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小白菜BcUBCE2基因的克隆及表达分析赵瑞丽;钟凤林;林义章;高世超;林俊芳;杨碧云;胡海非【摘要】采用cDNA-AFLP和RACE技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶E2基因(ubiquitin conjugating enzyme E2),命名为BcUBCE2.序列分析表明,BcUBCE2基因cDNA全长830 bp,包含1个456 bp的开放阅读框,编码152个氨基酸.结构分析发现,该序列包含一个泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸.进化分析显示,小白菜BcUBCE2蛋白同拟南芥E2蛋白的亲缘关系最近.qRT-PCR分析表明,BcUBCE2基因在小白菜根、茎、叶中均有表达,铜处理10 d时BcUBCE2基因的表达量最高.研究认为,BcUBCE2基因可能在铜胁迫响应中发挥重要作用.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2014(034)001【总页数】6页(P60-65)【关键词】小白菜;泛素结合酶E2;RACE;铜胁迫【作者】赵瑞丽;钟凤林;林义章;高世超;林俊芳;杨碧云;胡海非【作者单位】福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002;福建农林大学园艺学院,福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786泛素－蛋白酶体途径（ubiquitin－proteasome pathway，UPP）广泛存在于真核生物中，对蛋白质的降解具有高度选择性，它通过调节功能蛋白质的周转或降解不正常的蛋白实现对多种代谢过程的调节，在维持细胞功能以及周期运转，抵御环境胁迫，胚胎发育，激素响应和衰老等方面发挥着重要的作用［1－5］。
泛素结合酶 E2（ubiquitin conjugating enzyme E2）是UPP途径的关键作用酶之一，具有结合并转移泛素到靶蛋白的作用，决定泛素链长度、拓扑结构和蛋白泛素化效率［6］，对泛素化修饰的特异性和精确性起着关键作用［4－5］。
不结球白菜抗坏血酸合成相关基因的克隆与表达及BcPMI2的功能分析抗坏血酸(AsA),又称维生素C,是动植物体内维持生命所必需的一种物质。
植物的AsA含量由AsA合成和消耗的速率共同决定。
高等植物中AsA合成的主要途径是L-半乳糖途径,L-半乳糖途径包括8个典型的生理生化反应,也就对应着8个催化这些反应的酶,植物通过调节编码这些酶的基因的表达量改变细胞内这些酶的总活力,从而调节AsA的合成速率和AsA 的积累。
通过外界或人为地改变一些酶的活力同样可能影响到植物AsA的积累。
1.测量经过高pH值处理的植物样品提取液与未经过高pH值处理的提取液在245nm下吸光值的差值,可以计算植物样品提取液中的还原型AsA的浓度。
本研究针对该方法比较了不同的方法降解AsA的效果。
最后应用该方法测定不结球白菜样品的AsA含量,并与红菲罗啉法测定AsA 的结果进行比较,两种方法对于不同样品的AsA含量高低关系基本一致。
本方法加标回收率在90%以上,同品种的测定结果的标准偏差在2%-12%之间。
2.本研究在贮藏过程中采用二氧化碳气体(CO2)处理采后不结球白菜,减缓了AsA含量的下降。
同时发现其他活性物质,包括可溶性蛋白和叶绿素的损失都可被CO2抑制；CO2处理可抑制过氧化氢清除酶系统中的过氧化氢酶(CAT),抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)活力的升高,说明高浓度CO2可以降低植物衰老过程中活性氧胁迫的影响,从而减少AsA等活性物质的消耗。
50%和100%的CO2处理都可延缓采后不结球白菜贮藏过程中AsA含量的下降,而前者的处理效果要优于后者。
在室温下(25℃)CO2处理对AsA的保持效果较明显,4℃下CO2处理的效果没有明显优于空气处理；在CO2处理的条件下,不同温度处理对AsA的改变也不明显。
3.L-半乳糖途径各个基因的表达量对AsA积累有决定性的作用。
本研究克隆了7个L-半乳糖途径的相关基因,采用实时定量PCR的手段分析了L-半乳糖途径的各个基因在AsA含量不同的品种中的表达差异。
