真核基因在大肠杆菌中表达

物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
蛋白酶的降解：表达的真核蛋白质被细菌的蛋 白酶识别并降解。
真核基因在大肠杆菌中表达
解决方案
✓ 从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转录 合成cDNA，并连接到载体上，以克服内含子问题。
✓ 如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大， 可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸 片断。
✓ 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。 ✓ 对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
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真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达 载体。
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这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所 有的Lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的β-半乳 糖苷酶基因解抑制。
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 真核基因在大肠杆菌中的表达 影响真核基因表达效率的因素
真核基因在大肠杆菌中表达
第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系
真核基因在大肠杆菌中表达
1. 大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标
制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的 表达系统
2. 常用的大肠杆菌表达载体
➢ Lac启动子的表达载体 ➢ T7启动子的表达载体
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➢ Lac启动子的表达载体
乳糖操纵子结构模型 真核基因在大肠杆菌中表达
lac操纵子受lac阻遏物的负调节。 培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时， lac阻遏物同
操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。 培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻
真核生物启动子的结构
-25 区
转录起始位点
5' NNNNNNNNNNNNNNNNNTATAAANNNNNNNNNNNNNNNNANNNN 3'
TA真T核AT基A因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达真核基因的劣势
蛋白质产物的后修饰：许多真核基因的蛋白质 产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基 化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋 白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是 不可溶的，常形成包涵体，无活性。
行批量生产。
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达真核基因的劣势
真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续 性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对preRNA进行加工剪接的能力。
mRNA分子结构的差异：真核基因mRNA 5’-端有 帽子结构，3’-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及 与细菌核糖体结合的能力。
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启动子
核糖体结合位点
转录终止子
复制 起点
Hale Waihona Puke Baidu
大肠杆菌表达载体的基本结构特征 真核基因在大肠杆菌中表达
1. 表达载体的基本成分
启动子（P）：影响外源基因的表达水平
使外源基因高水平表达必须具备的条件： ✓ 强启动子 ✓ 启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源
蛋白可能对寄主细胞不利。 ✓ 诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导
遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。 因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基 因的表达。
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Lac操纵子的控制区，包括核糖体结合区、RNA聚合酶 结合区及阻遏物结合区都位于长203 bp的HaeIII片断上。
203 bp的HaeIII片断含有Lac启动子、操纵单元及β-半乳 糖苷酶的前8个密码子。
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大肠杆菌表达真核基因的劣势
转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具
备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的
RNA聚合酶不能识别真核启动子。
原核生物启动子的结构
-35 区
-10 区
转录起始位点
5' NNNNNTTGACANNNNNNNNNNNNNNNNNTATATTNNNNNNANNNN 3'
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
变的方法消除。
真核基因在大肠杆菌中表达
2. 克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：能够进行正常的转录和翻译
转录：真核基因置于原核启动子的下游 3’-末端具有转录终止子
翻译： mRNA分子具有RBS（ribosome binding site）
包括AUG或GUG和与16S rRNA 3’-末端 互补的SD（Shine-Dalgarno）序列。
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另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能 维持正常的稳定性
✓ 表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。 ✓ 蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。 ✓ 蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。 ✓ 大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分
子伴侣。
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第二节 大肠杆菌的表达载体
增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
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