2020秋季 基因工程 第9章 基因工程抗体 第2部分

基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。

抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。

基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。

基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。

这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。

2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。

这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。

3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。

这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。

4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。

这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。

基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。

2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。

3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。

4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。

基因工程抗体综述前言：抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。

Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。

于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。

1896年Gruber和Durham发现了凝集素。

1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。

于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。

直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。

免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。

在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。

但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。

在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然的或病理的球蛋白的免疫功能。

基因工程抗体你的单抗杂交瘤细胞株产不出抗体，不妨试试基因工程抗体基因工程抗体的概念比较广本文仅仅讨论怎么从杂交瘤细胞株开始做基因工程抗体主要解决如下几个问题：1. 知识产权保护的需要，给细胞株建立指纹身份；2. 更容易发文章；3. 序列比细胞株更容易保存；4. 对于不容易从腹水或者培养制备抗体的细胞株换个思路5. 人源化抗体的需求6. 嵌合抗体潜在需要从杂交瘤细胞株做单克隆抗体，主要解决分三大步骤：1. 杂交瘤细胞株测序测序的方法主要有两种，1)兼并引物设计（degenerate primer）分别扩增抗体重连和轻链的可变区2)RACE法，RACE即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends),是一种基于逆转录PCR从样本中快速扩增cDNA的5′端及3'端的技术方法1）更加的节约成本，便捷高效；但是很多的实验室不掌握核心的兼并引物设计方法，只能选择RACE方法。

2. 载体构建分别构建重链和轻链的表达质粒，表达载体的选择和元件优化组合尤为重要，除了大家认为密码子优化问题，还有载体的信号肽选择尤为重要，这个决定抗体的表达水平，一般优先选择V5信号肽，当抗体产量不高的时候也可以试试其他的信号肽，筛选最优；当然载体的抗体的骨架选择也是需要注意的。

3. 共转染哺乳动物细胞表达抗体的表达一般选用HKE293或者CHO细胞系，好用的细胞系一般都是商业化公司压箱底至宝，不会轻易流出，其配套的转染试剂和培养基也是经过特殊优化的，培养基和转染试剂是可以公开出售的。

进行以上实验，必须要1.2.0*10^6以上的杂交瘤细胞，越纯越好；杂交瘤细胞株测序的难点在于基于PCR的引物对的设计，很多实验室没有这个技术，按照文献发表的序列重复，往往也效果不好；这个时候可以委托专业化公司帮忙。

基因工程表达抗体的益处：长期做单抗的实验室都知道，经常遇到杂交瘤细胞株产生抗体能力越来越弱或者抗体效价越来越低，主要原因可能是抗体基因发生突变，因此早期测序留住抗体基因尤为重要，对于规模化生产单抗的均一性更为重要。

2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。

基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。

基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。

人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。

具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。

通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。

基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。

肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。

自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。

疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。

抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。

载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。

转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。

抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。

抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。

B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。

基因工程抗体概述和基本技术(Genetic Engineering Antibody)一、概述以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。

产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体(McAb)技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。

1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。

将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹(magic bullets)的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。

尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。

由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体(human anti-murine antibodies, HAMA)，这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。

最好的办法是应用人源性单抗。

但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。

基因工程抗体技术依赖于两个基础：一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。

由一个仅识别一种抗原表位的B 细胞克隆产生的同源抗体，为单克隆抗体（McAb）。

其理化性状高度均一，抗原结合部位和同种型都相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，有效抗体含量高，无效蛋白含量少，易于实验标准化和大量制备。

单克隆抗体在医学领域中有广泛的应用。

基因工程抗体(genetic engineering antibody)又称重组抗体，在充分认识Ig(immunoglobulin)的基因结构和功能基础上，应用DNA 重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对编码Ig分子基因进行切割、拼接与修饰等，并导入受体细胞，使之表达出新型抗体分子。

该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，减少或去除了无关结构，更接近人的Ig，第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特征。

当两个细胞紧密接触时候，其细胞膜可能融合在一起。

融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体(heterokaryon)，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞(hybid cell)，包括B 淋巴细胞杂交细胞和T淋巴细胞杂交细胞。

一、B淋巴细胞杂交瘤技术该技术中采用的两株细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。

前者的主要特征是它的抗体分泌功能，但在体外不能长期生长；而后者则可在体外培养无限分裂增殖，二者杂交融合，形成在体外无限增殖分裂并产生McAb 的杂交瘤细胞。

其原理如下：（一）细胞的选择与融合融合细胞一方为经过抗原免疫的B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞；另一方则是具有永生性的肿瘤细胞，选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。

浓度为40％(W／V)的聚乙二醇PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂。

（二）选择培养基的应用细胞融合是一个随机的物理过程。

经融合过程后细胞将有多种形式出现，须进行特别的筛选得到融合的脾细胞与瘤细胞。

HAT培养基应用原理：细胞的DNA合成一般有两条途径。