外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤

实验目的1.了解外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达情况2.学会用SDS-PAGE电泳法分离不同分子量的蛋白质3.学习通过亲和层析法纯化目的蛋白4.学会考马斯亮蓝染色法和蛋白质杂交法检测蛋白质实验原理1.外源基因在大肠杆菌细胞中的诱导表达：将外源基因克隆在特殊的表达载体中，让其在E. coli中表达，该表达载体上含有lac操作子的启动子。

在不加诱导剂的条件下培养宿主菌，lacI基因表达的阻遏蛋白LacI与lac操作子结合，使外源基因不能表达；向培养基中加入诱导物IPTG后，LacI阻遏蛋白变构失活，不能与lac操作子结合，外源基因就表达。

2.蛋白质SDS-PAGE电泳分离：SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

其分离原理是根据蛋白质分子量的差异，因为SDS-PAGE的样品处理液及缓冲液的加入破坏了蛋白质的二级、三级、四级等结构，并使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物，稳定地存在于均一的溶液中，SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，远远超过其原来所带的电荷，从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计，消除了不同分子之间原有的电荷差别，其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。

3.考马斯亮蓝法检测蛋白质：考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基或芳香族氨基酸残基（Arg，Trp，Tyr，His，Phe）结合。

考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；因为考马斯亮蓝R250中的R代表Red，偏红，红蓝色，与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为蓝色，且与胶的结合可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

4.基因融合就是将两个或多个开放读码框按一定顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白。

SDS-PAGE分离蛋白原理
组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离 而带Байду номын сангаас，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的 性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加 速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的 作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中 受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状 结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电 荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不 同，可将不同的蛋白质进行分离。
进 入 夏 天 ，少 不了一 个热字 当头， 电扇空 调陆续 登场， 每逢此 时，总 会想起 那 一 把 蒲 扇 。蒲扇 ，是记 忆中的 农村， 夏季经 常用的 一件物 品。 记 忆 中 的故 乡 ， 每 逢 进 入夏天 ，集市 上最常 见的便 是蒲扇 、凉席 ，不论 男女老 少，个 个手持 一 把 ， 忽 闪 忽闪个 不停， 嘴里叨 叨着“ 怎么这 么热” ，于是 三五成 群，聚 在大树 下 ， 或 站 着 ，或随 即坐在 石头上 ，手持 那把扇 子，边 唠嗑边 乘凉。 孩子们 却在周 围 跑 跑 跳 跳 ，热得 满头大 汗，不 时听到 “强子 ，别跑 了，快 来我给 你扇扇 ”。孩 子 们 才 不 听 这一套 ，跑个 没完， 直到累 气喘吁 吁，这 才一跑 一踮地 围过了 ，这时 母 亲总是 ，好似 生气的 样子， 边扇边 训，“ 你看热 的，跑 什么？ ”此时 这把蒲 扇， 是 那 么 凉 快 ，那么 的温馨 幸福， 有母亲 的味道 ！ 蒲 扇 是 中 国传 统工艺 品，在 我 国 已 有 三 千年多 年的历 史。取 材于棕 榈树， 制作简 单，方 便携带 ，且蒲 扇的表 面 光 滑 ， 因 而，古 人常会 在上面 作画。 古有棕 扇、葵 扇、蒲 扇、蕉 扇诸名 ，实即 今 日 的 蒲 扇 ，江浙 称之为 芭蕉扇 。六七 十年代 ，人们 最常用 的就是 这种， 似圆非 圆 ， 轻 巧 又 便宜的 蒲扇。 蒲 扇 流 传 至今， 我的记 忆中， 它跨越 了半个 世纪， 也 走 过 了 我 们的半 个人生 的轨迹 ，携带 着特有 的念想 ，一年 年，一 天天， 流向长

每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其分于量，这样的标难曲线 只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才 具有可靠性
注意的问题
蛋白质电泳
常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质
非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
6.上样： （1）marker 5µl
（2）细胞样品10 µl + 2×上样buffer 10µl 共 20µl
100℃沸水浴，3-5min ？（蛋白变性）
7. 微量注射器（加样器）上样, 上样量 15µl *微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可 过高, 样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电 流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA （180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法
•
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰 胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因 素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的 十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁 移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
* 胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好 浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速 插入梳子,静臵到胶凝