白菜BcMAF2基因克隆及功能验证吴小婷;邵帅旭;任海波;李林;侯喜林;刘同坤【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2018(038)009【摘要】为了揭示白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)开花调控转录因子(MADS AFFECTING FLOWERING 2)MAF2在开花过程中的作用,该研究通过同源克隆的方法获得BcMAF2基因的全长序列.结果表明:(1) BcMAF2基因含有1个长度为588 bp开放阅读框,编码196个氨基酸;将BcMAF2蛋白氨基酸序列与其他物种MAF2氨基酸比较表明,BcMAF2基因与其他物种中该基因具有高度保守的结构域.(2)将BcMAF2与YFP和HA标签融合,构建亚细胞定位载体pEarleyGate1 01-BcMAF2-YFP-HA,采用农杆菌介导法将其瞬时表达于本氏烟草(Nicotiana tabacum)叶片中,激光共聚焦显微镜观察发现BcMAF2蛋白定位于细胞核中,表明Bc-MAF2符合作为转录因子的功能.(3)将BcMAF2基因遗传转化拟南芥中进行功能验证,通过蛋白印迹试验获得5个过表达株系,且在选取的蛋白表达量较高的第8、10株拟南芥中均表现出明显延迟其抽薹开花表型.研究推测BcMAF2基因可能参与植物开花的春化途径.【总页数】7页(P1571-1577)【作者】吴小婷;邵帅旭;任海波;李林;侯喜林;刘同坤【作者单位】南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095;南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,南京210095【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786【相关文献】1.白菜上皮硫特异蛋白基因克隆与功能验证 [J], 孙海燕;袁高峰;汪俏梅2.白菜型油菜CBF基因克隆及功能分析 [J], 张腾国;聂亭亭;陈琼琼;毛玉珊3.坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证 [J], 林键章;王文磊;徐燕;许凯;纪德华;陈昌生;谢潮添4.小麦TaAAC基因克隆及功能的初步验证 [J], 高宏欢;刘素君;姚永伟;冯健超;杜晨阳;谢迎新;王晨阳;卢红芳;马冬云5.长叶红砂RtVAMP2-2基因克隆及功能验证 [J], 张健;王彩霞;王迎春;郑琳琳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略精编Document number：WTT-LKK-GBB-08921-EIGG-22986在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军侯云德（病毒基因工程国家重点实验室 100052 北京）本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。
大肠杆菌具有两个显着特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。
尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。
这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA 的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。
但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。
大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。
另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。
如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。
国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体[4]，并在此基础上成功表达了一系列细胞因子的基因[5，6，7]。
我们在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行全面的总结，以期有助于我国在这方面的研究。
有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
表达载体的基本结构如图1所示[8]。
RBSPR -35 -10 SD codingsequence TT Tet Ori-35 -10Stop codonTTGACA(N)17TATAAT UAAUUGAUAGStart codonmRNA 5' UAAGGAGG(N)8 AUG(91%)16S rRNA 3'HO AUUCCUCC GUG(8%)UUG(1%)启动子(以杂和的tac启动子为例)位于核糖体结合位点（RBS）上游10-100bp处，由调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿主染色体上。
