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1.3基因工程的应用基础巩固1转基因动物是指( )A.提供基因的动物B.基因组成中转入了外源基因的动物C.能产生白蛋白的动物D.能表达基因遗传信息的动物2若利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,其在环境保护上的重要意义是( )A.减少氮肥使用量,降低生产成本B.减少氮肥生产量,节约能源C.避免因施用氮肥过多引起的环境污染D.改良土壤的群落结构、海华水”,化引起淡水“赤洋,污染环境。
利用现象”“潮基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,可减少氮肥施用量,避免水体富营养化,保护环境。
3下列哪项不是植物基因工程技术的主要应用?( )A.提高农作物的抗逆性B.生产某些天然药物C.改良农作物的品质D.作器官移植的供体项为动物基因工程技术的重要应用。
4基因治疗是指( )A.把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的B.对有基因缺陷的细胞进行修复,从而使其恢复正常,达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法,使有基因缺陷的细胞发生基因突变后恢复正常D.运用基因工程技术,把有缺陷的基因切除,达到治疗疾病的目的疗,其基本方法都是把相应的正常基因导入有基因缺陷的相关细胞中,从而使病人恢复正常。
5科学家运用转基因技术,将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因转到大白菜细胞中,培育出抗虫效果很好的优质大白菜,减少了农药的使用量,保护了环境。
下列说法正确的是( )A.抗虫基因中含有终止密码子B.抗虫基因能在大白菜细胞中正常表达C.转基因技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体D.限制酶识别的序列一定是GAATTC于终止密码子存在,子mRN不同的限制酶识别的序A,上。
载体不是酶。
限制酶有多种列大都不相同。
6以下关于抗病转基因植物成功表达抗病毒基因后的说法,正确的是( )A.可以抵抗所有病毒B.对病毒的抗性具有局限性或特异性C.可以抵抗害虫D.可以稳定遗传,不会变异,毒并不是所有病,也不可以抗虫。
抗病毒基因也会发生变异。
毒7下列不属于利用基因工程技术制取药物的是( )A.从大肠杆菌体内获取白细胞介素B.从酵母菌体内获得干扰素C.利用青霉菌获取青霉素D.从大肠杆菌体内获得胰岛素等如大肠杆菌、酵母菌(胞)中并使,该基因得到高效表达以产生药物,然后通过培养微生物来获得药物的一种技术。
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
酵母菌表面展示载体构建及转化酵母菌表面展示系统是一种重要的生物学工具，可用于表面展示重要的蛋白质、肽段等分子，以扩大其在不同研究领域的应用。
酵母菌表面展示系统具有许多优势，如易于操作、高效表达、易于纯化等。
因此，构建和转化酵母菌表面展示载体是实施这种系统的关键步骤。
1. 酵母菌表面展示载体构建酵母菌表面展示载体通常由两个核心组成部分构成：酵母表面蛋白的扩大子和目标蛋白的插入序列。
以下是构建酵母菌表面展示载体的一般步骤：1.1 提取酵母菌基因组DNA：使用适当的方法从酵母菌中提取基因组DNA。
可以选择一种高质量的DNA提取试剂盒来确保DNA的纯度和完整性。
1.2 扩增酵母菌表面蛋白的扩大子：根据需要选择具体的表面蛋白扩大子，并使用聚合酶链式反应（PCR）扩增其序列。
需要使用具有相应限制性内切酶切位点的引物。
1.3 准备载体：选择合适的酵母菌表面展示载体，并使用同样的限制性内切酶切位点将其线性化。
线性化的载体将提供插入序列的位点。
1.4 进行反应与连接：将扩增的酵母菌表面蛋白扩大子与线性化的载体进行连接。
这一步可以在体外进行，使用DNA连接酶（例如T4 DNA连接酶）。
1.5 转化大肠杆菌：将连接好的载体导入大肠杆菌，并培养在含有适当抗生素的培养基上，以筛选带有目标载体的菌落。
1.6 纯化载体：从培养的重组大肠杆菌中提取目标载体，并使用DNA纯化试剂盒纯化。
2. 酵母菌表面展示载体转化转化是将目标载体导入酵母菌的过程。
以下是酵母菌表面展示载体转化的常见方法：2.1 胞壁酶处理酵母菌细胞：使用蛋白酶K等酶处理酵母菌细胞，使细胞壁变薄，提高载体的导入效率。
2.2 制备酵母菌细胞的质粒DNA：通过将酵母菌细胞进一步培养扩增，提取质粒DNA，并确保其质量和纯度。
2.3 酵母菌细胞的化学转化：通过将质粒DNA与聚乙二醇（PEG）或锌盐等化学物质一起处理酵母菌细胞，使质粒DNA进入细胞内。
2.4 酵母菌细胞的电转化：使用高压电脉冲将质粒DNA导入酵母菌细胞，通过瞬时破坏细胞壁和细胞膜，使DNA进入细胞。
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率摘要：对于基因工程，无论是在原核生物中，还是在真核生物中，外源基因的表达效率一直是人们关注的问题。
这篇综述简要的从启动子、质粒、mRNA转录本、密码子的偏好性、宿主选择、培养条件方面论述如何提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率。
关键词：真核基因大肠杆菌表达效率前言：基因工程越来越被广泛应用，人们可以利用基因工程获得高产,稳产和具有优良品质的农作物,培育出各种具有抗逆性的作物新品种。
利用基因技术还可以高效率的生产各种高质量，低成本的药品，如：胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。
通常要把目的基因导入大肠杆菌进行表达，因为大肠杆菌表达系统相对于其它，比如酵母细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统有一定的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机制有深刻的了解；拥有各类适用的寄主菌株和不同的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌中有效、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。
但也有缺点，比如说真核基因的转录信号同原核不同，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子，外源基因可能含有大肠杆菌终止子序列，表达产物音折叠错误或缺少翻译后修饰而没有生物活性，本身含有内毒素或毒性蛋白等。
所以真核基因在大肠杆菌中表达可能会遇到如下问题：●缺乏拼接机制：由于原核基因无内含子，目的基因表达后的mRNA内含子无法去除；●缺乏翻译、加工：不能对蛋白质进行糖基化、磷酸化等；●容易降解：细菌对外源蛋白有排斥作用。
正文：一、目标蛋白在大肠杆菌中表达首先要构建表达载体，表达载体包括以下几个部分：★复制起始位点★选择标记基因★启动子★核糖体结合位点★多克隆位点★转录终止序列用图表示即为：二、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有：●启动子●质粒●mRNA转录本●密码子的偏好性●宿主选择●培养条件（一）启动子在基因的表达调控中，转录的起始是个关键某个基因是否能正常的表达常常决定于特定启动子的起始过程，启动子是DNA分子与RNA聚合酶相结合的部位，是转录的基本信号。