实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。

2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。

【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。

常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。

原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。

本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。

（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。

（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。

因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。

原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。

而在真核基因上则缺乏该序列。

因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。

原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。

因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。

原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。

如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。

外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。

包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。

但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。

（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。

根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。

目的基因在大‎肠杆菌中的诱‎导表达一般程序如下‎：获得目的基因‎－准备表达载体‎－将目的基因插‎入表达载体中‎（测序验证）－转化表达宿主‎菌－诱导靶蛋白的‎表达－表达蛋白的分‎析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于‎100ml ddH2O 中‎,0.22μm滤膜‎抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方‎法获得目的基‎因：以含目的基因‎的克隆质粒为‎模板，按基因序列设‎计一对引物（在上游和下游‎引物分别引入‎不同的酶切位‎点，本实验中为B‎a mHⅠ和Hiind‎Ⅲ），PCR循环获‎得所需基因片‎段。

PCR反应体‎系为：模板（含R基因的重‎组质粒）1μl上游引物PR‎11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer‎（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补‎至100μlPCR反应条‎件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40se‎c、72℃延伸1min‎，30个循环；最后72℃延伸8min‎。

2、构建重组表达‎载体（1）载体酶切：将表达质粒p‎R SETA用‎限制性内切酶‎（同引物的酶切‎位点）进行双酶切，酶切产物行琼‎脂糖电泳后，用凝胶回收K‎i t或冻融法‎回收载体大片‎段。

（2）R基因PCR‎产物双酶切后‎回收，在T4 DNA连接酶‎作用下连接入‎载体。

连接反应体系‎为：pRSETA‎1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶‎（5U/μl）1μl5×buffer‎2μlddH2O补‎至10μl3、获得含重组表‎达质粒的表达‎菌种（1）将连接产物转‎化大肠杆菌D‎H5α，根据重组载体‎的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量‎抽提质粒，双酶切初步鉴‎定。

（2）测序验证目的‎基因的插入方‎向及阅读框架‎均正确,进入下步操作‎。

实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。

2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。

3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。

4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。

5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。

6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。

7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。

8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。

实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。

2、将管放到42C保温90s,冰浴2。

3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。

4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。

5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。

二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。

2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。

3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。

4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。

（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。

6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。

7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。

8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。

9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。

态细胞 ③ 培养带有重组表达载体的大肠杆菌 ④ 诱导重组蛋白质表达
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
4. 鉴定目的基因表达产物 ① 抗体鉴定 ② 生物活性鉴定 ③ 序列测定
载体，通过感染或转染进入宿主细胞表达目 的蛋白。 • 优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复 杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表 达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的哺乳动物蛋白质分子。 • 缺点：表达效率通常不高。
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体 • 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入
Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA
1931 -
质粒的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
Werner Arber
Biozentrum der Universität Switzerland 1929 -
Daniel Nathans
Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA
1928 - 1999
Hamilton O. Smith
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体（质粒） ① 制备感受态大肠杆菌 ② 将质粒DNA转化感受态大肠杆菌 ③ 提取质粒DNA ④ 质粒DNA定量
利用大肠杆菌进行外源基因表 达的过程
1. 构建表达载体 ⑤ 扩增目的基因 • PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，

裂解循环还是溶源循环。
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
T7 表达系统
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。

分子生物学实验技术三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达实验安排：每组做一份（5人/组）。

操作步骤：1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5 mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。

3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3 h。

4、分别取菌液1 mL于1.5 mL Ep管中，12000⨯g离心30 s，收获菌体。

5、用100 μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100 µL 2⨯SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5 min。

6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。

注意事项：1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：将IPTG以不同浓度（0.2-2.0 mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。

2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6 h，其间每隔1 h（在第1、2、3、4、5、6 h）分别取菌液1 mL，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。

（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验安排：示范性操作。

实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。

[主要试剂]1、LB培养基。

2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）： IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。