白菜雄性不育相关新基因BcMF1的克隆和功能验证的开题
报告
一、选题背景和意义
随着工业化进程的不断加速和城市化程度的提高，我国的农业生产面临越来越多的问题，其中包括耕地的减少、水资源的浪费和化肥农药的过度使用等，使得传统的
农业生产方式难以满足现代化的需求。
而作为经济作物中非常重要的一种蔬菜，白菜
的栽培也需要应用高科技手段来提高生产效率和品质，在此过程中，遴选和培育新品
种就显得尤为重要。
因此，对于白菜中的基因进行研究和探究，不仅能够对白菜的品
质和产量进行提高，还可以为其他经济作物的研究提供一定的参考。
二、研究内容
白菜中的雄性不育基因是我们研究重点，本次研究将克隆白菜中的BcMF1基因，对该基因进行功能验证，并探究该基因在雄性不育过程中的作用机理。
三、研究流程
1.设计引物，克隆BcMF1基因
2.构建表达载体，转化大肠杆菌
3.提取重组蛋白并进行纯化，体外酶活性测试
4.构建植物表达载体，转化白菜进行功能验证
5.通过基因组学和转录组学手段研究BcMF1基因在雄性不育中的作用机理
四、预期成果
1.成功克隆白菜雄性不育相关新基因BcMF1
2.对该基因在雄性不育过程中的作用机理进行探究，为白菜的遴选和培育提供参考依据。
苏云杆菌抗虫白菜用到的表达载体载体构建一、引言苏云杆菌是一种常见的土壤细菌，具有较高的生物安全性和表达效率，因此被广泛应用于农业、医药等领域。
在农业中，苏云杆菌被用作一种重要的生物农药，能够有效防治蔬菜等农作物的害虫。
本文将介绍以苏云杆菌为基础的抗虫白菜的表达载体的构建过程。
二、表达载体的选择在构建抗虫白菜的表达载体时，需要选择适合的载体来实现目标基因的高效表达。
常用的表达载体包括质粒、病毒和细菌等。
苏云杆菌抗虫白菜通常采用质粒作为表达载体，因其构建简单、操作方便，并具有高效表达的特点。
三、载体构建步骤1. 购买或制备质粒：选择合适的质粒作为表达载体，可以购买商业提供的质粒，也可以通过基因克隆技术自行制备。
2. 质粒线性化：将质粒进行酶切，得到线性化的质粒。
3. 目标基因的插入：将目标基因通过限制性酶切与线性化的质粒连接，形成重组质粒。
4. 转化苏云杆菌：将重组质粒转化到苏云杆菌中，通过培养和筛选得到含有目标基因的苏云杆菌。
5. 验证表达：通过PCR、Western blot等方法验证目标基因在苏云杆菌中的表达情况。
6. 提取表达产物：将表达的目标基因产物从苏云杆菌中提取出来，用于后续的实验或应用。
四、常用的表达载体1. pBV220质粒：pBV220是一种常用的质粒载体，具有高拷贝数和广谱抗性，适用于苏云杆菌的表达。
2. pET系统：pET系统是一种常用的原核表达系统，适用于大规模表达和纯化重组蛋白。
3. pUC18质粒：pUC18质粒是一种小型质粒载体，适用于小片段DNA的克隆和表达。
4. pQE30质粒：pQE30质粒是一种用于大肠杆菌表达的质粒载体，适用于表达具有组氨酸标签的重组蛋白。
五、结论以苏云杆菌为基础的抗虫白菜是一种有效的农作物防治措施。
在构建抗虫白菜的过程中，选择合适的表达载体是至关重要的。
本文介绍了以质粒为基础的表达载体的构建步骤，并介绍了常用的表达载体。
希望本文对苏云杆菌抗虫白菜的研究和应用提供参考和帮助。
栽培技朮Vegetables 2020.8应及时疏沟排水。
如遇干旱，可在傍晚进行浇 水，但次数不宜过多。
3.5.3 控苗在薯秧封行后，每667 m2用15%多效唑70 g，对水60 kg喷施，以抑制叶片生长，促进结薯。
3.5.4 除草为防后期杂草滋生，需在早期封行前，进行 人工除草。
3.6防治病害马铃薯主要病害有晚疫病、早疫病、疮痂 病、青枯病、黑胫病和环腐病等，虫害主要有小 地老虎、金针虫等。
在单季茭白一马铃薯水旱轮 作模式下，春播马铃薯病虫害一般较少发生，可喷施80%代森锰锌可湿性粉剂800倍液，或25%甲霜灵•烯酰吗啉可湿性粉剂1〇〇〇倍液进行病害预 防，重点要做好种薯筛选和消毒工作。
3.7采收4月下旬，待马铃薯大多数叶片变黄时，开始收获。
马铃薯覆盖秸秆栽培模式下，采收十分 方便，只需拨开茭白秸秆捡收即可。
采收后及时 出售，来不及出售的马铃薯需放在通风避光处，以防止马铃薯变绿，影响商品性。
参考文献[I I杨新琴,徐云焕.山地蔬菜生产必读[M].北京:中国农业出版社,2015.[2]马雅敏，王来亮，邓曹仁，等.茭白一芥菜轮作栽培技术[J】.长江蔬菜，2017(18):118-119.[3J俞晓平，陈建明.茭白髙效安全生产大全[M].北京:中国 农业出版社，2007.[4|何建清.丽水农作制度创新与实践[Ml.北京:中国农业 出版社，2〇1〇.國西北农林科技大学科研团队解析紫心大白菜花青素合成的分子机制7月1日，《Horticulture Research》在线发表了西北农林科技大学张鲁刚教授团队题为The novel gene BrMYB2,located on chromosome A07, with a short intron1controls the purple-head trait of Chinese cabbage(Brassica rapa L.)的研究论文。