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
原核体系中表达真核基因的困难1.细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；2.真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；3.真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。
四、构建表达载体的策略⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。
⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。
第二节基因在大肠杆菌中的高效表达一、大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。
⑵转录终止子使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。
尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。
⑶核糖体结合位点在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择二、常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。
②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG 诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。
④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。
三、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。
1.启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，5’-- TTGACA故称为-35区，)。
当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。
另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。
所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno 首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。
一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S 核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。
3.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。
另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。
四、蛋白质的融合表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的3’末端。
表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。
融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N端的担体蛋白部分从C端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。
方法主要有：化学裂解法和酶解法。
五、蛋白质的分泌型表达将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。
●实现蛋白质分泌表达有许多有利之处：1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。
生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。
2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。
3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。
4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。
因此，对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产。
六、蛋白质的包含体形式表达●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。
2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。
如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。
3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。
不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。
有效、理想的复性方法应具备一下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。
2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。
3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。
4.折叠复性方法利用放大。
5.复性过程耗时较少。
第三节基因在酵母中的表达一、大肠杆菌表达系统的缺陷1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。
2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。
因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。
如酿酒酵母、甲醇酵母等。
二、甲醇酵母表达系统●甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源。
●甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶。
●调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。
（一）甲醇酵母表达系统的优点1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达。
2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。
3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。
4.可高密度发酵培养。
（二）影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素1.目的基因的特性2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.宿主的甲醇利用表型4.分泌信号5.产物稳定性6.翻译后修饰。