[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。

PCR反应体系为：。

PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。

2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。

连接反应体系为：#3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。

否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。

4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。

2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。

3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。

备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶， 将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约30~40min后凝聚。 将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。 （2）凝胶电泳 取80 ml 电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电 泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒 压20分钟，120V恒压2小时 （3）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.5~1 小时；之后，在脱色 液中脱色1小时，观察目的蛋白表达情况。
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酵母表达系统

酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快， 易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点 外，又具有对表达的蛋白质进行正确加工， 修饰，合理的空间折叠等真核生物的功能， 非常有利于真核基因的表达，能有效克服大 肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不 足。
蛋白表达系统

大肠杆菌表达系统是目前研究最成熟的基因工程表达系统， 当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的， 突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。 然而，大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达 调控机制和蛋白质的加工修饰能力：许多蛋白质在翻译后， 需经过翻译后的修饰加工（如磷酸化、糖基化、酰胺化及 蛋白酶水解等）过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少 上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外， 蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结 构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠， 是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯 化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需 要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时 增加了成本。

【实验器材】
空气恒温振荡器，三角烧瓶，电泳仪，垂直电泳槽，微量移液
器（20uL, 200 uL 1000uL），EP管，凝胶成像系统等。 【实验材料】 重组大肠杆菌，IPTG（在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用
0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃
思考题：
1、用IPTG诱导表达的时间是否越长越好？为什么？ 2、如果发现诱导后目标蛋白没有表达应该采取什 么措施？
（2）用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体；室温放置lh ；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ；用HCI 调至pH 8 . 0 ，在室温放置至少30 min ; 1000g 离 心，15 min ，室温；吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉 淀；取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，与20 μL 重新溶解的沉淀进 行SDS-PAGE 。
。），5x蛋白加样缓冲液、
无菌水等。 【实验内容】
1．外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
2．最佳蛋白收获时间的确定等
三、实验方案
1. 接入含AMP（50ng/mL）的50ml的LB培养基里，置入摇床中 震荡培养，待OD600值达到0.8后，加入500μl的IPTG（ 24mg/mL）溶液，混匀后，先取出0.5ml菌液，标记为t0。再 将菌液置入恒温摇床37℃震荡陪养，每隔半小时分别取出菌 液0.5ml。本实验一共连续诱导大肠杆菌表达目的基因的蛋白 2.5个小时。 2. 样品取出后均需13000转/分钟离心2分钟，去上清，菌体沉淀 置于-20度冰箱，下节课待用。 3. 加入80ul的去离子水把菌体充分悬起后再加入20ul的5×SDS 上样缓冲液混合，在100℃水浴5分钟，离心12000转/分钟， 离心1min，取上清液，做好诱导时间标记。。

【实验器材】
空气恒温振荡器，三角烧瓶，电泳仪，垂直电泳槽，微量移液
器（20uL, 200 uL 1000uL），EP管，凝胶成像系统等。 【实验材料】 重组大肠杆菌，IPTG（在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用
0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃
思考题：
1、用IPTG诱导表达的时间是否越长越好？为什么？ 2、如果发现诱导后目标蛋白没有表达应该采取什 么措施？
IPTG诱导原理： E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因， 分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵 序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋 白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。 在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP） 结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的 调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物 的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状 态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序 列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖 存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体 系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳 糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏 蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细 菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
3、包涵体的分离 蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为 包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的 活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。 （1）试剂与配制 ① 洗涤液I：0.5 % Triton X -100,10 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 ) 溶于细胞裂解液中。 ② 2×凝胶电泳加样缓冲液。 （2）细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min , 4 ℃ ；弃上清，沉淀用9× 洗涤液l 悬浮；室温放置5 min ; 12 000g 离心15 min , 4 ℃ ；吸出上清，用100 μL 水重新 悬浮沉淀；分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲 液，进行SDS-PAGE 。 4、包涵体的溶解和复性 （1）试剂与配制 ① 缓冲液I： 1 mmol / L PMSF, 8mol /L 尿素, 10 mmol / L DTT 溶于前述裂解缓冲液中。 ② 缓冲液Ⅱ： 50 mmol / L KH2PO4, 1 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 ), 50 mmol / L NaCI 2 mmol / L 还原型谷胱甘肽, 1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽 ③ KOH 和HCI 。 ④ 2×凝胶电泳加样缓冲液。