该论文以团队自主创制的紫心大白菜新种质为材料，基于前期对其花青素的积累特性、连锁分析等相 关研究，采用精细定位、图位克隆等方法首次将控制紫心大白菜花青素合成和积累的显性关键基因•定 位在A07染色体47.91 KB区间，在定位区间确定一个编码R2R3-MYB型的调节因子为候选基因，并命名为 BrMYB2。
大白菜BrCOX11基因的克隆及表达分析魏小春;原玉香;赵艳艳;王志勇;杨双娟;郑小兰;段俊枝;张晓伟【摘要】为了研究大白菜中细胞色素C氧化酶的功能,以雄性不育系及保持系、抗感根肿病DH系为材料,在对大白菜BrCOX11基因克隆的基础上,利用生物学软件对其编码蛋白进行分析和构建进化树.结果显示,大白菜BrCOX11基因编码区大小为861 bp,所编码的氨基酸序列与NCBI收录的COX11氨基酸序列相似性非常高,属于COX家族;分子进化树分析表明,大白菜BrCOX11与芸薹属、拟南芥属及萝卜属亲缘关系最近,而与棉花属、胡萝卜属和黄瓜属等亲缘关系较远;大白菜BrCOX11蛋白是亲水性蛋白.通过分析BrCOX11基因表达发现,BrCOX11基因的表达量和大白菜的生长时期有关系,在果荚中表达量最高;在根肿菌侵染后的根部组织中表达上调,而在根肿菌侵染后的叶片组织中表达下调;在保持系中的表达量明显高于不育系.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2018(047)009【总页数】6页(P93-98)【关键词】大白菜;BrCOX11基因;克隆;表达分析【作者】魏小春;原玉香;赵艳艳;王志勇;杨双娟;郑小兰;段俊枝;张晓伟【作者单位】河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院农业经济与信息研究所,河南郑州 450002;河南省农业科学院园艺研究所,河南郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】S643.1细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，COX)也称细胞色素氧化酶，能够以氧化磷酸化的方式为细胞供能。
[收稿日期]20060626 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30370975);浙江省重大科技项目(2005C12019-02) [第一作者简介]张 弢(5),女,黑龙江双鸭山市人,农学博士,主要从事植物分子生物学研究 [通讯作者]曹家树,博士,教授,博士生导师白菜BcM F 2基因在大肠杆菌中的高效表达 张 弢 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;莱阳农学院生命科学学院,山东青岛266109) 刘乐承 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025) 曹家树 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029)[摘要]通过PCR 方法扩增BcMF2cDNA 完整的编码区序列,构建p ET 2BcM F2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IP TG 诱导融合蛋白高效表达;SDS 2PA GE 电泳检测发现在70kD 处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IP TG 终浓度为0.4～1.0mmol L -1时诱导6h ,均能获得较高的表达量。
[关键词]白菜(B r assica c ampestr is L.ssp.Chinensis Ma kino );多聚半乳糖醛酸酶;BcM F2;原核表达[中图分类号]Q786[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)03015303多聚半乳糖醛酸酶(polygalact urona se ,P G )基因参与植物发育的许多阶段,在果实、叶和花脱落以及花粉发育中起着重要作用。
目前,许多植物中的P G 基因得到了克隆,其中包括与花粉发育相关的P G 基因如玉米花粉中PG (X 57627)[1]、油菜花粉中大量表达的P G 基因(L19879)[2]、烟草花粉特异的N p g 1(X71020)[3]、苜蓿花粉中特异表达的P G 基因P 73(U20431)[4]等等。
