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基因工程抗体及其进展【摘要】着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
【关键字词】基因工程抗体人源化抗体小分子抗体广阔的前景基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等) 正逐渐取代动物源性单抗。
随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。
分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。
抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。
自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。
异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。
随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。
基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。
基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。
人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。
具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。
通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。
基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。
肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。
自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。
疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。
抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。
载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。
转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。
抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。
抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。
B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。
基因工程抗体概述和基本技术(Genetic Engineering Antibody)一、概述以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。
产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体(McAb)技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。
1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。
将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹(magic bullets)的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。
尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。
由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体(human anti-murine antibodies, HAMA)，这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。
最好的办法是应用人源性单抗。
但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。
基因工程抗体技术依赖于两个基础：一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。
由一个仅识别一种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。
其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。
单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。
基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA 重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。
该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。
当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。
融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括B 淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。
一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb 的杂交瘤细胞。
其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。
（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。
经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。
HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。
第十三章基因工程抗体抗体研究的世代•第一代多克隆抗体•第二代单克隆抗体•第三代基因工程抗体一.多克隆抗体（polyclonal antibody）：指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。
如:免疫血清（含多种特异性抗体）。
实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病如：破伤风抗毒素血清→抗破伤风胎盘球蛋白→抗病毒感染（2）临床诊断，缺点：特异性差。
二.单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。
特点：具有高度均一性。
杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞无限增殖；免疫B细胞合成、分泌特异性抗体。
鼠源单抗临床应用的障碍•血清半衰期短，20h•抗原抗体结合力、亲和力不够•HAMA反应：8－10天出现，20－30天高峰，anti-id封闭与抗原结合位点，抗鼠抗体加速单抗清除。
•过敏休克影响单抗与靶细胞或抗原结合引起变态反应和器官损害HAMA反应的示意图基因工程抗体单克隆抗体在诊断和治疗中具有重要的作用。
但是鼠源性的单抗用于临床治疗易产生人抗鼠抗体（Human anti-Mouse Antibody,HAMA)。
利用基因工程技术，对抗体进行改造，减少鼠源性的成分，增加人源化的成分。
利于单抗的临床应用。
第二节鼠单抗的人源化1.人鼠嵌合抗体：鼠单抗的可变区序列＋人抗体恒定区序列2.利用计算机辅助设计，通过定点突变，改变可变区的氨基酸，减少鼠源性。
1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。
构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。
构建重组表达载体2 鼠单抗可变区的人源化尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。
为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。
CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。
经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。