XIAMEN UNIVERSITY
实验八：GFP在大肠杆菌中 的诱导表达和检测
宋 刚
2188275 gangsongsd@
厦门大学抗癌研究中心
一．实验目的

掌握外源基因在原核细胞中表达的特点 和方法。 复习SDS-PAGE的制备及其分离原理。

二．原核表达的一般流程
获得目的基因
——用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材 料昂贵；
——有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种 特性的质粒可供选择。 ——但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和 糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达 蛋白的生物学活性及构象。
原核表达载体：
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载
五．注意事项


1．含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培 养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导 表达。 2．表达菌生长至OD600值0.6左右为诱导适合条件， 避免菌生长过浓。 3．配制SDS胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中， 并待其充分凝固后使用。
思考题
1．原核表达目的蛋白的基本原理是什么？ 2．SDS-PAGE电泳的原理是什么？


SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇
的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子 的二级和三级结构。

强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四 级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。 解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。

将外源基因克隆在含有lac启动子的pET-30a表达载体（如图 1）中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，lacI产生 的阻遏蛋白与lacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的 转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入

实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测（12学时，9小时）Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、实验目的：通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

二、实验原理：将外援基因克隆在含有T7启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。

先让宿主菌生长，lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。

然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTC（异丙基硫代-β-D-半乳糖）,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。

表达蛋白可经SDS-PAGE和（或）活性分析进行检测（本实验Ⅱ、Ⅲ）或做蛋白印迹，用抗体识别表达蛋白。

三、仪器、材料和试剂四、实验步骤1.预培养：挑去一含pETBlue-2-AKP表达质粒的单菌落到3ml含50ug\ml Carb、34ug\mlCam 和1%葡萄糖的LB液体培养基中，37℃、190r\min振荡培养过夜。

2.将过夜培养的菌液1ml接种于100ml含50ug\mlCarb、34ug\mlCam和1%葡萄糖的TM 液体培养基中，37℃、250r\min振荡至A6000.6~0.8.3.向其中加入IPTG至终浓度为200ug\l，37℃培养4h。

4. 6000r\min离心10min，弃上清液。

5.收集菌体细胞沉淀，-20℃冻存。

（注：为了比较分析应做一个不含目的基因仅含载体的对照菌的表达）Ⅱ活性分析检测表达蛋白一、实验目的：通过本实验了解碱性磷酸酶的活性方法及如何通过活性来监测蛋白的诱导表达。

二、实验原理：磷酸酶能水解底物分子上的磷酸集团从而使底物分子脱磷酸化。

对硝基酚磷酸为含磷化合物，能被磷酸酶水解为对硝基酚和游离的磷酸集团。

对硝基酚磷酸在碱性条件下为无色化合物而对硝基酚则为黄色化合物，在410nm处有光吸收值，利用此反应的颜色变化可以测定磷酸酶的酶活性从而来检测碱性磷酸酶的诱导表达情况。

三、仪器、材料和试剂：四、实验步骤：1.向菌体细胞沉淀中加入15mL Buffer A,重悬菌体。

实验十八外源基因在大肠杆菌中的高效表达一、实验目的1. 掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。

2. 复习SDS-PAGE的制备及其分离原理。

二、实验原理一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。

此外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。

这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。

E.coli表达载体的基本结构见下图：1．有效的转录起始与基因的高效表达有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一。

最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。

对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac，trp，tac，phoA等，和组成型启动子如T7噬菌体启动子。

2．mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的mRNA分子提前终止。

衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞中其处于操纵子的启动子和第一个结构基因之间，为保证mRNA转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。

正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。

对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly A加入位点，使外源基因高效表达的重要因素。

3．有效的翻译起始与基因的高效表达在原核细胞中使翻译起始达到最大效率的一般原则：1) AUG(ATG)是最首选的起始密码子。

GUG、UUG、AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。

2) SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四个碱基。

外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。

【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)在E.coli BL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。

当培养基中存在IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。

(基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 )本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)。

pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwiniauredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I 位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。

crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35kDa。

【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.实验仪器细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装) 2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coli BL21(DE3)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coli BL21(DE3)，涂布在含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。