花粉发育相关基因的克隆和分析有助于通过反义技术等阻断与花粉发育有关基因的表达从而获得雄性不育植株。
利用cDNA 2A FL P 技术结合RAC E 技术,王永勤[5]从‘矮脚黄’白菜(B rassica ca mp est ris L.ssp.Ch i nensis Maki no )核雄性不育两用系中成功分离了1个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcM F 2。
为进一步研究BcM F 2基因结构及其所编码蛋白的功能,本研究在前期工作基础上,对BcM F 2基因的原核表达进行了初步研究,成功构建了该基因的原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中高效表达,并且对其表达条件进行了优化,为进一步研究该基因结构及其所编码蛋白的功能奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料与试剂大肠杆菌DH 5α、BL21(DE3)和原核表达载体p ET 232a (+)由浙江大学蔬菜研究所保存提供,含Bc 2M F 2全长cDNA 克隆载体p GEM 2BcM F 2由笔者构建,p GEM 2T easy 连接试剂盒购于Promega 公司,限制性内切酶、琼脂糖、SDS 2PA GE 低分子量标准蛋白质购自上海生物工程技术服务有限公司,Taq pl us DNA 聚合酶购于北京鼎国生物技术有限公司。
1.2 BcM F 2基因原核表达载体的构建(1)PCR 扩增用于原核表达的BcM F 2最大开放阅读框序列 根据已获得的BcM F 2cDN A 全长序列重新设计1对引物,5’端引物引入Ba m H I 酶切位点,添加3个保护碱基GAA ,3’端引物引入X ho I 酶切位点,添加3个保护碱基GC G 。
以p GEM 2B cM F 2质粒DNA 为模板,扩增包括完整编码区的目的基因。
引物序列为:YH P1:5’G AA GGA TCC A T G G C T A GC G CA A G A A G 3’(下划线部分为B am H I 酶切位点),YH P2:5’GC G C TC G A G A G C TTA T TT GGG ACA CA G 3’(下划线部分为X ho I 酶切位点)。
351长江大学学报(自科版) 2006年9月第3卷第3期农学卷Journal o f Yangtze U niver sity(N a t Sci Edit) Sep 12006,Vol 13No 13Agri Sci V 197..PCR 扩增[6]产物为1266bp 。
将PC R 产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定回收后,克隆到p GEM 2T ea sy 载体上,此重组质粒命名为p GEM 2OR F 。
(2)融合基因表达载体的构建 用B am H I 和Xh o I 从p GEM 2OR F 上双酶切切下BcM F 2基因片段,同样用Ba m H I 和Xho I 双酶切原核表达载体p E T 232a (+),连接,热击转化大肠杆菌D H 5α,铺于含IP TG/X 2gal/A mp 的LB 平板。
在平板上挑单菌落,碱法提质粒,酶切验证。
重组表达质粒命名为p ET 2BcM F 2,上海博亚公司对其中插入DNA 片段进行测序验证其读码框是否发生移位。
1.3 在大肠杆菌B L21中诱导BcM F 2基因的高效表达将测序验证其读码框正确的重组质粒转化到表达菌株BL21中,转化体铺于含Amp (75μg mL -1)的LB 平板上,于37℃过夜培养。
挑1～2个重组菌落,接入2mL 含Amp (75μg mL -1)的LB 液体培养基中,37℃培养过夜。
按1∶100的比例,取100μL 过夜培养物接入10mL 含Amp (75μg mL -1)的LB 液体培养基中,37℃振荡培养2h 以上,至D 600为0.5～0.6。
取出1mL 未经诱导的培养物作为阴性对照,在剩余培养物中加入IP T G 至终浓度为1mmolL -1,在30℃继续培养诱导4h ,离心收菌。
BcM F 2基因原核表达实验参照p ET 原核表达手册(MERC K 公司)进行。
1.4 不同浓度IPTG 诱导pET 2BcM F 2的表达将含有p ET 2BcM F 2质粒的BL21大肠杆菌培养至D 600约为0.5～0.6时,加入IPT G 30℃诱导4h 。
IP TG 终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mmol L -1进行诱导。
1.5 不同诱导时间下pET 2BcM F 2的表达将含有p ET 2BcM F 2质粒的BL21大肠杆菌培养至D 600约为0.5～0.6时,加入IP TG 诱导,诱导时间为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0h 。