（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）•2002年完全人源化单抗humira获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义的大事，预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。
Humira是Abbott/CAT公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。
第三节小分子抗体和抗体融合蛋白1.小分子抗体：改造基因，截取具有生物活性的区段，加以重组表达。
2.融合蛋白抗体：抗体的部分基因片段＋其他蛋白的基因。
其他蛋白如蓖麻蛋白或绿脓杆菌外毒素等。
抗体药物销售趋势图治疗型单克隆体－基因时代明星• 2007年4月3日•国内单抗药物发展迅速，上市的单抗药物有11个，其中我国自行开发的有6个，处于临床研究阶段的有5个。
已批准上市的单抗适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥大肠癌冠心病淋巴瘤移植排斥炎症性肠病、类风湿CD317-1A血小板受体ⅡbⅢaCD20CD25TNF-аOKT3PanorexReoProRituxanSimulectRemicade鼠单抗鼠单抗人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体人－鼠嵌合抗体19861995(德国)1994199719981998、1999适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植排斥乳腺癌RVS感染AMLCLL CD25HER-2RSV F蛋白CD33CD52ZanapaxHerceptinSynagisMylotargCAMPATH人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体－化疗药物交联物人源化抗体19971998199820002001正在进行临床开发中的基因工程抗体适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段银屑病IL－8CD11a(IgG1)ICAM-3CD80CD2CD3ABX－IL8Anti-CD11aICM3IDEC-114MEDI-507Smart anti-CD3Human(人源)Humanized(人源化)HumanizedPrimatizedHumanizedHumanized(IgG)ⅡⅠ，Ⅱ临床前ⅠⅠⅠ/Ⅱ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段风湿性关节炎Complement(C5)TNF-аTNF-аTNF-аCD4CD45G1.1D2E7CDP870InfliximabIDEC-151MDX-CD4HumanizedHumanHumanized( Fab)Chimeric(IgG1)(嵌合)Primatized(IgG1)Human (IgG)ⅡⅢⅡFDA批准（1999）ⅡⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段克罗恩病，节段性回肠炎溃疡性结肠炎自身免疫病TNF-аTNF-аа4ß7CD4CD3InfliximabCDP571LDP－02OrthoCloneOKT4ASmartanti-CD3Chimeric(IgG1)Humanized(IgG4)HumanizedHumanized(IgG)HumanizedFDA批准（1998）ⅡⅡⅡⅠ/Ⅱ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段系统性红斑狼疮多发性硬化症C5CD40LCD40LComplement(C5)VLA-4CD40L5G1.1AntovaIDEC-1315G1.1MEDI-507AntegrenIDEC-131HumanizedHumanized(IgG)HumanizedHumanized(IgG)Humanized(IgG)HumanizedⅠⅡ(继续)ⅡⅠ/ⅡⅡⅡ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段自身免疫出血性病症气喘/变态反应CD64(FcgR)IL-5IL-5IL-4IgECD23MDX-33SCH55700SB-240563SB-240683rhuMab-E25IDEC-152HumanHumanized(IgG4)HumanizedHumanizedHumanized(IgG1)PrimmatizedⅡⅡⅡⅡⅢⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段移植物抗宿主疾病同种异体移植排斥CD147CD2CD2CD3CD3ABX-CBLBTI-322MEDI－507Orthoclone/OKT3SMAT anti-CD3Murine(IgM)(小鼠)Rat(IgG)(大鼠)HumanizedMurine(Ig2a)HumanizedⅢⅡⅠ/ⅡFDA批准（1996）Ⅰ/Ⅱ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥CD25CD25ß2-integrinCD4CD147ZenapaxSimulectLDP-01OKT4AABX-CBLHumanized(IgG1)Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)Humanized(IgG)Murine(IgM)FDA批准（1997）FDA批准（1998）Ⅰ/Ⅱ аⅡⅢ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段同种异体移植排斥中风青光眼抗凝血剂CD40LCD18ß2-integrinTGF－ß2Fact ⅦAntovaAnti-LFA-1LDP-01CAT-152Corsevin MHumanized(IgG)Murine[F(ab’)2]Humanized(IgG)HumanChimeric(Fab)Ⅰ/Ⅱ(继续)ⅢⅠ/Ⅱ аⅡⅠ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段冠状血管成形术并发症心肌梗死罗氏肉瘤病毒Glycoprotein ⅡbⅢareceptorPDGF ßRCD18F proteinReoProAbciximabCDP860Anti-CD18SynagisHumanized(IgG)Humanized[F(ab’)2]Humanized[F(ab’)2]Humanized(IgG1)Ⅰ/Ⅱ аⅡⅡFDA批准（1998）适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段艾滋病乙型肝炎巨细胞病毒中毒性休克一般癌症Gp120Hep BCMVTNF-аCD14VEGFPRO542OstavirProtovirMAK-195(SEGAND)IC14Anti-VEGFCD4 fusionHumanHumanMurine[F(ab’)2]?Humanized(IgG1)ⅡⅡ(批准)ⅢⅢⅠⅢ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段卵巢癌结肠病肺病头、颈部病变CA12517-1A CellsurfaceantigenAnti-idiotypicGD3epitopeEGFROvaRexPanorexBEC2IMC－C225MurineMurine(IgG2a)Murine(IgG)MerckKGaAChimeric(IgG0Ⅱ/Ⅲ德国批准（1995）ⅢⅢ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段乳腺病慢性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病非何杰金淋巴瘤HER2/neuCD52CD33CD20CD22HerceptinCampath1/( LDP03)SmartRituxanLymphoCideHumanized(IgG1)Humanized(IgG1)M195Chimeric(IgG1)Humanized(IgG)FDA批准（1998）生物制品许可申请蛋白质设计FDA批准Ⅰ/Ⅱ适用病症靶抗原抗体名称抗体来源临床阶段非何杰金淋巴瘤黑色素瘤HLAHLA DR抗id(GD2)*Smart 1D10Oncolym(Lym-1)TriGemHumanizedRadiolabelled murineMurineⅠⅡ/ⅢⅡ•武汉生物制品研究所研制的注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体是国内自行研制最早批准上市的抗体；北京百泰生物与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”(商品名：泰欣生)是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物；•第四军医大学、成都华神联合研制的美妥昔单抗注射液(商品名：利卡汀)是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。
