临床研究中取得了部分成功，为最终治愈肝脏疾病开辟了新的研究方向。
尽管还有很多问题尚未解决，如：肝干细胞确切的特异性标志，更成熟的干细胞分离、纯化、鉴定、体外培养技术，干细胞的确切增殖分化机制，如何防止其癌变等，但越来越多的成功报道已经向世人展示了其广阔而美好的应用前景，为临床治疗终末期肝病带来了新的曙光。
参考文献[1] Dabeva MD， PetkovPM， Sandhu J， et al. Proliferation and differentiation of fetal liver epithelial progenitor cells after transplantation into adult rat liver[J]. American Journal of Pathology，2000，156（6）:2017-2031.[2] Dan YY， Riehle KJ， Lazaro C， et al. Isolation of multipotent progenitor cells from human fetal liver capable of differentiating into liver and mesenchymal lineages[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（26）:9912-9917.[3] Petersen BE， Goff JP， Greenberger JS， et al. Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat[J]. Hepatology，1998，27（20）:433-445.[4] Davies RS， Knight B， Tian YW， et al. Hepatic oval cell response to the choline-deficient， ethionine supplemented model of murine liver injury is attenuated by the administration of a cyclo-oxygenase 2 inhibitor[J]. Carcinogenesis，2006，27（8）:1607-1616.[5] Suzuki A， McCall S， Choi SS， et al. Interleukin-15 increase hepatic regenerative activity[J]. J Hepatol，2006，45（3）:410-418.[6] Szabo E， Lodi C， Korpos E， et al. Expression of matrilin-2 in oval cells during rat liver regeneration[J]. Matrix Biol，2007，26（7）:554-560.[7] Jelnes P， Santoni-Rugiu E， Rasmussen M， et al. Remarkable heterogeneity displayed by oval cells in rat and mouse models of stem cell-mediated liver regeneration[J]. Hepatology， 2007，45（6）:1462-1470.[8] Mitaka T， Kojima T， Mizuguchi T， et al. Growth and maturation of small hepatocytes isolated from adult rat liver[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1995，214（2）:310-317.[9] Fujikawa T， Hirose T， Fujii H， et al. Purification of adult hepatic progenitor cells using green fluorescent protein （GFP）-transgenic mice and fluorescence-activated cell sorting[J]. J Hepatology， 2003，39（2）:162-170.[10] Khuu DN， Najimi M， Sokal EM. Epithelial cells with hepatobiliary phenotype:is it another stem cell candidate for healthy adult humanliver[J]. World J Gastroenterol， 2007，13（10）:1554-1560.[11] Cerec V， Glaise D， Garnier D， et al. Transdifferentiation of hepatocyte-like cells from the human hepatoma HepaRG cell line through bipotent progenitor[J]. Hepatology， 2007，45（4）:957-967.[12] Avital I， Feraresso C， Aoki T， et al. Bone marrow-derival liver stem cell and mature hepatocyte engraftment in livers undergoing rejection[J]. Surgery， 2000，132:384-390.[13] Harris JR， Brown GA， Jorqensen M， et al. Bone marrow-derived cells home to and regenerate retinal pigment epithelium after injury[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci， 2006，47（5）:2108-2113.[14] Grompe M. The role of bone marrow stem cells in liverregeneration[J]. Semin Liver Dis， 2003，23（4）:363-372.[15] Oh SH， Witek RP， Bae SH， et al. Bone marrow-derived hepatic oval cells differentiate into hepatocytes in 2-acetylaminofluorene/partial hepatectomy-induced liver regeneration[J]. Gastroenterology， 2007，132（3）:1077-1087.[16] Burke ZD， Shen CN， Ralphs KL， et al. Characterization of liver function in transdifferentiated hepatocytes[J]. J Cell Physiol，2006，206（1）:147-159.[17] Lagasse E， Connors H， Al-Dhalimy M， et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo[J]. Nat Med， 2000，6（11）:1212-1213.[18] Solt DB， Cayama E， Tsuda H， et al. Promotion of liver cancer development by brief exposure to dietary 2-acetylaminofluorene plus partial hepatectomy or carbon tetrachloride[J]. Cancer Res， 1983，43（1）:188-191.[19] Ise N， Sato T， Yasui O， et al. Enhanced proliferation of heatic progenitor cells in rats after portal branch occlusion[J]. Liver Transpl，2004，10（6）:748-754.[20] Gordon GJ， Butz GM， Grisham JW， et al. Isolation， short-term culture，and transplantation of small hepatocyte-like progenitor cells from retrrisine-exposed rats[J]. J Transplantation， 2002，73（8）:1236-1243.[21] Nakauchi H. Isolation and clonal characterization of hematopoietic and liver stem cells[J]. Cornea， 2004，23（8 Suppl）:S2-7.[22] Stamp L， Crosby HA， Hawes SM， et al. A novel cell-surface marker found on human embryonic hepatoblasts and a subpopulation of hepatic biliary epithelial cells[J]. Stem Cells， 2005，23（1）:103-112.[23] Monga SP， Tang Y， Candotti F， et al. Expasion of hepatic and hematopoietic stem cell utilizing mouse embryonic liver explants[J]. J Cell Transplant， 2001，10（1）:81-89.[24] He ZP， Tan WQ， Tanq YF， et al. Activation， isolation，identification and in vitro proliferation of oval cells from adult rat livers[J]. Cell Prolif， 2004，37（2）:177-187.[25] Kusano M， Mito M. Observations on the fine structure of long survived hepatocytes inoculated into rat spleen[J]. Gastroenterology，1982，82:616-628.[26] Matsusaka S， Toyosaka A， Nakasho K， et al. The role of oval cells in rat hepaticyte transplantation[J]. Transplantation， 2000，70:441-446.[27] Fang B， Shi M， Liao L， et al. Systemic infusion of FLKI（+）mesenchymal stem cells amliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice[J]. Transplatation， 2004，78（1）:83-88.[28] Kashofer K， Bonnet D. Gene therapy progress and prospects:stem cell plasticity[J]. Gene Ther， 2005，12（16）:1229-1234.[29] Yu Y， Yao AH， Chen N， et al. Mesenchymal stem cells over-expressing hepatocyte growth factor improve small-for-size liver grafts regeneration[J]. Mol Ther， 2007，15（7）:1382-1389.[30] Kumar KS， Lefkowitch J， Russo MW， et al. Successful sequential liver and stem cell transplantation for hepatic failure due to primary AL amyloidosis[J]. Gastroenterology， 2002，122（7）:2026-2031.[31] Arai M， Yokosuka O， Kanda T， et al. Serum osteopontin levels in patients with acute liver dysfunction[J]. Scand J Gastroenterol， 2006，41（1）:102-110.[32] Tsamandas AC， Syrokosta I， Thomopoulos K， et al. Potential role of hepatic progenitor cells expression in cases of chronic hepatitis C and their relation to response to theropy:a clinicopathologic study[J]. Liver Int， 2006，26（7）:817-826.[33] Katoonizadeh A， Nevens F， Verslype C， et al. Liver regeneration in acute severe liver impairment:a clinicopathological correlation study[J]. Liver Int， 2006，26（10）:1225-1233.[34] Gupta DK， Sharma S， Venugopal P， et al. Stem cells as a therapeutic modality in pediatric malformations[J]. Transplant Proc，2007，39（3):700-702.。