1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物配制5%浓缩胶和12%分离胶。
取1mL 诱导产物于微量离心管中,室温高速离心1mi n 。
沉淀悬于100μL 2倍样品缓冲液[10%SDS 2mL 、β-巯基乙醇0.5mL 、蔗糖4g 、溴酚兰2mg 、0.05mol L -1Tris 2HCl (p H 8.0)2mL ,ddH 2O 加至总体积10mL ],沸水浴变性5mi n 后进行电泳,采用稳压的方式电泳。
当样品在浓缩胶中时,采用70V 电压,以利于样品的浓缩,当样品进入分离胶后,将电压升至100V 。
电泳结束后考马斯亮兰染色2～3h ,染色结束后,将凝胶置于脱色液中脱色,至蓝色背景消失为止[7]。
观察目的蛋白条带,以标准蛋白质比较确定目的条带的位置。
2 结果与分析M :100bp Ladder 标准分子量;1:BcMF2用于原核表达的基因片段图1 目的片段PCR 扩增结果igure 1 PCR A mpli fication result o f cD N A q y x M :100bp Ladder 标准分子量; 1:p E T 2BcM F2重组质粒酶切结果 图2 p ET 2BcM F2双酶切验证 Figur e 2 Dige ste d con firmation f T 2B MF 2.1 用于原核表达的目的片段的PCR扩增和克隆根据已获得的BcM F 2cDNA 序列重新设计一对引物,上游引入Bam H I 酶切位点,下游引入Xho I 酶切位点,以Bc 2M F 2基因的双链cDNA 为模板PCR 扩增得到1条1266bp 的特异片段(图1),与实际大小相符。
将目的基因克隆到p GEM 2T easy 载体上,B am H I 和Xho I 双酶切验证,阳性克隆命名为pGEM 2ORF 。
2.2 原核表达载体的构建B am H I 和Xh o I 双酶切p GEM 2O RF 和p ET 232a (+)后,连接、转化、筛选阳性克隆,然后酶切验证,酶切得到的目的片段与实际大小相符(图),命名为451 长江大学学报(自科版)2006年9月se uence used a s prokar otic e p ress io no p E c 22p ET 2B cM F 2。
同时将经酶切验证的阳性克隆送博亚生物技术公司测序验证,结果证实目的基因正确插入表达载体的阅读框中。
2.3 BcM F 2基因在大肠杆菌B L21中的高效表达将重组质粒pE T 2BcM F 2转入大肠杆菌BL 21中,在含Amp 的LB 新鲜培养基中加入IP T G ,在30℃条件下诱导BcM F 2基因融合蛋白的高效表达,表达的SDS 2PA GE 电泳图谱如图3、图4所示。
结果显示,在70kD 处有一条蛋白质特异条带,这一大小约相当于插入基因编码的蛋白(大约43.9kD )与载体上的谷胱甘肽巯基转移酶(26kD)之和,与预期的目的产物蛋白带大小一致,在空载体中没有出现相同的条带。
通过对诱导条件的优化发现在30℃下,IP T G 终浓度在0.4～1.0m molL -1之间诱导6h ,均能获得较高的表达量,在诱导6h 之后,表达量开始下降。
1:低分子量标准蛋白质;2:pET32a (+)的诱导表达;3～8:不同浓度诱导IPT G 诱导pET 2BcM F 2在BL21中的表达(IPT G 浓度依次为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol L -1)图3 不同浓度IP TG 诱导pET 2BcM F2表达的SDS 2PA GE 电泳图谱Figure 3 SDS 2PAG E an alysis for expre ssion of pE T 2BcMF2fusion protein in d iffere n t con ce n trations of IPTG 1:低分子量标准蛋白质;2:p ET 32a (+)的诱 导表达;3～8:不同时间诱导p E T 2BcMF2的 表达(诱导时间依次为1、2、4、6、8、10h)图4 p ET 2Bc MF2在不同诱导时间下的表达SDS 2PAGE 电泳图F igure 4 SDS 2PAG E analys is for ex pression of pET 2cMF2fusion protein at d iffe re n t indu ction time s3 讨论本试验首次对白菜多聚半乳糖醛酸酶基因BcM F 2的原核表达进行了初步研究,并对其在大肠杆菌中的最佳诱导条件进行了探索,结果显示本试验构建的表达质粒试p ET 2BcM F 2阅读框结构正确,未出现移码和突变,pE T 2BcM F 2在IP T G 诱导下能够稳定高效表达融合的P G 蛋白。
